Name: De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende la plataforma de criohistología de alto rendimiento para tejidos mineralizados. Este método permite asociar múltiples señales moleculares a células específicas mediante imágenes repetidas en la misma lámina.

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Los autores desean agradecer las siguientes fuentes de financiación: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 y T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí hemos presentado un protocolo detallado cryohistology co-localizar y cuantificar varias medidas biológicas mediante la alineación de imágenes de varias rondas de manchas / formación de imágenes en una sola sección. El método descrito mediante el cryotape es especialmente útil, ya que mantiene la morfología de difícil sección de tejido (por ejemplo, hueso mineralizado y el cartílago). Además, el tejido seccionado se adhiere firmemente a la lámina de vidrio, lo que permite múltiples rondas de tinción / forma...

La investigación biológica requiere a menudo fenotipificación eficiente, lo que con frecuencia se asocia con algún tipo de análisis histológico 1-3. Esta necesidad es aún más evidente con los ambiciosos proyectos para interrumpir cada gen en el genoma del ratón 4. Estos análisis histológicos pueden variar desde la evaluación de la morfología celular y / o características anatómicas a la expresión de mapeo de genes específicos o proteínas a las células individuales. De hecho, una de las contribuciones fundamentales de la histología en el campo de la genómica es la posibilidad de asociar una señal molecular específica a una región o célula tipo específico. Los métodos tradicionales de la histología, especialmente para los tejidos musculoesqueléticos, son a menudo mucho tiempo y laborioso, que requiere a veces semanas para arreglar, descalcificación, sección, mancha, e imagen de la muestra a continuación, analizar las imágenes a través de la interpretación humana. El análisis de señales moleculares múltiples, ya sea a través de inmunohistoquímica, en hybridizat situiones, o tinciones especiales, requiere múltiples secciones e incluso múltiples muestras para llevar a cabo adecuadamente. Además, estas respuestas múltiples no pueden ser co-localizan en la misma célula y a veces puede no ser co-localizada a una región específica dentro de una determinada muestra. Como el campo de la genómica y la epigenomics mueve a la era digital, el campo histológico también debe seguir el juego para proporcionar eficiente, de alto rendimiento, y el análisis automatizado de una variedad de señales moleculares dentro de una sola sección histológica. De hecho, existe una demanda de mejora de las técnicas histológicas que se pueden asociar múltiples señales moleculares a células específicas dentro de una determinada muestra. Recientemente, se ha publicado un nuevo método cryohistological de alto rendimiento para la evaluación de varias medidas de respuesta dentro de una sección dada de tejido mineralizado 5-14. El proceso consiste en la estabilización de la sección criogénica con cryotape congelado, adherir la sección de cinta adhesiva de forma rígida a un portaobjetos de microscopio, yla realización de varias rondas de tinción y de imagen en cada sección. Estas rondas de imágenes son entonces alineados manualmente o por medio de la automatización de equipo antes de análisis de imagen (Figura 1). A continuación, presentamos los protocolos detallados de este proceso y proporcionar ejemplos en los que estas técnicas han mejorado nuestra comprensión de los diferentes procesos biológicos.

<table><tbody><tr><td>10% formalina tamponada neutra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Múltiples proveedores disponibles. Nocivo. Se puede sustituir con paraformaldehído al 4%.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Se pueden utilizar diferentes tamaños dependiendo del tejido</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Se puede sustituir por otros criomatrices. Sin embargo, las resinas a base de PVA/PEG han funcionado mejor en nuestras manos.</td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Puede ser sustituido por otras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Disco de muestras</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Puede ser sustituido por otras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Cuchillas de criostato</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Puede ser sustituido por otras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Cryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Electroscopy Microscopy Sciences</td><td>62800-46</td><td>Puede ser sustituido por otras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de plástico</td><td>para microscopio electrónico Sciences</td><td>71890-01</td><td>Puede ser sustituido por otras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Puede ser sustituido por otras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Adhesivo óptico Norland, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Adhesivo óptico Norland, 61</td><td></td></tr><tr><td>UV Luz negra</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Microscoperas rojas InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas verdes InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Calceína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Alizarina complexone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Demeclociclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>ELF 97 sustrato de fosfatasa ácida fluorescente amarilla</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Múltiples proveedores disponibles. Se puede sustituir por Hoechst 33342 u otros colorantes nucleares.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Contratinción nuclear Cy5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Acetato de sodio anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>tartrato de sodio dibásico dihidratado&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Nitrito de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Fast Red TR Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Múltiples proveedores disponibles. También se puede sustituir con otros kits de sustrato como Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naftol AS-MX&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>N,N dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich D158550</td><td></td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Azul de toluidina O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>También se pueden utilizar otros escáneres lineales o en mosaico.</td></tr><tr><td>Juego de filtros DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros CFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros GFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros YFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros amarillo personalizado (ELF 97)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>costumbre; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Juego de filtros Chroma</td><td>Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros Cy5 Chroma</td><td>Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transferencia de cinta CryoJane</td><td>Ciencias de microscopía electrónica</td><td>62800-10</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>62800-72</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Portaobjetos adhesivos CryoJane</td><td>Ciencias de microscopía electrónica</td><td>62800-4X</td><td>Múltiples proveedores disponibles.</td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento, de múltiples imágenes cryohistology de tejidos mineralizados

