Name: Férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprende a inducir trombosis con cloruro férrico en arterias carótidas y mesentéricas de ratones usando microscopía intravital. Este método permite evaluar fármacos anticoagulantes y antiplaquetarios en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de adjudicación R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) y R01 HL098217 (PI: Nieman). El contenido de esta publicación es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los procedimientos y manipulaciones de los animales han sido aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC) de la Clínica de Cleveland, en conformidad con la política de Estados Unidos Servicio de Salud Pública en el cuidado humano y Uso de Animales, y la Guía de los NIH para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio. 1. Preparación: <ol><li> Tinte fluorescente para el etiquetado de plaquetas <ol><li> Preparar la solución 6G rodamina, 0,5 mg / ml, en solución salina y esterilizar la solución con 0,22 micras filtro. </li></ol></li><li> FeCl3 Solución <ol><li> Hacer una solución madre fresca de 30% FeCl 3 (anhidro, es igual a 1,85 M) en agua pura, y el filtro con 0,45 micras filtro. Preparar 5 ml fresco FeCl3 solución a la concentración deseada [por ejemplo, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) y 12,5% (0,771 M)] por diluir la solución al 30% de FeCl3 con i aguana 6 cm placa de cultivo de tejidos y mantener la tapa cerrada. NOTA: El uso de la placa de cultivo hace que sea más fácil para recoger el papel de filtro saturado con una solución de FeCl3 que a recogerlo en un recipiente estrecho, tal como un tubo de 1.5 ml. FeCl3 es extremadamente peligroso y que las precauciones, tales como el uso de guantes y bata de laboratorio, etc., equipo de protección personal, siempre se debe tomar. </li></ol></li><li> Papeles de filtro <ol><li> Cortar el papel de filtro de 1 mm x 2 mm de tamaño. Remojar suficientes piezas de papel de filtro de corte en la solución de FeCl3 en el mismo plato. </li></ol></li><li> Solución de clorhidrato de papaverina <ol><li> Preparar la solución de hidrocloruro de papaverina (25 mg / ml) en agua y esterilizar la solución con 0,22 micras filtro. </li></ol></li><li> en gel de agarosa <ol><li> Preparar 2% en gel de agarosa en PBS o solución salina en la placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, ~ 1 cm de espesor, y cut a semicírculo con ~ 3 cm de diámetro. </li></ol></li></ol> 2. FeCl 3 inducida por lesión arterial carotídea Modelo de trombosis <ol><li> Procedimientos quirúrgicos para el modelo de trombosis <ol><li> Utilice 8 - ratones C57Bl6 12 semanas de edad (u otras cepas como sea necesario). Anestesiar los ratones con la mezcla de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal. Confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie. NOTA: Esta cantidad de ketamina / xilazina es suficiente para mantener al animal en la anestesia estable y sin dolor (respuesta a los pies de apriete) durante al menos 1 hr. </li><li> Retire la piel en el cuello y parte superior del pecho con una pequeña maquinilla eléctrica animal. Crema depilatoria no es necesario. Aplicar el ungüento oftálmico de petróleo neutro en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia. </li><li> Asegure el ratón en la posición supina sobre la tapa de 15 cm placa de cultivo de tejidos. Utilice una cinta larga (~ 10 cm) para asegurar hinextremidades d e inferior del cuerpo, y dos piezas de cinta pequeña (2 cm x 0,5 cm) para asegurar las patas delanteras. Utilice una sutura 4-0 para envolver alrededor de los incisivos, cinta de los dos extremos de la sutura a la tapa para mantener el cuello recto del ratón (Figura 2). </li><li> Coloque la placa con la cabeza del ratón sobre el usuario bajo una fuente de luz quirúrgica. </li><li> Esterilizar la zona quirúrgica con algodón empapado en alcohol. Usa los micro-Adson fórceps para mantener la piel y utilizar unas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión (2 - 3 mm). </li><li> Manteniendo la piel de la incisión con el fórceps y tijeras quirúrgicas insertar con las mordazas cerradas en la incisión. Empuje las tijeras por vía subcutánea hacia el manubrio o la barbilla, y luego abrir las tijeras para liberar la piel de la capa subcutánea. </li><li> Cortar la piel con las tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la línea media del manubrio al nivel del hueso hioides (Figura 3A y 3B). Sin rodeos diseccionar la fascia delgada (línea punteada, en <strong&gt; Figura 3B) entre la glándula submaxilar con una multa pinza hemostática y una pinza Graefe (Figura 3B y 3C; flechas azules). NOTA: El manubrio (flecha negro en la figura 3C) y la tráquea (T en la figura 3C) se verán