Name: Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a preparar microcristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para cristalografía serial con láseres de electrones libres de rayos X. Este método reduce el consumo de muestra y minimiza el daño por radiación.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 GM108635 y U54 GM094618, Premio de la Clínica Mayo-ASU colaboración de SEED Grant y NSF STC premio 1231306. Agradecemos a A. Walker para obtener ayuda con la preparación de manuscritos.

1. Las soluciones de filtrado y Lípidos Nota: Todos los reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo debe ser lo más limpia posible para evitar la introducción de partículas contaminantes en las muestras, que pueden obstruir el inyector LCP. <ol><li> Filtrar todas las soluciones precipitantes y lípidos fundido a través de filtros spin-down 5 micras. jeringas limpias a fondo y se aplican aire comprimido para secar. Opcionalmente, usar una capucha de sala limpia portátil para evitar atrapar partículas de polvo o fibras durante los procedimientos de preparación de muestras. </li></ol> 2. La reconstitución de MP en el LCP Nota: La elección de la mejor lípidos anfitrión LCP para la cristalización depende del destino MP, y por lo general se identifica durante los ensayos de cribado de cristalización de lípidos de acogida 14. Monoacilgliceroles (MAGs) representan la clase más común de los lípidos utilizados para la cristalización LCP 15. Los protocolos se basan en el uso de 9,9 MAG (monooleına) como elsede de lípidos, ya que este es el más exitoso de los lípidos en el meso cristalización hasta la fecha 16. 9.9 MAG puede ser sustituido por otros lípidos de acogida LCP o mezclas de lípidos después de tener en cuenta las diferencias en su comportamiento de fase. Por ejemplo, en el caso de los GPCRs, monooleína típicamente se dopa con el colesterol para la estabilización receptor. Aquí, utilizar 9: 1 (w / w) 9,9 MAG: mezcla de colesterol como lípido host. <ol><li> Mix objetivo MP, que se purifica en una solución de detergente de micelas, con el lípido anfitrión LCP apropiado utilizando dos jeringas (# 1 y # 2) y un acoplador, como se describió anteriormente 13. </li><li> En pocas palabras, la carga de la jeringa # 1 con el lípido fundido y la jeringa # 2 con la solución MP. Utilice una relación entre los lípidos y la solución MP acuosa correspondiente al nivel que es justo por debajo de la capacidad de hidratación máxima de la correspondiente lípidos anfitrión LCP, por ejemplo, 3: / v de lípidos solución / MP para 9,9 MAG, 2 v 1: v / 1 v solución / MP de lípidos para la mayoría de otros MAG de cadena más corta (7,9 MAG, 9,7 MAG, etc.). </li><li> Conectar las jeringas a través de un acoplador de jeringa y empezar a mezclar las sustancias presionando los émbolos para mover la mezcla hacia atrás y adelante entre las jeringas, hasta que la muestra se vuelve homogénea y transparente. Preparar aproximadamente 50 l de la muestra LCP para la recogida de un conjunto completo de datos de LCP-SFX. El volumen final de la muestra por lo general se incrementará en aproximadamente un factor de dos (a ~ 100 l) después de la consolidación de la muestra y la valoración de los lípidos (Sección 5). </li></ol> 3. Configuración de la cristalización en jeringas <ol><li> Después se forma un LCP transparente y homogénea, mover toda la muestra en la jeringa # 2. Separar jeringa # 1, mientras se mantiene el acoplador conectado a la jeringa # 2. </li><li> Conectar una aguja extraíble (26s calibre) para otros 100 l jeringa limpia (jeringa # 3) y aspirado aproximadamente 70 l de la solución precipitante en ella. La composición de la solución precipitante que desencadena formación de microcristales de alta densidad es único para cada objetivo MP y debe ser determinado antes de continuar con estos protocolos. Aquí, utilizar una composición de la solución precipitante optimizado que produce una lluvia de microcristales del receptor A2A (tiocianato de sodio 40 mM, 100 mM de citrato de sodio pH 5, 26 a 28% PEG400). </li><li> Desconectar la aguja de la jeringa # 3 mientras se mantiene el casquillo de teflón dentro de la jeringa. </li><li> Conectar jeringas # 2 y # 3 a través del acoplador, asegurándose de que los casquillos de teflón estén en su sitio en ambas jeringas. Enroscar cuidadosamente el acoplador firmemente en su posición. </li><li> Orientar las jeringas acopladas verticalmente con jeringa # 2 en la parte inferior e inyectar la muestra LCP proteína cargada de jeringa # 2 # 3 en la jeringa lentamente y de manera constante hasta que la cuerda LCP toca el émbolo de la jeringa # 3. El volumen inyectado LCP ascenderá a aproximadamente 1/10 del volumen inicial de precipitación en la jeringa # 3 (~ 7 l). Verificar el volumen de la escala de lectura en ambos syringes (ambos émbolos deben moverse alrededor de un 7 l). </li><li> Desconectar la jeringa # 2. El acoplador ahora solamente está conectada a la jeringa # 3 que contiene la muestra sumergida en la solución precipitante. </li><li> Use Parafilm para sellar completamente la jeringa # 3, incluyendo la interfaz de émbolo de jeringa, el extremo de apertura del acoplador y la tuerca de la aguja. Cierre incompleto durante este paso puede hacer que las condiciones precipitantes para cambiar la muestra y para deshidratar. </li><li> Repita los pasos 3.3-3.7 para establecer la cristalización en 6 jeringas adicionales (# 4- # 9) que utiliza un total de ~ 50 l de la muestra LCP (~ 7 l de LCP por cada jeringa). </li><li> Almacenar sellada jeringas en una bolsa de plástico con cierre con uno o dos tejidos de limpieza libres de fibra pre-empapados con agua para proteger contra la deshidratación de la muestra. Sellar las jeringas bolsa y almacenar en una incubadora a 20 ° durante el crecimiento de los cristales. </li></ol> 4. Detección Crystal <ol><li> Retire las jeringas de la incubadora a la imagen de LCP muestras directamente dentro de las jeringas (# 3- # 9) cada 12-24 horas bajo un microscopio estereoscópico con luz polarizada cruzada. Identificar los cristales como partículas brillantes apretados o, en el caso del tamaño de cristal más pequeño como un brillo uniforme desde el filamento LCP. </li><li> Devolver las jeringas sellados a la bolsa, y almacenar a 20 ° C para su uso futuro. </li></ol> 5. Consolidación