Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras de cristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para la recopilación de datos de cristalografía seriada en fuentes de sincrotrón y láser de electrones libres de rayos X. Este método debería ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural de proteínas de membrana, como el transporte y la transducción de señales a través de la membrana. La principal ventaja de esta técnica es que permite la determinación de estructuras de proteínas de membrana en su entorno lipídico nativo a temperatura ambiente, con un consumo mínimo de muestra y un daño por radiación despreciable.

Las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la fase cúbica lipídica es un material gelatinoso viscoso que resulta difícil de manipular sin herramientas especiales y experiencia previa. Comience este procedimiento con la reconstitución de proteínas de membrana en la Fase Cúbica Lipídica, o LCP, utilizando las jeringas número uno y número dos, como se describe en el protocolo escrito. Una vez formada una LCP transparente y homogénea, transfiera la muestra completa a la Jeringa Número Dos.

Desconecte la jeringa número uno manteniendo el acoplador conectado a la jeringa número dos. Conecte una aguja desmontable a otra jeringa limpia de 100 microlitros, llamada jeringa número tres. Aspire aproximadamente 70 microlitros de la solución precipitante dentro de ella.

Desconecte la aguja de la jeringa número tres manteniendo la esferulita de teflón dentro de la jeringa. Conecte las jeringas número dos y número tres mediante el acoplador, asegurándose de que las esferulitas de teflón estén correctamente colocadas en ambas jeringas. Enrosque cuidadosamente el acoplador hasta que quede bien ajustado.

Oriente las jeringas acopladas verticalmente, con la Jeringa Número Dos en la parte inferior, e inyecte lentamente y de forma constante la muestra de LCP cargada con proteína desde la Jeringa Número Dos hacia la Jeringa Número Tres, hasta que el cordón de LCP toque el émbolo de la Jeringa Número Tres. El volumen de LCP inyectado será aproximadamente 1/10 del volumen inicial de precipitante en la Jeringa Número Tres. Verifique el volumen mediante la lectura de la escala en ambas jeringas.

A continuación, desconecte la Jeringa número dos. El acoplador ahora solo está conectado a la Jeringa número tres, que contiene la muestra inmersa en la solución precipitante. Utilice Parafilm para sellar completamente la Jeringa número tres, incluyendo la interfaz entre el émbolo y la jeringa, el extremo abierto del acoplador y la tuerca de la aguja.

El sellado incompleto durante este paso puede provocar cambios en las condiciones del precipitante y la deshidratación de la muestra. Repita los pasos de inyección de la muestra de LCP cargada con proteína para establecer la cristalización en seis jeringas adicionales, utilizando un volumen total de aproximadamente 50 microlitros de la muestra de LCP. Almacene las jeringas selladas en una bolsa de plástico hermética con uno o dos paños de limpieza libres de fibras previamente empapados con agua para proteger contra la deshidratación de la muestra.

Cierre la bolsa y almacene las jeringas en un incubador a 20 grados Celsius durante el crecimiento de los cristales. Para la detección de cristales, retire las jeringas del incubador y emita las muestras de LCP directamente dentro de las jeringas cada 12 a 24 horas bajo un microscopio estereoscópico con luz cruzada polarizada. Identifique los cristales como partículas brillantes densamente empaquetadas, o, en el caso de cristales más pequeños, como un brillo uniforme del filamento de LCP.

Devuelva las jeringas selladas a la bolsa y almacénelas a 20 grados Celsius para su uso futuro. El paso de titulación de lípidos es necesario para absorber la solución excesiva de precipitante y para prevenir la congelación de los lípidos al inyectarlos en el haz de láser de electrones libres de rayos X. Aproximadamente una hora antes del inicio de la recopilación de datos, retire las jeringas con las muestras del incubador a 20 grados Celsius.

Seleccione de dos a cuatro jeringas para la consolidación de muestras según un aspecto cristalino similar y semejanza en las condiciones de cristalización. Retire cuidadosamente el sellado de Parafilm de las jeringas seleccionadas. Retire el acoplador de la jeringa y conecte una aguja desmontable limpia a la primera jeringa seleccionada.

Empuje suavemente y lentamente el émbolo hacia adelante para expulsar el precipitante a través de la aguja dentro de un tubo de microcentrifuga. Tenga precaución en este paso; ya que aplicar una presión elevada sobre el émbolo puede eyectar parte del LCP cargado de cristales junto con la solución de precipitante, lo que podría provocar una pérdida parcial o total de la muestra. Detenga el émbolo cuando se haya eliminado la mayor parte del precipitante y el LCP se haya acumulado en la entrada de la aguja.

Realice este procedimiento con las demás jeringas seleccionadas. Para consolidar las muestras de LCP resultantes, conecte dos jeringas mediante un acoplador limpio. Presione el émbolo de una jeringa para transferir toda la muestra de una jeringa a la otra.

Desconecte la jeringa vacía. Repita este paso para consolidar todo el material LCP cargado de cristales en una sola jeringa. Retire tanto precipitante como sea posible.

Agregue aproximadamente cinco microlitros de 7.9 MAG o del lípido huésped MAG de cadena más corta original a una jeringa vacía. Conecte esta jeringa a la jeringa con la muestra consolidada mediante un acoplador para jeringas y mezcle alternando la presión sobre los émbolos de las jeringas. Repita el proceso hasta que se haya absorbido toda la solución residual y se forme un LCP homogéneo y transparente.

Transfiera toda la muestra de LCP mezclada a una jeringa y desconecte la jeringa vacía. Fije una aguja de carga para inyector de LCP a la jeringa que contiene la muestra consolidada. Exprese cuidadosamente aproximadamente un microlitro de la muestra de LCP sobre un portaobjetos de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos de vidrio.

Presione suavemente sobre la cubreobjetivo para montar la muestra. Tome imágenes de la muestra de LCP bajo un microscopio estereoscópico con el mayor aumento posible, utilizando iluminación de campo claro y polarizadores cruzados. Si es posible, tome imágenes adicionales utilizando un microscopio y un equipo de fluorescencia UV para confirmar la presencia de microcristales de proteína en la muestra.

Estime el tamaño y la densidad de los cristales. La densidad ideal de cristales para un experimento de recolección de datos dependerá del tamaño de los cristales, del diámetro del haz de rayos X y del diámetro del flujo de LCP, y debe dar como resultado una tasa de impacto de cristales del 10 al 40 %. Finalmente, cargue el inyector de LCP y realice la cristalografía seriada de femtosegundo con LCP, o la recolección de datos de LCP SFX, tal como se describe en el protocolo del texto. Aquí se muestran microcristales del receptor de serotonina en complejo con ergotamina, capturados mediante un microscopio en modo de campo brillante y mediante un microscopio en modo de luz polarizada cruzada.

La estructura del complejo entre el receptor de serotonina y ergotamina se obtuvo mediante el enfoque LCP SFX. Aquí se muestran microcristales del receptor smoothant en complejo con ciclopamina, que fueron observados utilizando un modo de microscopio con polarización cruzada. La estructura del complejo entre el receptor y la ciclopamina se obtuvo mediante el enfoque LCP SFX.

Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en menos de dos horas si se lleva a cabo correctamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura de las proteínas integrales de membrana, con ligeras modificaciones, también puede aplicarse a otras proteínas. La implicación de esta técnica se extiende hacia el descubrimiento de fármacos; porque estructuras de alta resolución proporcionan plantillas excelentes para las interacciones estándar entre proteínas lignanas y ayudan en el diseño de fármacos más eficientes.