después de este paso. </li><li> Mantener el tejido blando y la piel que se observa a la derecha del manubrio con las pinzas Graefe, inserte la pinza debajo de la faja hacia la posición de 2 horas (amarillo línea de puntos en la figura 3C), abrir las mordazas de la pinza hemostática para liberar el vena yugular del tejido circundante. </li><li> Cortar la fascia, el tejido blando y la piel hacia la posición dos (Figura 3C) con las tijeras quirúrgicas para exponer la vena yugular derecha (Figura 3D, flecha). </li><li> Dibuje alrededor de 200 - 300 l solución 6G rodamina usando una jeringa de 1 ml con aguja de 22 G y entonces el cambioa 30 de la aguja G. NOTA: Esto protege la aguja 30 G del daño de su punta fina. Directamente arrastrar la solución de rodamina 6G con la aguja 30 G no dañará la punta; Sin embargo tocando la pared del recipiente accidental puede causar daños, lo que puede hacer la inyección difícil. </li><li> Enjuague la aguja de 30 G por lentamente empujando a la solución 6G rodamina, asegurarse de que no queden burbujas de aire en la jeringa o la aguja. Mantenga 100 l rodamina 6G solución inyectable. </li><li> Curva 2 - 3 mm punta de la aguja a un ángulo de 90 ° con el soporte de la aguja, lo que impedirá la inserción de la aguja es demasiado profunda para la vena yugular y hace que la inyección sea más fácil de controlar (Figura 3D). </li><li> Se inyecta la solución de rodamina 6G en la vena yugular derecha a las plaquetas de la etiqueta. Para estabilizar la jeringa y mantener la aguja en posición, mantener la jeringa con una mano y la aguja con el fórceps Graefe con la otra mano durante el injection.After inyección, sujetar el sitio de la inyección con las pinzas Graefe para evitar el sangrado. </li><li> Abrir las mordazas de la pinza hemostática e insertarse con las pinzas para sujetar Graefe la pared del vaso de la zona de la inyección, y luego ligar el sitio de la inyección con una sutura 6-0. NOTA: Como una alternativa de paso 2.1.15, aplicando presión a la zona de inyección con un dedo durante 2 minutos se detendrá el sangrado; Sin embargo, este método tiene un riesgo de causar sangrado si el coágulo en el sitio de inyección se retira accidentalmente más. </li><li> Sin rodeos diseccionar el tejido blando y la fascia alrededor de la glándula submaxilar izquierda con la pinza y la pinza Graefe y tire de la glándula hacia la posición 7 horas (Figura 3E) para exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo (flecha azul en la Figura 3E). </li><li> Sin rodeos diseccionar la fascia (Figura 3E, línea punteada) entre el músculo esternocleidomastoideo izquierdo y el músculo omohioideo o la sternohyOID muscular (Figura 3E, flecha verde) situado a la izquierda del sitio de la tráquea con la pinza hemostática. </li><li> Pasar una aguja con sutura de seda 6-0 (alrededor de 15 cm de longitud) en el medio del músculo esternocleidomastoideo (flecha azul en la Figura 3E), poner los dos extremos de la sutura en conjunto y tire de la sutura lateralmente hacia la posición de diez . NOTA: Este procedimiento debe realizarse con cuidado para evitar lesiones de la vena yugular izquierda, que se encuentra fuera del músculo esternocleidomastoideo. </li><li> Sin rodeos separar el músculo esternohioideo delgada y / o músculo omohioideo para exponer la arteria carótida (CA) (Figura 3F flecha) después de alejarse del músculo esternocleidomastoideo. Cortar el músculo esternohioideo y / o músculo omohioideo según sea necesario. Utilice la pinza hemostática para separar el tejido blando de CA sin tocar la CA. NOTA: CA está acompañado por el nervio vago, la estructura se ve en blanco <strong&gt; Figura 3G (flecha verde), y en la mayoría de los casos es por debajo del músculo esternohioideo delgada y / o músculo omohioideo (entre las líneas de puntos amarillos en la Figura 3F). </li><li> Use unas pinzas de punta para recoger la fascia lateral alrededor de la CA, evitando el nervio vago y CA. Use otros fórceps de punta fina para perforar un agujero en la fascia entre el CA y el nervio vago. </li><li> Pasar el gancho a través del agujero y levante suavemente la CA, y luego colocar las pinzas de punta fina bajo la CA. Mover el gancho y fórceps en direcciones opuestas a lo largo del CA para despojar a los tejidos blandos de la adventicia. Libre de al menos 5 ~ mm de longitud de CA (Figura 3H, flecha azul) del tejido circundante. </li><li> Para bloquear la fluorescencia de fondo, presione el extremo de un plástico negro agitador de café al piso, CrossCut el agitador de café en una pieza de 3 mm, y luego se corta longitudinalmente a lo largo de los bordes de plegado para obtener dos piezas de &quot;T&quot; de plástico de forma (Figura 3H, verde flecha). </li><li&gt; Enjuague una pieza de esta &quot;U&quot; forma plástica con solución salina y sostenerlo con unas pinzas y colocarlo bajo la CA mientras levanta suavemente la CA con el gancho (Figura 3H, flecha verde). Inmediatamente aplique 2-3 gotas de solución salina para evitar el secado de la CA. </li></ol></li><li> En tiempo real de grabación de vídeo <ol><li> Transferir la tapa del ratón y la placa junto a la platina del microscopio y colocar en una posición apropiada bajo la lente de 10X agua. Llenar el espacio entre la lente de 10X y la CA con solución salina. </li><li> Iniciar la aplicación de software de grabación de vídeo digital, y poner en marcha un nuevo archivo y el nombre que en consecuencia. Grabar imágenes de los vasos normales y anote el número de cuadro cuando se detiene la grabación de vídeo. NOTA: Consulte el software de grabación de vídeo en el equipo para la grabación. Utilizamos software de grabación de vídeo digital y las siguientes descripciones se basan en esta aplicación. NOTA: Desde tra mecánicauma puede dañar el endotelio y dar lugar a la formación de trombos 20, es necesario para confirmar que no hay una lesión quirúrgica en la pared del vaso antes de la lesión FeCl 3. También es necesario para confirmar que no hay tejido restante alrededor de la CA, que puede formar una barrera y atenuar el efecto de FeCl 3 lesión inducida. Anote el número de cuadro de los registros hará que sea fácil de analizar los vídeos según los tiempos transcurridos después. </li><li> Mover el ratón con la tapa de la placa de la lente de 10X. Doblar una esquina de una toalla de papel para hacer una punta delgada y fina y utilizarlo para borrar cuidadosamente la solución salina alrededor del CA (evite tocar CA), así como en otros lugares en el campo quirúrgico. Esto es importante para evitar la dilución de la solución de FeCl 3 utilizado. </li><li> Use unas pinzas de punta y recoger un trozo de papel de filtro saturado con una solución de FeCl3 y colocarlo directamente en la CA y mantenerlo en el sitio durante 1 min. NOTA: To visualización de la ayuda de la información exacta del torrente sanguíneo y cosecha, coloque el papel de filtro cerca del extremo distal del expuestos CA (Figura 3I) y dejar un pequeño segmento en el sitio proximal (flecha verde en la figura 3I) para observar el flujo sanguíneo en la última hora fase (ver abajo). </li><li> Retire el papel de filtro (este punto de tiempo se define como el comienzo de &quot;después de la lesión&quot;) y enjuague la CA con solución salina (al menos 2 ml). </li><li> Ponga el ratón con la tapa de la placa posterior de la lente de 10X; observar el barco y empezar a grabar imágenes de vídeo. Anote el número de fotogramas de vídeo al final del primer minuto de grabación. NOTA: La formación de trombos se identifica por la acumulación de las plaquetas fluorescentes, que se observa en las imágenes de vídeo en tiempo real en la pantalla del ordenador o bajo microscopio. Grabar imágenes de vídeo inmediatamente después de poner el ratón de nuevo bajo el microscopio. Mantenga la grabación hasta el final de la primera minutos después de retirar la filtrar papel. Observar todo el barco desde el extremo distal de los sitios proximales para obtener información acerca de la lesión, y luego se centran en el área de interés (por lo general es el centro de la zona lesionada) para obtener más imágenes. </li><li> Imágenes de vídeo de registro para 10 seg cada minuto para la primera 10 min (por ejemplo, 02:55-03:05) y después 10 seg cada dos minutos hasta el final del experimento. Escribir los números del bastidor cuando se detiene cada grabación. NOTA: Los puntos finales del modelo son: 1) cuando el flujo de sangre ha dejado de&gt; 30 seg; o 2) si la oclusión no se ve en 30 min después de la lesión. En este caso, el uso de 30 minutos para el análisis estadístico. Establecer el tiempo de exposición de la grabación de vídeo de hasta 10 ms al inicio, por lo que será fácil de observar el flujo sanguíneo a través de los trombos. Cuando los trombos se hacen grandes y la fluorescencia satura sensor de la cámara, se hace difícil para identificar el flujo de sangre a través de los trombos. Para resolver este problema, mueva la imagen center al sitio ileso proximal (Figura 3I, flecha verde) donde el flujo de sangre que aún se puede observar con claridad. También aumentan el tiempo de exposicion a 15 o 20 ms cuando se enfoca en el sitio de la ONU con lesión proximal, por lo que el flujo de sangre se puede observar con mayor claridad. Cuando el flujo sanguíneo cesará, numerosas células más grandes (leucocitos) empiezan a rodar por la pared del vaso en el sitio proximal del trombo. Flujo general se detiene en 2 - 3 min después de la aparición de las células grandes. Anote la hora Expose en la