de la muestra y valoración con 7,9 MAG Nota: El paso de titulación de lípidos aquí descrito sirve para dos propósitos: a) para absorber el exceso de la solución precipitante y b) para prevenir la congelación de lípidos tras la inyección en el haz XFEL. Cuando una muestra de LCP compuesto de 9,9 MAG se inyecta en una cámara de vacío para la recogida de datos, la evaporación intensiva puede enfriar la muestra a temperaturas por debajo de la temperatura de transición de fases en equilibrio (~ 18 ° C), la conversión de las partes de la muestra en una fase cristalina lamelar (Lc). Estos parches de fase Lc, cuando es golpeado por el haz, producen un calor intenso en polvo diffranillos de acción que pueden dañar un detector sensible a 6, como el detector de matriz de píxeles de Cornell-SLAC (CSPAD). La titulación de 9,9 muestra MAG con un lípido de cadena más corta (9,7 MAG o 7,9 MAG) alivia este problema, ya que tales mezclas tienen temperaturas de transición de fase más bajos. A continuación, describimos la titulación de un compuesto de LCP 9.9 MAG MAG con un 7,9. Cuando se utilizan MAGs de cadena más corta (9,7 MAG, 7,9 MAG, etc.) para la cristalización o cuando los datos de cristalografía de serie se recogen a presión ambiente todavía se requiere la titulación en la etapa 5.11, pero se puede realizar utilizando el lípido anfitrión LCP original, empleado para cristalización. <ol><li> Acerca de 1 hr antes del comienzo de la recogida de datos, retirar las jeringas con las muestras de la 20 ° C incubadora. </li><li> Seleccione 2-4 jeringas para la consolidación de la muestra sobre la base de una apariencia cristalina similar y similitud de las condiciones de cristalización. </li><li> Retirar con cuidado el Parafilm sellado de las jeringas seleccionados. </li><li> retirarel acoplador de jeringa y conecte una aguja extraíble limpia (26s calibre) a la primera jeringa seleccionada. Suave y lentamente empujar el émbolo hacia adelante para apretar el precipitante a cabo a través de la aguja en un tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado en este paso porque la aplicación de una alta presión sobre el émbolo en este paso podría expulsar algunos de los LCP cargado de cristal junto con la solución precipitante, que conduce a una pérdida parcial o completa de la muestra. </li><li> Detener el émbolo cuando la mayor parte del precipitante se ha eliminado y el LCP se ha acumulado en la entrada de la aguja. </li><li> Repita el paso 5.4 a 5.5 con las otras jeringas seleccionados. </li><li> Para consolidar las muestras resultantes LCP, conectar dos jeringas juntos a través de un acoplador limpia. </li><li> Presionar el émbolo en una jeringa para transferir toda la muestra de una de las jeringas a otro. </li><li> Desconectar la jeringa vacía. </li><li> Repetir los pasos 5.7 a 5.9 para consolidar todo el material de LCP cargado de cristal de dos a cuatro preSelectos jeringas en una jeringa. Eliminar la mayor cantidad posible de precipitación. </li><li> Añadir ~ 5 l de 7,9 MAG o la cadena más corta de lípidos de acogida MAG original a una jeringa vacía. Conectar esta jeringa a la jeringa con la muestra consolidada a través de un acoplador de jeringa y mezclar presionando alternativamente émbolos de la jeringa. Repetir hasta que toda la solución residual se absorbe y se forma un LCP homogénea y transparente. La cantidad final de LCP después de la valoración puede variar de 20 a 35 l en función del volumen del exceso de precipitante y su composición. </li><li> Mover toda la muestra LCP mezclado en una jeringa y desconecte la jeringa vacía. </li></ol> 6. Caracterización de microcristales <ol><li> Coloque una aguja de LCP-inyector de carga (tipo de los puntos 3, de calibre 22, una pulgada de largo) a la jeringa con la muestra consolidada. </li><li> extraiga cuidadosamente ~ 1 l de la muestra de LCP sobre un portaobjetos de vidrio y se cubre con una cubierta de vidrio deslizante. Presione suavemente sobre lahoja de cubierta para intercalar la muestra. </li><li> Tomar imágenes de la muestra LCP bajo un microscopio estereoscópico con el máximo aumento posible (normalmente 100X), utilizando una iluminación de campo brillante y polarizadores cruzados. Si es posible, tomar imágenes adicionales usando un microscopio de fluorescencia UV y un SONICC (segunda orden no lineal de imágenes de cristales quirales) 17 generador de imágenes para confirmar la existencia de microcristales de proteína en la muestra. </li><li> Estimar el tamaño del cristal y de la densidad 10. La densidad cristalina ideal para un experimento de recogida de datos dependerá de la tamaño de cristal, el diámetro del haz de rayos X y el diámetro de la corriente de LCP, y debería resultar en una tasa de éxito de cristal de aproximadamente 10 a 40%. </li></ol> 7. Ajuste de cristal Densidad Nota: Si la densidad cristalina encontró en el paso 6.4 es demasiado alto, lo que resulta en un gran porcentaje de golpes múltiples de cristal, los cristales se deben diluir siguiendo los pasos descritos a continuación para optimizar lamuestra para la recolección de datos. Si la densidad del cristal es demasiado baja para la recopilación de datos eficiente en todas las muestras preparadas, a continuación, las condiciones de crecimiento de cristales se deben volver a optimizar, ya que no existe un método confiable para la concentración de cristales de MP en LCP. <ol><li> Preparar la cantidad necesaria de LCP ordenada para ser utilizado para la dilución mediante la imitación de la composición de LCP (la misma de lípidos y precipitación) de la muestra original con cristales que necesita ser diluida. </li><li> Mover todo LCP ordenada en una jeringa. Separar jeringa vacía pero dejar el acoplador conectado. </li><li> Retire la aguja de la jeringa que contiene la muestra LCP con microcristales. Conectar la jeringa de la muestra a la jeringa que contiene LCP ordenada a través del acoplador. </li><li> Mezclar el contenido de las jeringas empujándolo hacia atrás y adelante a través del acoplador hasta que se alcanza la homogeneidad. </li><li> Repita la Sección 6 para volver a evaluar la densidad de microcristales en la muestra ajustada. </li></ol> 8. Inyector LCP Cargando unand LCP-SFX Recolección de Datos <ol><li> Desconectar el acoplador de la jeringa con la muestra y conecte una aguja 1 &quot;de carga a la