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Existe una necesidad creciente de fenotipado e histopatología eficientes de una variedad de tejidos. Esta necesidad de fenotipado es evidente con los ambiciosos proyectos para alterar todos los genes del genoma del ratón. La comunidad investigadora necesita medios rápidos y baratos para fenotipar los tejidos a través de la histología. Los análisis histológicos de los tejidos esqueléticos suelen llevar mucho tiempo y, en el mejor de los casos, son semicuantitativos, y suelen requerir la interpretación subjetiva de los portaobjetos por parte de personas entrenadas. Aquí, presentamos un paradigma criohistológico para el fenotipado eficiente y económico de tejidos mineralizados. En primer lugar, presentamos un método novedoso de criosección estabilizado con cinta que preserva la morfología de los tejidos mineralizados. A continuación, estas secciones se adhieren rígidamente a portaobjetos de vidrio y se obtienen imágenes repetidamente durante varias rondas de tinción. A continuación, las imágenes resultantes se alinean manualmente o mediante un software informático para producir pilas compuestas de varias imágenes en capas. El protocolo permite la colocalización de numerosas señales moleculares a células específicas dentro de una sección determinada. Además, estas señales fluorescentes se pueden cuantificar de forma objetiva a través de programas informáticos. Este protocolo supera muchas de las deficiencias asociadas con la histología de los tejidos mineralizados y puede servir como plataforma para el fenotipado de alto rendimiento y alto contenido de los tejidos musculoesqueléticos en el futuro.

Un flujo de trabajo general para el de alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology La figura 1 representa el flujo de trabajo general usado para esta técnica. Incluye varios pasos de fijación a través de varias rondas de formación de imágenes y, finalmente, la imagen de alineación / análisis. El proceso puede tomar tan poco como una semana para ir de la fijación de la muestra a travé...

En este manuscrito, presentamos una plataforma de criohistología semiautomatizada de alto rendimiento para producir imágenes compuestas alineadas de múltiples medidas de respuesta a partir de varias rondas de imágenes fluorescentes en secciones congeladas de tejidos mineralizados.