hoja de registro si se cambia. Por lo general toma alrededor de 30 minutos de la anestesia hasta el final del experimento, si se utilizaran los de tipo salvaje ratones normales C57BL6. PRECAUCIÓN NOTA: No utilice el coágulo de plaquetas agregadas blanco como el signo de la cesación del flujo sanguíneo, lo que no dará una información precisa y se ve afectada por el tiempo de exposición. El coágulo blanco cubrió la luz del vaso no significa que el flujo de sangre dejado (ver el video representativa 1). </li><li&gt; Al final del experimento, la eutanasia a los ratones utilizando una sobredosis de ketamina / xilazina (200/20 mg / Kg), seguido por dislocación cervical después de confirmar sin respiración y latidos del corazón. </li></ol></li></ol> 3. FeCl3 inducida por la arteria mesentérica / Trombosis Venosa Modelo <ol><li> Anestesiar 8 - ratones C57Bl6 12 semanas de edad como se mencionó en la sección 2.1.1. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia. </li><li> Inyectar la solución papaverina (en total 0,4 mg / ratón) por vía intraperitoneal para inhibir el peristaltismo intestinal. </li><li> Retire la piel en el cuello y el abdomen con una maquinilla eléctrica animal. Crema depilatoria no es necesario. </li><li> Asegure el ratón en la posición supina sobre la tapa de 15 cm placa de cultivo de tejidos. Utilice cuatro trozos de cinta pequeña (2 cm x 0,5 cm) para asegurar todas las piernas. Utilice una sutura de 4 -0 para envolver alrededor de los incisivos, cinta de los dos extremos de la sutura a la tapa para mantener el cuello recto (Figura 2). </li><li> Siga los procedimientos 2.1.4 -2.1.15 para exponer la vena yugular para la inyección de rodamina 6G a las plaquetas de la etiqueta. </li><li> Realizar una incisión en la línea media a través de la piel de la xifoides hasta el abdomen inferior con las tijeras quirúrgicas (Figura 4A). Recoger el peritoneo medio (también llamada línea alba, la figura 4A, flecha) con una pinza Graefe, que es clara y no tiene vasos sanguíneos, levantar unos 2 - 3 mm de altura, confirmar ninguna de intestino bajo la línea de corte, y cortar el peritoneo abierto longitudinalmente con las tijeras finas (Figura 4B). </li><li> Vuelva a asegurar los ratones a la posición lateral derecha. Colocar el gel de agarosa de medio círculo cerca del abdomen, y exteriorizar suavemente los intestinos y se extendió en la parte superior del gel con las pinzas Graefe (Figura 4C). Usa los segundos ramales para el experimento trombosis (Figura 4C, flecha). NOTA: Utilice la pinza o pinzas de micro-Adson para ayudar a exteriorizar los intestinos. Evitar herir laintestino y el recipiente. </li><li> Coloque 5-6 gotas de solución salina para mantener la humedad del intestino y de los vasos. Transferir el ratón con la tapa de placa junto a la platina del microscopio y colocar en la posición adecuada debajo de la lente seca 10X. NOTA: Utilice un objetivo seco porque la membrana yeyunoileales no puede contener solución salina. Asegúrese de dejar caer una solución salina en los tejidos expuestos a mantenerlos húmedos. </li><li> Secar la solución salina alrededor de la arteria mesentérica y vena antes del tratamiento. </li><li> Use unas pinzas de punta para recoger un trozo de papel de filtro saturado con una solución de 12,5% de FeCl3 y colocarlo directamente en la arteria mesentérica y vena durante 1 min (Figura 4D). Retire el papel de filtro (este punto de tiempo se define como el comienzo de &quot;después de la lesión&quot;) y enjuagar la arteria mesentérica heridos y la vena con solución salina (al menos 2 ml). </li><li> Ponga el ratón con la tapa de la placa de nuevo bajo la lente seca 10X; observar los vasos y empezar a RECord imágenes de vídeo que se han mencionado en el punto 2.2). NOTA: Los puntos finales de este experimento son: 1) cuando el flujo de sangre ha dejado de&gt; 30 seg; o 2) si la oclusión no se ve en 30 min después de la lesión, y en este caso utilizar 30 min para el análisis estadístico. </li><li> Al final del experimento, la eutanasia a los ratones utilizando una sobredosis de ketamina / xilazina (200/20 mg / Kg), seguido por dislocación cervical después sin respiración y los latidos del corazón se confirman. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El FeCl3 inducida modelo es uno de los modelos de trombosis más ampliamente usados, que no sólo pueden proporcionar información valiosa acerca de las modificaciones genéticas sobre la función plaquetaria y trombosis 7,8,16,19,31-33, pero también puede ser una herramienta valiosa para la evaluación de compuestos terapéuticos y estrategias para el tratamiento y prevención de enfermedades aterotrombóticos 11,17,34-37. Aquí hemos demostrado que nuestros modificaciones y refinamientos de este...