jeringa. </li><li> Transferencia de 20 a 40 l de la muestra en el depósito de un inyector LCP. </li><li> Inserte el inyector LCP en la cámara de muestra de 18, iniciar el inyector, ajustar la velocidad de flujo y recopilar datos LCP-SFX. </li></ol> 9. Incorporación de cristales de proteína soluble en LCP Nota: El uso de medios altamente viscosos, tales como LCP, para la entrega de los cristales de proteínas solubles le permite a uno para disminuir drásticamente el consumo de proteínas en un experimento de cristalografía de serie. En estos pasos se describe cómo incorporar cristales de proteínas solubles en LCP. Los cristales se pueden obtener por cualquier técnica, consolidado juntos en la forma de una suspensión de cristales y se filtra si es necesario. <ol><li> Ajustar la densidad de cristales en la suspensión para asegurar tasas de cristal de golpe de aproximadamente 10-40%. </li><li> Test la compatibilidad de la solución precipitante con LCP utilizando 7,9 MAG, 9,7 MAG o una mezcla 1: 1 de 7,9 MAG y 9,9 MAG como lípido host. </li><li> Mezclar ~ 25 l de la suspensión de cristales con ~ 25 l de la lípido anfitrión usando un mezclador de la jeringa hasta que se forma un LCP homogéneos. </li><li> Evaluar el tamaño del cristal y la densidad como se describe en la Sección 6. Cargar la muestra en el inyector de LCP y recoger datos como se describe en la Sección 8. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Los protocolos descritos aquí proporcionan un esquema general del procedimiento de preparación de la muestra para un experimento estándar LCP-SFX con un inyector LCP. Basándonos en nuestra experiencia, el importe total de la muestra LCP microcristales cargado final requerido para la recogida de un conjunto de datos completo es típicamente 50-100 l (Tabla 1; 25-50 l de muestra inicial LCP proteína cargada), dependiendo del tamaño de los microcristales , la calidad y densidad. Dado que cada 100 l jeringa de vidrio hermético al gas puede acomodar sobre 7 l de LCP en la forma de una cadena totalmente extendida para garantizar la adecuada e incluso la difusión de la solución precipitante en el LCP, al menos cuatro a siete muestras en jeringas deben estar preparados para cada experimento LCP-SFX. Dado que la muestra se extruye a través de un estrecho 20-50 micras de diámetro capilar, es crucial para evitar cualquier material de partículas extrañas en la muestra. Los polvos y fibras que podrían ser introducidos en ocasiones en el LCPsoluciones de muestra o precipitante puede obstruir el inyector capilar y aumentar el tiempo de inactividad durante el experimento. Por lo tanto, es importante para filtrar el lípido y todas las soluciones a través de un filtro de poro 5 micras antes de preparar las muestras. Opcionalmente, una habitación limpia o un portátil campana sala limpia se pueden utilizar para la preparación de muestras. Estos protocolos se basan en el uso de 9,9 MAG (monooleına) como el anfitrión de lípidos MP cristalización. Ellos, sin embargo, no se limitan a 9,9 MAG y se pueden adaptar fácilmente a cualquier otros lípidos de acogida LCP o mezclas de lípidos después de tener en cuenta las diferencias en el comportamiento de fase de los lípidos. La mayor parte de las estructuras de los parlamentarios cristalizadas en LCP se obtuvieron utilizando una de las revistas, con 9,9 MAG ser el representante de mayor éxito hasta la fecha 15. El principal inconveniente de la utilización de 9,9 MAG para SFX es su transición a la fase cristalina lamelar al enfriar por debajo de 18 ° C, que a menudo se produce cuando la adquisición de datos se realiza en vacío. el titraticon 7,9 MAG se describe en la Sección 5 de este protocolo proporciona una buena solución a este problema. En nuestra experiencia, los cristales de soportar una valoración de este tipo sin ningún efecto adverso. Si, sin embargo, la adición de 7,9 MAG u otro MAG de cadena corta no es deseable, la valoración se puede realizar con 9,9 MAG. En este caso, el gas que estabiliza el flujo de LCP durante la inyección en el vacío debe ser conmutado de helio a nitrógeno, que puede prevenir la formación de una fase lipídica cristalina en la mayoría de las muestras, a expensas de tener un flujo de la muestra menos estable. La consistencia similar a gel de LCP tiene una gran ventaja para su uso como un medio de soporte de cristal, ya que permite el ajuste de la velocidad de flujo de cristal a través de una amplia gama, adecuada para la recogida de datos de cristalografía de serie en modernas fuentes XFEL y sincrotrón. Adaptación de la velocidad de flujo de cristal con el pulso XFEL resultados de la tasa de repetición en la reducción dramática en el consumo de cristal en varios órdenes de magnitud compared a la inyección de líquido. LCP es un medio portador adecuado para la entrega no sólo de cristales MP cultivadas en ella, sino también para cristales de proteínas solubles de 21. Varios medios de transporte de cristal viscosos alternativos Recientemente se han introducido 22 - 24, que se extiende el arsenal de herramientas y reactivos para la realización de experimentos de cristalografía de serie. Por otra parte, la cristalografía de serie con LCP como un medio de entrega de cristal se ha demostrado en fuentes de sincrotrón convencionales, al menos por cristales bien de difracción 24,25. Las futuras actualizaciones de fuentes de sincrotrón que aumentan la intensidad de los rayos X en órdenes de magnitud, así como mejoras en la tecnología de detectores, harán que la cristalografía de serie un método aún más accesible y atractiva para la determinación de la estructura. LCP-SFX ha demostrado su potencia durante MP determinación estructural. Para los sistemas biológicos difíciles (como GPCRs o complejos macromoleculares) donde Large, cristales de calidad de difracción son difíciles de cultivar, LCP-SFX puede proporcionar un atractivo, si no es la única opción viable para resolver una estructura de resolución atómica. Con todas sus ventajas, es decir, utilizando LCP como la matriz para MP cristalización y la entrega de cristal, bajo consumo de proteína, la ausencia de daño por radiación, sala de recogida de datos de temperatura, posibilidades de estudios de tiempo-resuelto 26,27 y ningún requisito cosecha cristal, LCP- SFX debe desempeñar un papel importante en el futuro de la biología estructural.