De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

El objetivo de esta tecnología es proporcionar herramientas histológicas que integren sistemas modelo complejos de manera completamente digital, de alto rendimiento, independiente del observador, rentable y significativa para los biólogos del sistema músculo-esquelético. La histología, aunque fundamental para la mayoría de los investigadores biológicos, suele ser intensiva en mano de obra y no cuantitativa. Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas histológicas que permitan un análisis eficiente, de alto rendimiento y automatizado.Con nuestra plataforma de criohistología, el investigador puede asociar múltiples señales moleculares a células específicas dentro de una muestra determinada mediante imágenes y tinción de la misma portaobjetos varias veces de manera de alto rendimiento. La demostración del procedimiento estará a cargo de la doctora Xi Jiang y Li Chen, asistentes de investigación en mi laboratorio, quienes han sido pioneros en el desarrollo y ejecución de estas técnicas. Para comenzar este procedimiento, retire la muestra del formaldehído, seccione cualquier tejido excesivo y transfiérala a sacarosa al 30 %, preparada en PBS 1x.Incube las muestras en sacarosa durante 12 a 24 horas a cuatro grados Celsius. A continuación, llene un molde criogénico con medio de inclusión criogénica y coloque las muestras en el molde. Luego, alinee las muestras en el molde de manera que el plano de corte de la región de interés sea paralelo al fondo del molde.A continuación, coloque el molde criogénico sobre un trozo de hielo seco hasta que se congele una capa delgada de medio de inclusión criogénica, fijando así los especímenes en su lugar. Luego, llene el volumen restante del molde criogénico con medio de inclusión criogénica, manteniendo el molde sobre la pelota de hielo seco. Posteriormente, coloque el molde criogénico en un recipiente que contenga 2-metilbutano previamente enfriado con hielo seco.Una vez que las muestras estén completamente congeladas, retire el molde criogénico y elimine el exceso de 2-metilbutano. Envuelva el molde criogénico en celofán y almacénelo a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius. En este procedimiento, transfiera el bloque de muestra del congelador a un criostato ajustado a entre menos 20 y menos 25 grados Celsius.A continuación, retire el bloque del molde criogénico y corte el medio de inclusión criogénica sobrante con una cuchilla de afeitar. Luego, agregue algo de medio de inclusión criogénica sobre el disco del espécimen y alinee el bloque de modo que la superficie del disco del espécimen quede paralela a la superficie inferior del bloque. Espere a que el medio de inclusión criogénica se congele.A continuación, coloque el disco de la muestra sobre la cabeza del espécimen y ajuste la cabeza de manera que la cuchilla corte paralelo a la superficie del bloque de la muestra. Luego, corte trozos de criocinta para cubrir la región de interés y enfríelos previamente en el criostato. Posteriormente, recorte el bloque hasta un nivel dentro de la región de interés, continuando con los ajustes según sea necesario.Una vez que se haya alcanzado la región de interés y se pueda realizar un corte, retire con un pincel cualquier viruta de la superficie del bloque. A continuación, retire el respaldo no adherente de la cinta criogénica sujetando la cinta por las lengüetas plateadas no adhesivas. Luego, coloque la cinta sobre el bloque con el lado adhesivo hacia abajo.Aplique presión sobre la cinta criogénica utilizando el rodillo y realice un corte mediante el motor automático o la rueda de corte manual del criostato. A continuación, coloque el corte con el lado del tejido hacia arriba sobre un portaobjetos plástico dentro del criostato. Retire el portaobjetos plástico del criostato y permita que el medio de inclusión criogénica se derrita, de modo que el corte se adhiera a la superficie del portaobjetos.Repita el corte para las secciones seriadas u otras regiones de interés. Una vez finalizado, coloque las secciones en una caja para portaobjetos y almacénelas a cuatro, menos 20 o menos 80 grados Celsius, según la duración del almacenamiento requerida y las medidas de respuesta posteriores. Para realizar el método con adhesivo curable por UV, primero etiquete el portaobjetos.Aplique una gota de adhesivo óptico activado por UV sobre dos portaobjetos y use el borde de un portaobjetos para extender una capa fina de adhesivo sobre la superficie de los mismos. A continuación, corte la pestaña de plata y oro y coloque la sección con la cinta hacia arriba sobre la capa de adhesivo del primer portaobjetos. Aplique la sección con un movimiento de rodado de un extremo a otro para minimizar la formación de burbujas atrapadas debajo de la cinta.A continuación, retire la sección adherida con cinta del primer portaobjetos y colóquela sobre la capa adhesiva del segundo portaobjetos, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas. Una vez colocada en cada portaobjetos la cantidad adecuada de secciones para el experimento dado, elimine el exceso de adhesivo de las áreas circundantes. A continuación, inspeccione cuidadosamente las secciones para detectar la presencia de burbujas o fibras debajo de la cinta.Luego, coloque las laminillas del microscopio bajo la luz negra UV durante cinco a diez minutos para entrecruzar la capa adhesiva. En este paso, prepare la solución del marcador de referencia disolviendo 50 microlitros de microesferas verdes y 50 microlitros de microesferas rojas en 100 microlitros de agua. Almacene la solución en la oscuridad a cuatro grados Celsius.Luego, sumerja la punta de una pipeta en la solución de microesferas y aplique la solución de microesferas sobre cada sección, adyacente a la región de interés. A continuación, seque las laminillas a temperatura ambiente y protéjalas de la luz cubriéndolas con papel de aluminio durante 30 minutos, si va a procesar las laminillas ese mismo día. Si no es así, coloque las laminillas en una caja para portaobjetos a cuatro grados Celsius.Después de teñir las secciones, monte las laminillas sobre los portaobjetos utilizando un medio de montaje adecuado. Para realizar la imagen, cargue los portaobjetos en las bandejas del microscopio e inserte las bandejas en la pila de bandejas del microscopio escáner. A continuación, haga clic en la lista de perfiles del software del microscopio para cargar un perfil para cada portaobjeto con el tiempo de exposición adecuado para cada fluoróforo.A continuación, haga clic en el botón Iniciar escaneo de vista previa para obtener una imagen de vista previa de cada portaobjetos. El software asignará automáticamente un nombre de archivo leyendo los códigos de barras colocados en las etiquetas de los portaobjetos. Alternativamente, se puede asignar manualmente un nombre de archivo a cada portaobjetos.Establezca las regiones de interés entrando en el asistente de detección de tejidos, dibujando cada región con la herramienta de dibujo, realizando los ajustes necesarios y guardándolas para rondas posteriores de imágenes. Una vez configurado cada portaobjetos, inicie el proceso de escaneo haciendo clic en el botón Iniciar escaneo. Después de cada ronda de imágenes, sumerja los portaobjetos en un frasco Coplin lleno con PBS 1x hasta que las cubreobjetos se desprendan de los portaobjetos, antes del siguiente paso de tinción.Después de completar todas las rondas de obtención de imágenes, exporte las imágenes de cada canal individual como archivos TIF o JPG para el ensamblaje y análisis de las imágenes. En esta figura, una sección del fémur de un ratón de tres meses fue teñida con calceína azul e imagenada para evaluar el mineral acumulado, visible en blanco, y las marcas de mineralización, visibles en verde y rojo en la primera ronda de obtención de imágenes. Luego, las muestras fueron imagenadas para evaluar la actividad de TRAP, visible en amarillo en la segunda ronda, y la actividad de AP, visible en rojo en la tercera ronda de obtención de imágenes.Finalmente, las laminillas se tiñeron con azul de toluidina en la cuarta ronda. Los marcadores de referencia se capturaron durante cada ronda de imagen, incluida la ronda cromogénica, y se alinearon utilizando un software personalizado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos tiempo del necesario para descalcificar un espécimen típico.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir imágenes de alto contenido de alta calidad de tejidos mineralizados, las cuales esperamos que puedan ser utilizadas más ampliamente por la comunidad del sistema músculo-esquelético.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presenta una estrategia para analizar cuantitativamente los datos histológicos en la médula ósea. La microscopía confocal de células marcadas con fluorescencia en secciones de tejido da como resultado imágenes bidimensionales, que se analizan automáticamente. Los análisis de colocalización de diferentes tipos de células se comparan con los datos de imágenes simuladas, lo que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones celulares.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Este trabajo presenta un nuevo protocolo de procesamiento e imagen para el análisis transversal transversal de tejido tridimensional denso que permite la plena explotación de las modalidades de imagen confocal. Este protocolo preserva la antigenicidad y representa un sistema robusto para analizar la histología de la piel y potencialmente otros tipos de tejidos.