La trombosis arterial (coágulos de sangre) es una complicación común de muchas enfermedades sistémicas asociadas con la inflamación crónica, incluyendo la aterosclerosis, la diabetes, la obesidad, el cáncer y los trastornos autoinmunes reumatológicas crónicas. Los trombos que se presentan en el tronco circulación arterial de la activación plaquetaria inadecuada, agregación y mecanismos procoagulantes posteriores, y están implicados en los ataques cardíacos, accidentes cerebrovasculares y la pérdida de la extremidad. La pared del vaso es un sistema complejo que incluye múltiples tipos de células y está influenciada por una multitud de factores extrínsecos como el estrés de cizallamiento, las células de la sangre, hormonas y citoquinas, así como la expresión de proteínas antioxidantes que circula en la pared del vaso. Experimentos in vitro no pueden replicar este entorno complejo y por lo tanto en estudios in vivo utilizando modelos animales son críticos para permitir una mejor comprensión de los mecanismos implicados en los trastornos trombóticos. Los ratones han demostrado tener simmecanismos ILAR a los seres humanos en términos de la trombosis, aterosclerosis, inflamación y diabetes 1,2. Además, los ratones transgénicos y knockout pueden ser creados para probar la función de los productos génicos específicos en un complejo fisiológico o patológico ambiente. Tales estudios imitan la patología humana y pueden proporcionar información sobre el mecanismo importante relacionada con el descubrimiento de nuevas vías y terapias, así como proporcionar detalles importantes en la caracterización de los efectos de la droga sobre la trombosis. Trombos arteriales patológicas se producen debido a la lesión endotelial capa o disfunción y la exposición de la corriente de la sangre a la matriz subendotelial 3,4. Varios modelos de trombosis se han desarrollado para inducir este daño endotelial tales como la lesión mecánica, lesión oxidativa a base de Bengala compuesto fotorreactivo Rose y lesiones láser 5. En este espectro, cloruro férrico (FeCl3) inducida por la lesión vascular es un modelo ampliamente utilizado de trombosis. Este reactivo cuandose aplica a la cara externa de los vasos induce daño oxidativo a las células vasculares 6-8, con pérdida de la protección de las células endoteliales a partir de plaquetas y componentes de la cascada de coagulación circulantes. El modelo de FeCl 3 es simple y sensible tanto a anticoagulante y anti-plaquetas medicamentos, y se ha realizado en arterias carótida y femoral, vena yugular, y mesentérica y arteriolas y vénulas cremastéricos en ratones, ratas, cobayas y conejos 6-15. Un parámetro medible en este modelo es el tiempo transcurrido desde la lesión hasta completar la oclusión del vaso, medida como cese el flujo de sangre con un medidor de flujo Doppler o bajo la observación directa con 6,7,9 microscopía intravital. Una gama de tiempos entre 5 a 30 min se ha informado en diferentes estudios en ratones C57Bl6 7-10,16, lo que sugiere que FeCl 3 concentraciones, tipos de anestesia, las técnicas quirúrgicas, la edad del ratón, fondo genómico, método de medición de bLood flujo, y otras variables ambientales tienen efectos significativos en este modelo. Esta amplia variabilidad hace que sea difícil comparar los estudios de diferentes grupos de investigación y puede hacer la detección de diferencias sutiles difícil. Con una visión para minimizar tales variabilidades y establecer un reproducible uniformemente en el sistema de modelo in vivo, hemos refinado el modelo de arteria carótida inducida por FeCl3 que hace que los datos altamente reproducibles con una variación mínima 6-10,16-19. En este trabajo se describen y compartir las habilidades y presenta varios ejemplos experimentales representativos que pueden beneficiarse de este modelo.