La cristalografía de rayos X es la técnica más exitosa hasta la fecha para resolver estructuras de resolución atómica de las proteínas de membrana (MP). La cristalización en mesofases lipídicos, también conocidas como fase cúbica lipídica (LCP), o en la cristalización meso, representa una de las principales novedades en la cristalografía MP que ha permitido la determinación de la estructura de alta resolución de objetivos desafiantes, tales como los receptores acoplados a proteínas G (GPCR ) 1. Los recientes avances en las herramientas y tecnologías LCP han hecho de esta técnica a disposición de una gran comunidad de biólogos estructurales de todo el mundo 2. Sin embargo, en muchos casos los cristales de MP que se forman en LCP son demasiado pequeños para ser utilizado incluso a más avanzada líneas de luz de sincrotrón microfoco, donde las muestras sufren de grave daño de la radiación y el deterioro antes de señal suficiente en alta resolución se puede obtener 3. Un nuevo enfoque para la recopilación de datos cristalográficafue habilitado con la puesta en marcha del láser de electrones libres primero de rayos X (XFEL). El método se basa en el principio de &quot;difracción antes de la destrucción&quot;, introducido por primera vez en teoría, 4 y luego confirmado experimentalmente en muestras biológicas en el acelerador lineal fuente de luz coherente (LCLS) 3, pionero en el mundo en XFELs duros. Un XFEL genera alto brillo pulsos de rayos X dentro de pocas decenas de duración de femtosegundo que difractan de un cristal de prístina antes de que los átomos de la proteína se pueden mover en respuesta al daño por radiación. En los experimentos iniciales, microcristales fueron suministrados de forma continua a la intersección con el haz de XFEL en una corriente acuosa producido por un inyector de líquido 5. Esta configuración experimental se conoce como la cristalografía de femtosegundo en serie (SFX). El principal inconveniente de utilizar inyectores de líquidos para SFX es su alta velocidad de flujo, que por lo tanto requiere de decenas a cientos de miligramos de proteína purificada para la recogida de un conjunto completo de datos. por employing un inyector especial que puede manejar las muestras LCP de tipo gel (LCP microextrusión inyector) 6, hemos entregado con éxito microcristales de varios diferentes GPCR humanas cultivadas en una matriz LCP y obtuvo sus estructuras de alta resolución 6 - 9, con una proteína reducida significativamente consumo bajo de 0,3 mg por conjunto de datos. El inyector consiste en un depósito que puede contener hasta 20, 40 ó 100 l de LCP cristal cargado y un capilar estrecho (10-50 micras de diámetro) a través del cual la muestra se extruye mediante la aplicación de una alta presión (hasta 10.000 psi) de un émbolo hidráulico con una etapa de amplificación de presión, accionado por un líquido de una bomba de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento). La corriente de LCP sale de la boquilla capilar se estabiliza mediante un flujo paralelo de gas no reactivo (normalmente helio o nitrógeno). Aquí nos proporcionan demostraciones visuales de los pasos necesarios para preparar y caracterizar muestraspara un experimento LCP-SFX. Detalles adicionales se pueden encontrar en los protocolos publicados 10. A modo de ejemplo, vamos a utilizar receptor de adenosina A 2A 11 y preparar cristales de esta proteína en el LCP para la recogida de datos de rayos X utilizando el enfoque SFX. Mientras que nuestros protocolos son compatibles con cualquier inyector capaz de streaming de LCP para la recopilación de datos mediante cristalografía de serie en las fuentes de sincrotrón XFEL y, para fines de ilustración, vamos a utilizar el inyector LCP se describe en Ref. 6. condiciones precipitantes optimizados que producen microcristales de alta densidad en LCP deben ser identificados mediante la cristalización de alto rendimiento de cribado de 12,13 antes de proceder a este protocolo. Un diagrama de flujo típico para este protocolo se muestra en la Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Pípido del huésped LCP monooleína (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Lípido huésped para la proteína que se va a cristalizar</td></tr><tr><td>Pílido del huésped LCP monooleína (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>Lipido anfitrión para que la proteína se cristalice</td></tr><tr><td>Lípido del huésped LCP monopalmitoleína (9.7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Lípido huésped para la proteína que se va a cristalizar</td></tr><tr><td>Lípido del huésped LCP 7.9 MAG</td><td>Lípidos polares Avanti 850534 Lípidos</td><td></td><td>hospedadores para la tiración para evitar la formación de fases cristalinas laminares (Lc) durante la inyección de la muestra</td></tr><tr><td>Solución proteica purificada concentrada a 20-50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Proteína objetivo</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Utilizado para disolver lípidos</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Utilizado para lavar jeringas</td></tr><tr><td>Eleven 100 &#956; l Jeringas herméticas al gas Hamilton sin agujas</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>para la preparación de LCP</td></tr><tr><td>Ocho acopladores de jeringa</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>para la preparación</td></tr><tr><td>de LCP Aguja de carga del inyector LCP</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 punto estilo 3, longitud 1 pulgada</td><td>Para la dispensación de LCP y la carga</td></tr><tr>del inyector<td>Aguja extraíble</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Para eliminar la solución precipitante</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Se utiliza para el sellado de jeringas Pañuelos</td></tr><tr><td>de limpieza de lentes sin pelusa</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de filtro centrífugo, Ultrafree-MC, 0,5 ml, Durapore 5 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Se utiliza para filtrar soluciones precipitantes y lípidos Portaobjetos de</td></tr><tr><td>microscopio, 1 pulgada x 3 pulgadas&nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Dos botellas de lavado con puntas finas. Uno lleno de agua mili-Q o destilada, el otro con metanol</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>Estos se utilizan para limpiar las jeringas, las agujas y el acoplador. Primero se utiliza el metanol y luego el agua.</td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Para secar jeringas, agujas, férulas y acopladores Gafas de</td></tr><tr><td>seguridad Latas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de aire a presión</td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>Para la limpieza de jeringas</td></tr><tr><td>Calentador de bloque seco con controlador de temperatura digital</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>Se utiliza para descongelar lípidos</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Soluciones de centrifugado</td></tr><tr><td>Clean Room Mini - Campana de presión positiva portátil de 12 pulgadas con filtro HEPA</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Limpieza de la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con zoom equipado con un polarizador lineal y un analizador giratorio&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td> Microscopio UV <td>de control de densidad de cristal</td></tr><tr><td></td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>Opcional, para fines de imagen de cristal</td></tr><tr><td>Generador de imágenes SHG</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>Opcional, para fines de imagen de cristal</td></tr></tbody></table>

preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo cristalografía

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Las proteínas de membrana (MPs) son componentes esenciales de las membranas celulares y dianas farmacológicas primarias. diseño racional de fármacos se basa en la información estructural precisa, por lo general obtenido mediante cristalografía; Sin embargo parlamentarios son difíciles de cristalizar. Los recientes progresos en la determinación estructural MP ha beneficiado en gran medida del desarrollo de métodos lipídicas fase cúbica (LCP) de cristalización, que normalmente producen bien de difracción, pero a menudo cristales pequeños que sufren de daño por radiación durante la recogida de datos cristalográfica tradicional en las fuentes de sincrotrón. El desarrollo de láser de electrones libres nueva generación de rayos X (XFEL) las fuentes que producen pulsos de femtosegundos extremadamente brillantes ha permitido sala de recogida de datos de temperatura de microcristales con nula o insignificante daño por radiación. Nuestros esfuerzos recientes en la tecnología de la combinación de LCP con la cristalografía de femtosegundo en serie (LCP-SFX) han dado lugar a estructuras de alta resolución de varios receptores acoplados a proteínas G humanos, which representar un objetivo muy difíciles para la determinación estructural. En la técnica de LCP-SFX, LCP es reclutado como una matriz para el crecimiento y la entrega de microcristales MP a la intersección de la corriente de inyector con un haz de XFEL para la recopilación de datos cristalográfica. Se ha demostrado que LCP-SFX puede mejorar sustancialmente la resolución de difracción cuando sólo sub-10 micras cristales están disponibles, o cuando el uso de cristales más pequeños a temperatura ambiente puede superar los diversos problemas asociados con cristales cryocooled más grandes, tales como la acumulación de defectos, mosaicidad alta y artefactos crioenfriamiento. futuros avances en las fuentes de rayos X y tecnología de detectores deben hacer la cristalografía de serie muy atractiva y viable para la aplicación no sólo en XFELs, sino también en líneas de luz de sincrotrón más accesibles. Aquí presentamos los protocolos visuales detalladas para la preparación, caracterización y entrega de microcristales en el LCP para los experimentos de cristalografía de serie.Estos protocolos incluyen métodos para realizar experimentos de cristalización en jeringas, detección y caracterización de las muestras de cristal, la optimización de densidad cristalina, cargando microcristales LCP cargado en el dispositivo inyector y la entrega de la muestra a la viga para la recogida de datos.