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Este protocolo está dirigido a células específicas en el tejido para la proyección de imagen en resolución de nanoescala utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Gran número de secciones seriadas del material biológico embebido en resina es primero reflejada en un microscopio de luz para identificar el destino y luego de manera jerárquica en la SEM.

Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

Este método describe el uso del modelo de ratón R26R-Confetti (Confeti) para estudiar tejidos mineralizados, cubriendo todos los pasos desde la estrategia de cría hasta las adquisiciones de imágenes. Se incluye un protocolo general que se puede aplicar a todos los tejidos blandos y un protocolo modificado que se puede aplicar a los tejidos mineralizados.

Rastreo Genético Clonal usando el ratón de confeti para estudiar tejidos mineralizados

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Este protocolo presenta una línea completa para analizar muestras obtenidas de corazones humanos que abarcan las escalas microscópica y macroscópica.

Pipeline para el estudio anatómico tridimensional multiescala del corazón humano

La combinación de blanqueo iterativo-extendido-multiplexidad (IBEX) y un ensayo comercial de etiquetado de nucleótidos (Click-iT EdU) permite la detección y categorización de tipos de células en división en procesos altamente dinámicos en secciones fijas de tejido murino congelado. Además, una novedosa canalización de procesamiento de imágenes de código abierto proporciona adquisición y análisis de imágenes de alto rendimiento.

Flujo de trabajo de imágenes y análisis de alto rendimiento para evaluar los fenotipos de las células de la piel y los estados de proliferación en muestras de tejido

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Este protocolo incluye un flujo de trabajo paso a paso para muestras vasculares calcificadas: manipulación de tejidos, descalcificación, validación de ARN, detección de niveles de calcificación y estrategias de selección de regiones de interés en el Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). El objetivo es presentar un método integral para preservar la morfología del tejido vascular y el ARN para un análisis transcriptómico espacial fiable.

Preparación y procesamiento de arterias calcificadas con morfología y ARN preservados para perfilado espacial digital

Este protocolo estandariza la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para tejidos gruesos integrando la congelación a alta presión (HPF) con el método waffle, el levantamiento por haz de iones de foco criogénico (crio-FIB) y la adquisición paralela simétrica en dosis, produciendo láminas uniformemente finas y muestras vitrificadas para análisis in situ reproducibles en el hipocampo del ratón.

Flujo de trabajo de criotomografía electrónica para tejidos gruesos demostrado en hipocampo de ratón

Aprende la plataforma de criohistología de alto rendimiento para tejidos mineralizados. Este método permite asociar múltiples señales moleculares a células específicas mediante imágenes repetidas en la misma lámina.

De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

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