<table><tbody><tr><td>Tijeras quirúrgicas - Carburo de tungsteno</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>14502-14</td><td>cortar y sujetar la piel</td></tr><tr><td>Micro-Adson Pinzas - Dentado/Recto/12 cm</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11018-12</td><td>cortar y sujetar la piel</td></tr><tr><td>Tijeras Metzenbaum Fino - Carburo de tungsteno/Curvo/Romo-Romo/14,5 cm</td><td>Herramientas de ciencia fina&nbsp;</td><td>14519-14&nbsp; &nbsp;</td><td>para diseccionar y separar los tejidos blandos</td></tr><tr><td>Hemostático ultrafino - Liso/Curvo/12,5 cm</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>13021-12</td><td>para diseccionar y separar tejidos blandos</td></tr><tr><td>Pinzas Graefe - Dentado/Recto/10 cm</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11050-10</td><td>para diseccionar y separar tejidos blandos</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas Finas - Puntas de Biología/Recto/Inox/11 cm</td><td>Herramientas de Ciencias Finas&nbsp;</td><td>11254-20&nbsp;</td><td>Aislar el vaso del tejido circundante</td></tr><tr><td>Pinzas de #5XL Dumont - Puntas Estándar/Rectas/Inox/15 cm</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11253-10</td><td>Aislar el vaso del tejido circundante</td></tr><tr><td>Gancho romo- 12 cm/0,3 mm Diámetro de la punta</td><td>Herramientas de ciencia fina&nbsp;</td><td>10062-12</td><td>Aislar el vaso del tejido circundante</td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Needle Holders</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>12061-02</td><td>Portaagujas</td></tr><tr><td>Hilo de sutura 4-0</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18020-40</td><td>Para la fijación de los incisivos a la placa</td></tr><tr><td>Hilo de sutura 6-0</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18020-60</td><td>Para todas las cirugías y ligaduras</td></tr><tr><td>Kalt Suture Needles Fine</td><td>Science Tools&nbsp;</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>rodamina 6G&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83697-1G</td><td>Para lebel plaquetas</td></tr><tr><td>FeCl3 (Anhidro)</td><td>Sigma</td><td>12321</td><td>Para inducir lesiones</td></tr><tr><td>vasculares Clorhidrato de papaverina</td><td>Sigma</td><td>P3510</td><td>Para inhibir el peristaltismo intestinal.</td></tr><tr><td>Medline Esterilización de instrumentos quirúrgicos Cintas de autoclave de vapor</td><td>Medline</td><td>111625</td><td>Para fijar el ratón a la placa</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Filtros de jeringa - estériles 0.22 y micro; m</td><td>Fisher</td><td>09-720-004</td><td>Para la esterilización de soluciones inyectadas a ratones</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Filtros de jeringa - estériles 0.45 y micro; m</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td>Para filtrar la solución de FeCl3</td></tr><tr><td>Almohadilla de preparación con alcohol estéril</td><td>Fisher</td><td>06-669-62</td><td>Para esterilizar el sitio quirúrgico</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>Para fabricar</td></tr><tr><td>el microscopio fluorescente Leica DMLFS</td> con etapa de gel <td>Microscopio Intravital</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>GIBRALTAR Plataforma y sistema de etapa X-Y con placa calefactora adjunta.</td><td>npi electronic GmbH</td><td></td><td>http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html</td></tr><tr><td>Streampix versión 3.17.2 software</td><td>NorPix</td><td></td><td>https://www.norpix.com/</td></tr></tbody></table>

férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro

Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

La trombosis arterial (coágulo de sangre) es una complicación común de muchas enfermedades sistémicas asociadas con la inflamación crónica, como la aterosclerosis, la diabetes, la obesidad, el cáncer y los trastornos reumatológicos autoinmunes crónicos. Los trombos son la causa de la mayoría de los ataques cardíacos, accidentes cerebrovasculares y pérdida de extremidades, lo que hace que la trombosis sea un problema de salud pública extremadamente importante. Dado que estos trombos se derivan de una activación plaquetaria inapropiada y la coagulación posterior, dirigirse terapéuticamente a estos sistemas tiene una importancia clínica importante para el desarrollo de tratamientos más seguros. Debido a las complejidades del sistema hemostático, los experimentos in vitro no pueden replicar las interacciones entre la sangre y la pared de los vasos; Por lo tanto, los estudios in vivo son fundamentales para comprender los mecanismos patológicos de la formación de trombos. Para ello, se han desarrollado varios modelos de trombosis en ratones. Entre ellos, la lesión vascular inducida por cloruro férrico (FeCl3) es un modelo ampliamente utilizado de trombosis oclusiva que informa de la activación y agregación plaquetaria en el contexto de un sistema vascular cerrado aséptico. Este modelo se basa en la lesión de células endoteliales inducida por redox, que es simple y sensible tanto a los fármacos anticoagulantes como a los antiplaquetarios. El tiempo requerido para el desarrollo de un trombo que ocluye el flujo sanguíneo proporciona una medida cuantitativa de la lesión vascular, la activación y la agregación plaquetaria que es relevante para las enfermedades trombóticas. Hemos refinado significativamente este modelo de trombosis vascular inducida por FeCl3, lo que hace que los datos sean altamente reproducibles con una variación mínima. Aquí describimos el modelo y presentamos datos representativos de varios montajes experimentales que demuestran la utilidad de este modelo en la investigación de la trombosis.