A continuación se describen los resultados representativos obtenidos con muestras preparadas siguiendo los protocolos anteriores, lo que nos permitió recoger datos SFX y resolver las estructuras de alta resolución de cinco GPCR humanos: receptor de la serotonina 5-HT 2B en complejo con un ergotamina agonista 8 (AP ID 4NC3 ), receptor de smoothened (SMO) en el complejo con un ciclopamina antagonista 6 (AP ID 4O9R), el receptor δ-opioide en el complejo con un bi-funcional ligando peptídico DIPP-NH 2 7 (AP ID 4RWD), receptor de la angiotensina en el complejo con una bloqueador de ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), y un complejo entre la rodopsina y arrestina 19 (PDB ID 4ZWJ); y dos pruebas proteínas solubles: lisozima (AP ID 4ZIX) y ficocianina (AP ID 4ZIZ). 5-HT 2B media en varias funciones fisiológicas centrales y periféricos de la serotonina, un neurotransmisor. Este receptorse utilizó para establecer y validar el método de LCP-SFX, mediante la comparación de la estructura de la temperatura ambiente obtenida en LCLS con la estructura cryocooled resuelto por microcrystallography tradicional en el Photon Source avanzada (APS). Se preparó un total de ~ 100 l de muestra LCP con microcristales de proteínas (tamaño medio de aproximadamente 5 micras) y se utiliza para la recolección de datos SFX, y la estructura LCP-SFX de 5HT 2B se resolvió con éxito en el 2,8 Å (Figura 2) 8. Detalles adicionales útiles en la preparación de muestras y recogida de datos se proporcionan en la Tabla 1. receptor Smoothened (SMO) es un miembro de la clase F GPCRs y el objetivo molecular de la ciclopamina teratógeno, con funciones bien demostrada en el desarrollo embrionario y el crecimiento tumoral. Inicialmente, se obtuvieron cristales relativamente grandes de SMO / ciclopamina con un tamaño medio de 120 × 10 × 5 micras y luego utilizados para collecti datosen a una fuente de sincrotrón utilizando cristalografía convencional a base de goniómetro. Sin embargo, estos grandes cristales producidos pobre de difracción en una línea de luz micro-enfoque (10 micras de diámetro) que sufren de gran mosaicidad (por encima de 2-3 grados), probablemente debido a la acumulación de defectos de crecimiento de cristal, o de los efectos relacionados con crioenfriamiento. LCP-SFX, sin embargo, nos permitió recoger los datos de difracción de calidad a partir de 5 LCLS cristales micras de tamaño a temperatura ambiente. La estructura se resolvió por reemplazo molecular a una anisotrópico 3.4, 3.2 y 4.0 Å de resolución a lo largo de los tres ejes principales, identificar claramente la ubicación de ciclopamina en la unión de bolsillo 6 (Figura 3). alcaloides opiáceos, como la morfina, dirigidos a un receptor opioide μ-(μ-O) son ampliamente utilizados para el manejo del dolor severo. Sin embargo, su uso extenso conduce a la tolerancia adquirida y la adicción. La coadministración de morfinascon antagonistas del receptor δ-opioide (δ-OR) se ha demostrado para prevenir los efectos secundarios antes mencionados, promoviendo así la búsqueda de compuestos con una función de δ-O-antagonista y μ-OR-agonista mixto. Se obtuvieron los datos de difracción iniciales en δ-OR en un complejo con un péptido tetra-bi-funcional DIPP-NH 2 usando cristales cryocooled que difractados a 3,3 Å a una fuente de rayos X de sincrotrón empleando estrategia de recolección de datos basados ​​en goniómetro convencional. Estos datos revelaron una densidad de electrones parcialmente ambigua para el ligando de péptido. Posteriormente, se obtuvieron datos de difracción XFEL a temperatura ambiente y se determinó la estructura en el 2,7 Å de resolución que muestra una densidad clara para el ligando y el receptor 7. Esta estructura ofrece una oportunidad para conocer otras funciones del receptor opioide comprensión y la selectividad y proporciona información valiosa para el desarrollo de nuevos analgésicos. 1 R) es un GPCR que actúa como un regulador primario de la presión arterial. Nos cristalizó a 1 R en el complejo con un antagonista de ZD7155 en LCP. Cristales optimizados alcanzaron un tamaño máximo de 40 x 4 x 4 m 3 con la mejor de difracción alcanzando sólo ~ 4 A a una fuente de sincrotrón. Al cambiar las condiciones de cristalización, se obtuvo una lluvia de cristales más pequeños (10 x 2 x 2 m 3), que se utilizaron para obtener la estructura temperatura ambiente a 2,9 Å de resolución, utilizando la radiación XFEL. Se recogieron un total de 2,764,739 imágenes del detector para hacer un conjunto completo de datos de alrededor de 65 l de LCP cristal cargado correspondientes a alrededor de 0,29 mg de proteína 9. Del número total de tramas, 457.275 fueron identificados como éxitos de cristal, que corresponde a una tasa de éxito del 17%, de los cuales 73,130 marcos (16% de aciertos) fueron indexados con éxito e integrados. GRAMOPCR señal a través de dos vías principales mediadas por proteínas o arrestinas G. La estructura de la β 2-adrenérgico receptor unido a la proteína A G heterotrimeric s se resolvió hace unos años 20, mientras que la estructura de un GPCR en complejo con arrestina había permanecido difícil de alcanzar. Se obtuvieron pequeños cristales de una proteína de fusión de la rodopsina-arrestina en LCP que alcanza 25-30 m en la dimensión más larga, pero a pesar de una amplia optimización, difractada sólo para ~ 7 Å de resolución en las fuentes de sincrotrón. Al utilizar el método de LCP-SFX, dentro de las 12 horas de tiempo de haz XFEL, se recogieron 22.262 accesos de cristal, de los cuales 18.874 se indicaron y patrones integrados para anisotrópico límites de resolución de 3,8 Å / 3.8 A / 3.3 a 19 con éxito. Rodopsina-arrestina es un complejo de proteínas muy difícil que resistió determinación de la estructura utilizando los enfoques tradicionales. La determinación exitosa de esta estructura ha demostrado el enorme potencial deel método LCP-SFX para hacer frente a problemas difíciles y proporcionó una oportunidad única para examinar el mecanismo de señalización arrestina-sesgada de los GPCR. Por último, además de la membrana cristales de proteínas cultivadas en la fase lipídica, nuestra preparación de la muestra y método de entrega se adaptó con éxito para cristales de proteínas solubles, donde se usa LCP como un medio de soporte para la entrega de los cristales, lo que nos permite reducir drásticamente el consumo de proteínas requerido para la determinación de la estructura. Estructuras de dos proteínas modelo, la lisozima y la ficocianina, se resolvieron a 1,89 Å y 1,75 Å de resolución, respectivamente, por este método, el uso de menos de 0,1 mg de cada proteína 21. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> La serotonina receptor 2B </td><td> receptor de alisado </td><td><strong&gt; Δ-receptor opioide </td><td> Receptor de angiotensina II tipo 1 </td><td> Rodopsina-Arrestin </td><td> La lisozima </td><td> ficocianina </td></tr><tr><td> AP ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> muestra utilizada total *, l </td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> sesenta y cinco </td><td> 75 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> La proteína total usado, g </td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> El tamaño medio de cristal, micras </td><td> 5 x 5 x 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 x 2 x 2 </td><td> 10 x 2 x 2 </td><td> 5-10 </td><td> 5 x 2 x 2 </td><td> 10 x 10 x 5 </td></tr><tr><td> Tasa de golpes,% </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0.45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> El tiempo total de recolección de datos, hr </td><td> 10 </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0.75 </td><td> 0.67 </td></tr><tr><td> Número de patrones indexadas </td><td> 32819 </td><td> 61.964 </td><td> 36.083 </td><td> 73130 </td><td> 18.874 </td><td> 54.544 </td><td> 6.629 </td></tr><tr><td> grupo espacial </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C 2 </td><td> C 2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td> Resolución, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3,2 / 3,4 / 4,0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3,3 / 3,8 / 3,8 </td><td> 1.89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resumen de las estadísticas de preparación de muestras y recogida de datos de estructuras representativas resuelto utilizando el método de LCP-SFX. La cantidad de muestra requerido para un experimento LCP-SFX depende de la calidad de difracción de cristal, la densidad de cristal, el diámetro de la tobera del inyector, así como la tasa de repetición tamaño del haz XFEL, la intensidad y el pulso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo de un procedimiento de preparación de la muestra típico para preparación de muestras LCP-SFX. Comienza con la cristalización LCP de la proteína diana en jeringas de vidrio a los gases. Después de que se obtienen cristales, el LCP cristal cargado se consolida en una jeringa y se titula con lípido adicional, a ABSORb la solución precipitante exceso. A continuación, los cristales se caracterizan utilizando diversos métodos de microscopía anteriores a la recogida de datos XFEL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> Figura 2. Un resultado representativo, la estructura del 5-HT 2B en el complejo con la ergotamina. (a) Microcristales de 5-HT 2B / ergotamina imágenes utilizando un modo de microscopio de campo brillante 8. Esta cifra se ha reutilizado de referencia 8 con el permiso de reproducción de la Ciencia. (B) los microcristales de 5-HT 2B / ergotamina fotografiado usando un modo de microscopio de polarización cruzada 8. Esta cifra se ha reutilizado de referencia 8 con el derecho de autorel permiso de la Ciencia. (c) Una representación de dibujos animados de la estructura 5-HT 2B / ergotamina obtenido por el método de LCP-SFX. Los lípidos que se construyeron en el modelo se muestran en la representación palo. La ergotamina ligando se muestra en la representación esferas. Las líneas continuas indican los límites aproximados de membrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> Figura 3. Un resultado representativo, la estructura del SMO en complejo con ciclopamina. Panel izquierdo, microcristales de SMO / ciclopamina imagen usando un modo de microscopio de polarización cruzada 6. Esta cifra se ha reutilizado de la referencia 6, con el permiso de reproducción de Nature Communications. Panel de la derecha, un dibujo animado representatien la estructura de SMO / ciclopamina obtenida por el enfoque LCP-SFX. ciclopamina ligando se muestra en la representación esferas. Las líneas continuas indican los límites aproximados de membrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos procedimientos para la preparación y administración de microcristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para cristalografía en serie en láseres de electrones libres de rayos X y fuentes de sincrotrón. Estos protocolos también se pueden aplicar para la incorporación y administración de microcristales de proteínas solubles, lo que reduce sustancialmente el consumo de muestras en comparación con la inyección líquida.