La trombosis de la arteria carótida Modelo En ratones C57BL6 con el fondo, se recomienda utilizar 7,5% FeCl3 para el tratamiento de la embarcación durante 1 min como punto de partida. Bajo tratamiento de 7,5% FeCl3, las fronteras de la zona lesionada y la pared vascular normal se identifican fácilmente bajo el microscopio (Ver video en línea 1), lo que sugiere que la capa endotelial fue dañado de manera significativa. El trom...

Se presenta un procedimiento de refinado del cloruro férrico (FeCl3) modelos de trombosis inducidas en la carótida y la arteria mesentérica, así como la vena, que se caracteriza de manera eficiente mediante microscopía intravital para monitorear el tiempo de oclusiva formación de trombos.

Férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, ...

El objetivo general de este procedimiento es producir una trombosis inducida por cloruro férrico en un modelo de arteria carótida de ratón, para obtener resultados altamente reproducibles analizados mediante microscopía intravital. Estos ratones pueden ayudar a responder preguntas clave sobre diversas enfermedades o trastornos genéticos asociados con la activación plaquetaria y la agregación en un sistema vascular cerrado. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla y sensible tanto a fármacos anticoagulantes como antiagregantes plaquetarios, y que puede combinarse con otras técnicas.Este método puede utilizarse para obtener información valiosa sobre la fisiopatología de la trombosis, descubrir nuevos mecanismos y terapias, y evaluar los efectos de fármacos novedosos, incluida la nanomedicina dirigida, sobre la trombosis. La visualización de este método es fundamental para aprender las estrategias que permiten obtener un tiempo preciso de cese del flujo sanguíneo. Tras confirmar la ausencia de respuesta al pellizco en el dedo del pie, utilice pequeñas tijeras eléctricas para animales para eliminar el vello del cuello y la parte superior del tórax de un ratón de ocho a doce semanas de edad.Aplique una pomada ocular neutra de vaselina en los ojos del animal, y sujete al ratón en posición supina sobre la tapa de una placa de cultivo de tejidos de 15 centímetros. Pase una sutura 4-0 alrededor de los incisivos y sujete los extremos de la sutura a la tapa para mantener el cuello recto. A continuación, coloque al animal bajo una fuente de luz quirúrgica y utilice una torunda con alcohol para esterilizar el sitio quirúrgico.A continuación, use fórceps Micro-Adson para sujetar la piel y tijeras quirúrgicas para realizar una incisión de dos a tres milímetros. Sosteniendo la incisión con el fórceps, inserte las tijeras con las hojas cerradas y empuje las tijeras por debajo de la piel hacia el manubrio. Luego, abra las hojas para separar la piel de la capa subcutánea.Ahora, realice una incisión media desde el manubrio hasta el hueso hioides, y utilice un hemostato fino y fórceps Graefe para diseccionar rompiendo la fina fascia entre la glándula submaxilar. Cuando sea visible la tráquea, use el fórceps para sostener el tejido blando a la derecha del manubrio, e inserte el hemostato por debajo de la fascia hacia la posición de las dos en punto. Abra las mandíbulas del hemostato para liberar la vena yugular del tejido circundante.A continuación, continúe el corte a través de la fascia, el tejido blando y la piel hacia la posición de las dos en punto hasta exponer la vena yugular derecha. Ahora, coloque una aguja de calibre 30 unida a una jeringa de un mililitro que contenga 100 microlitros de solución de rodamina 6G, y utilice un portagujas para doblar de dos a tres milímetros de la punta en un ángulo de 90 grados. Luego, sosteniendo la jeringa con una mano y el tejido blando con el sitio distal de la vena yugular con la pinza de Graefe en la otra, introduzca la aguja en el vaso.Estabilice la aguja con la pinza y administre la rodamina. Una vez que se haya inyectado toda la solución de marcado de plaquetas, sujete el sitio de inyección con la pinza para evitar sangrado, abriendo el hemostato e insertando el instrumento debajo de la pinza para ocluir la pared del vaso en el sitio de inyección. Luego, utilice una sutura 6-0 para ligar el sitio de inyección.Disecar en forma roma el tejido blando y la fascia alrededor de la glándula submaxilar izquierda, y tirar de la glándula hacia la posición de las siete en punto para exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo. Luego, disecar en forma roma la fascia entre el músculo esternocleidomastoideo izquierdo y los músculos omohioideo y esternohioideo hacia el lado izquierdo de la tráquea. Una vez desplazada la fascia, pasar una aguja con una sutura de seda 6-0 de 15 centímetros por debajo de la parte media del músculo esternocleidomastoideo, y tirar de los dos extremos de la sutura lateralmente hacia la posición de las diez en punto.Separar