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras de cristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para la recopilación de datos de cristalografía seriada en fuentes de sincrotrón y láser de electrones libres de rayos X. Este método debería ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural de proteínas de membrana, como el transporte y la transducción de señales a través de la membrana. La principal ventaja de esta técnica es que permite la determinación de estructuras de proteínas de membrana en su entorno lipídico nativo a temperatura ambiente, con un consumo mínimo de muestra y un daño por radiación despreciable.Las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la fase cúbica lipídica es un material gelatinoso viscoso que resulta difícil de manipular sin herramientas especiales y experiencia previa. Comience este procedimiento con la reconstitución de proteínas de membrana en la Fase Cúbica Lipídica, o LCP, utilizando las jeringas número uno y número dos, como se describe en el protocolo escrito. Una vez formada una LCP transparente y homogénea, transfiera la muestra completa a la Jeringa Número Dos.Desconecte la jeringa número uno manteniendo el acoplador conectado a la jeringa número dos. Conecte una aguja desmontable a otra jeringa limpia de 100 microlitros, llamada jeringa número tres. Aspire aproximadamente 70 microlitros de la solución precipitante dentro de ella.Desconecte la aguja de la jeringa número tres manteniendo la esferulita de teflón dentro de la jeringa. Conecte las jeringas número dos y número tres mediante el acoplador, asegurándose de que las esferulitas de teflón estén correctamente colocadas en ambas jeringas. Enrosque cuidadosamente el acoplador hasta que quede bien ajustado.Oriente las jeringas acopladas verticalmente, con la Jeringa Número Dos en la parte inferior, e inyecte lentamente y de forma constante la muestra de LCP cargada con proteína desde la Jeringa Número Dos hacia la Jeringa Número Tres, hasta que el cordón de LCP toque el émbolo de la Jeringa Número Tres. El volumen de LCP inyectado será aproximadamente 1/10 del volumen inicial de precipitante en la Jeringa Número Tres. Verifique el volumen mediante la lectura de la escala en ambas jeringas.A continuación, desconecte la Jeringa número dos. El acoplador ahora solo está conectado a la Jeringa número tres, que contiene la muestra inmersa en la solución precipitante. Utilice Parafilm para sellar completamente la Jeringa número tres, incluyendo la interfaz entre el émbolo y la jeringa, el extremo abierto del acoplador y la tuerca de la aguja.El sellado incompleto durante este paso puede provocar cambios en las condiciones del precipitante y la deshidratación de la muestra. Repita los pasos de inyección de la muestra de LCP cargada con proteína para establecer la cristalización en seis jeringas adicionales, utilizando un volumen total de aproximadamente 50 microlitros de la muestra de LCP. Almacene las jeringas selladas en una bolsa de plástico hermética con uno o dos paños de limpieza libres de fibras previamente empapados con agua para proteger contra la deshidratación de la muestra.Cierre la bolsa y almacene las jeringas en un incubador a 20 grados Celsius durante el crecimiento de los cristales. Para la detección de cristales, retire las jeringas del incubador y emita las muestras de LCP directamente dentro de las jeringas cada 12 a 24 horas bajo un microscopio estereoscópico con luz cruzada polarizada. Identifique los cristales como partículas brillantes densamente empaquetadas, o, en el caso de cristales más pequeños, como un brillo uniforme del filamento de LCP.Devuelva las jeringas selladas a la bolsa y almacénelas a 20 grados Celsius para su uso futuro. El paso de titulación de lípidos es necesario para absorber la solución excesiva de precipitante y para prevenir la congelación de los lípidos al inyectarlos en el haz de láser de electrones libres de rayos X. Aproximadamente una hora antes del inicio de la recopilación de datos, retire las jeringas con las muestras del incubador a 20 grados Celsius.Seleccione de dos a cuatro jeringas para la consolidación de muestras según un aspecto cristalino similar y semejanza en las condiciones de cristalización. Retire cuidadosamente el sellado de Parafilm de las jeringas seleccionadas. Retire el acoplador de la jeringa y conecte una aguja desmontable limpia a la primera jeringa seleccionada.Empuje suavemente y lentamente el émbolo hacia adelante para expulsar el precipitante a través de la aguja dentro de un tubo de microcentrifuga. Tenga precaución en este paso; ya que aplicar una presión elevada sobre el émbolo puede eyectar parte del LCP cargado de cristales junto con la solución de precipitante, lo que podría provocar una pérdida parcial o total de la muestra. Detenga el émbolo cuando se haya eliminado la mayor parte del precipitante y el LCP se haya acumulado en la entrada de la aguja.Realice este procedimiento con las demás jeringas seleccionadas. Para consolidar las muestras de LCP resultantes, conecte dos jeringas mediante un acoplador limpio. Presione el émbolo de una jeringa para transferir toda la muestra de una jeringa a la otra.Desconecte la jeringa vacía. Repita este paso para consolidar todo el material LCP cargado de cristales en una sola jeringa. Retire tanto precipitante como sea posible.Agregue aproximadamente cinco microlitros de 7.9 MAG o del lípido huésped MAG de cadena más corta original a una jeringa vacía. Conecte esta jeringa a la jeringa con la muestra consolidada mediante un acoplador para jeringas y mezcle alternando la presión sobre los émbolos de las jeringas. Repita el proceso hasta que se haya absorbido toda la solución residual y se forme un LCP homogéneo y transparente.Transfiera toda la muestra de LCP mezclada a una jeringa y desconecte la jeringa vacía. Fije una aguja de carga para inyector de LCP a la jeringa que contiene la muestra consolidada. Exprese cuidadosamente aproximadamente un microlitro de la muestra de LCP sobre un portaobjetos de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos de vidrio.Presione suavemente sobre la cubreobjetivo para montar la muestra. Tome imágenes de la muestra de LCP bajo un microscopio estereoscópico con el mayor aumento posible, utilizando iluminación de campo claro y polarizadores cruzados. Si es posible, tome imágenes adicionales utilizando un microscopio y un equipo de fluorescencia UV para confirmar la presencia de microcristales de proteína en la muestra.Estime el tamaño y la densidad de los cristales. La densidad ideal de cristales para un experimento de recolección de datos dependerá del tamaño de los cristales, del diámetro del haz de rayos X y del diámetro del flujo de LCP, y debe dar como resultado una tasa de impacto de cristales del 10 al 40 %. Finalmente, cargue el inyector de LCP y realice la cristalografía seriada de femtosegundo con LCP, o la recolección de datos de LCP SFX, tal como se describe en el protocolo del texto. Aquí se muestran microcristales del receptor de serotonina en complejo con ergotamina, capturados mediante un microscopio en modo de campo brillante y mediante un microscopio en modo de luz polarizada cruzada.La estructura del complejo entre el receptor de serotonina y ergotamina se obtuvo mediante el enfoque LCP SFX. Aquí se muestran microcristales del receptor smoothant en complejo con ciclopamina, que fueron observados utilizando un modo de microscopio con polarización cruzada. La estructura del complejo entre el receptor y la ciclopamina se obtuvo mediante el enfoque LCP SFX.Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en menos de dos horas si se lleva a cabo correctamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura de las proteínas integrales de membrana, con ligeras modificaciones, también puede aplicarse a otras proteínas. La implicación de esta técnica se extiende hacia el descubrimiento de fármacos; porque estructuras de alta resolución proporcionan plantillas excelentes para las interacciones estándar entre proteínas lignanas y ayudan en el diseño de fármacos más eficientes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aquí se describe el procedimiento aplicado en el Grupo de Biología de Membrana Caffrey estructurales y funcionales para establecer manualmente ensayos de cristalización de proteínas de la membrana lipídica en mesofases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

Los protocolos describen los pasos esenciales para la obtención de cristales de difracción de la calidad de una proteína de membrana a partir de la reconstitución de la proteína en una fase lipídica cúbicos (LCP), la búsqueda de las condiciones iniciales con LCP-FRAP antes de la cristalización de los ensayos, el establecimiento de ensayos LCP cristalización y los cristales de la cosecha .

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

β barril de 'jove_content', cumplen muchas funciones dentro de las membranas externas de las bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos. Aquí, esperamos aliviar un cuello de botella conocido en los estudios estructurales mediante la presentación de protocolos para la producción de OMP de β barril en cantidades suficientes para la determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN.

A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

Se presenta un protocolo para la cristalografía de rayos X utilizando microcristales de proteínas. Se comparan dos ejemplos que analizan microcristales de crecimiento in vivo después de la purificación o en celulo .

Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción

Aquí presentamos un protocolo para la producción controlada de microcristales de proteína. El proceso utiliza un dispositivo automatizado que permita manipulación controlada de varios parámetros de cristalización. La cristalización de proteínas es realizados por adición controlada y automatizada de soluciones de la cristalización mientras que vigilar e investigar la distribución de radio de las partículas en la gota de cristalización.

Cristales de proteína creciente con distintas dimensiones usando automatizado de cristalización juntada con In Situ dispersión ligera dinámica

Este protocolo describe en detalle cómo fabricar y operar dispositivos de microfluidos para la recogida de datos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Además, describe cómo supervisar la cristalización de proteínas por la dispersión ligera dinámica y obtenidos de cómo procesar y analizar datos de difracción.

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

El éxito de un experimento de Cristalografía de femtosegundo serial tiempo resuelto es dependiente en la entrega de la muestra eficiente. Aquí, describimos protocolos para optimizar la extrusión de bacteriorhodopsin microcristales de un inyector micro-extrusión de alta viscosidad. La metodología se basa en la homogeneización de la muestra con un nuevo acoplador de tres vías y la visualización con una cámara de alta velocidad.

Mejora de extrusión de alta viscosidad de microcristales para Cristalografía de femtosegundo Serial tiempo resuelto en láseres de rayos x

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo preparar muestras de cristalografía en serie para la recopilación de datos en un inyector viscoso alto, Lipidico, recientemente encargado en el sincrotrón australiano.

Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano

El objetivo de este artículo es dar al espectador una sólida comprensión de cómo transformar su protocolo de difusión de vapor de pequeño volumen, para cultivar cristales grandes de una sola proteína, en un método de microcristalización por lotes de gran volumen para cristalografía en serie.

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

El protocolo presentado describe un enfoque sencillo para la detección de las condiciones de cristalización de proteínas y el crecimiento de cristales utilizando una placa de diálisis de alto rendimiento de 96 pocillos. El uso de tubos dializadores para el crecimiento a gran escala de microcristales también se demuestra para aplicaciones de cristalografía en serie y MicroED.

Cristalización de proteínas de alto rendimiento mediante microdiálisis

Este protocolo describe una configuración para la cristalización del transportador de esteroles ABCG5/G8. ABCG5/G8 se reconstituye en biceles para la cristalización en gotas colgantes. El protocolo no requiere materiales ni sustratos especializados, por lo que es accesible y fácil de adaptar en cualquier laboratorio para la determinación de la estructura de la proteína mediante cristalografía de rayos X.

Cristalización ABCG5/G8 en un entorno de bicelas lipídicas para cristalografía de rayos X

Aprende a preparar microcristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para cristalografía serial con láseres de electrones libres de rayos X. Este método reduce el consumo de muestra y minimiza el daño por radiación.

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