directamente los músculos esternohioideo y omohioideo para exponer la arteria carótida. Luego, usar el hemostato para separar el tejido blando de la arteria carótida sin tocar la arteria. Utilizando una pinza de punta fina, levantar la fascia lateral alrededor de la arteria carótida evitando el nervio vago y la arteria.Luego, utilice unas pinzas de punta fina para perforar la fascia entre la arteria carótida y el nervio vago. A continuación, pase un gancho romo a través del orificio para levantar suavemente la arteria carótida y deslice las pinzas de punta fina por debajo de la arteria. Moviendo el gancho y las pinzas en direcciones opuestas a lo largo de la arteria, retire aproximadamente cinco milímetros de tejido blando adventicial del vaso del tejido circundante.Luego, enjuague un trozo de plástico en forma de U con solución salina y use el gancho para levantar suavemente la arteria y permitir la colocación del plástico debajo de la arteria. El plástico bloqueará la fluorescencia de fondo, evitando que la solución de cloruro férrico se difunda hacia los tejidos circundantes, y garantizará que solo la arteria carótida sea visible bajo el microscopio. Hidrate inmediatamente la arteria carótida con dos o tres gotas de solución salina.Luego, transfiera el ratón a la platina de un microscopio fluorescente bajo el objetivo de agua de 10X y llene el espacio entre el objetivo y la arteria con solución salina. Ahora, inicie la aplicación de software para la grabación de video digital y obtenga imágenes del vaso sanguíneo normal. Si la pared del vaso está integrada y no presenta lesiones, transfiera el ratón a la plataforma Gibraltar y use la esquina de una toalla de papel para absorber cuidadosamente la solución salina alrededor de la arteria carótida en el campo quirúrgico sin tocar la arteria.Luego, utilice pinzas de punta fina para transferir un trozo de papel de filtro saturado con cloruro férrico directamente encima de la arteria carótida cerca del extremo distal de la arteria expuesta. Asegúrese de colocar el papel de filtro cerca del extremo distal de la arteria carótida expuesta, lo que dejará un segmento corto en el lado proximal para observar el flujo sanguíneo durante la fase posterior de la lesión. Después de un minuto, retire el papel de filtro y enjuague la arteria con al menos dos mililitros de solución salina.Devuelva el ratón a la platina del microscopio y obtenga imágenes del vaso. La formación del trombo puede identificarse por la acumulación de plaquetas fluorescentes. Continúe obteniendo imágenes del vaso durante 10 segundos cada minuto durante los primeros 10 minutos, seguido de 10 segundos cada dos minutos hasta el final del experimento.La perfusión de activador tisular del plasminógeno cinco minutos después de la lesión con cloruro férrico demuestra el inicio de la trombólisis aproximadamente cuatro minutos después del tratamiento. Durante el período de observación de 30 minutos, se observó que los trombos formados experimentaban variaciones repetidas en su tamaño, pero sin una ablación completa del trombo mediado por plaquetas. El tratamiento con un anticuerpo policlonal contra PAR4 que retrasa el corte de PAR4 prolonga significativamente el tiempo hasta la formación de trombos oclusivos en el modelo de trombosis de la arteria carótida inducida por cloruro férrico.Los experimentos de etiquetado de glóbulos rojos no plaquetarios indican que, aunque los trombos inducidos por cloruro férrico están compuestos exclusivamente por plaquetas adheridas a la pared del vaso, los glóbulos rojos quedan atrapados dentro del trombo, contribuyendo con el tiempo a la forma y a la propiedad oclusiva del coágulo. Curiosamente, aunque el trombo inicial se visualiza aproximadamente a los 15 segundos de la lesión en la arteria y vena mesentéricas, la formación del trombo dentro de los vasos mesentéricos se retrasa notablemente hasta aproximadamente 17 minutos en la vena mesentérica y hasta casi 24 minutos en la arteria mesentérica, debido al menos en parte a la difusión del cloruro férrico a través del tejido adiposo que rodea los vasos mesentéricos.Una vez dominado, este modelo de trombosis inducida por lesión con cloruro férrico puede completarse en aproximadamente de 30 a 60 minutos, dependiendo del dominio alcanzado, siempre que se realice adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la medida que nos permitirá obtener es el tiempo transcurrido desde la lesión hasta la oclusión completa de los vasos, y una observación precisa del flujo sanguíneo es fundamental para obtener resultados exactos. Este modelo puede combinarse con una transfusión de plaquetas silvestres tratadas ex vivo para imitar la ausencia específica de plaquetas y definir así la función de las vías reguladoras y de las plaquetas.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología vascular exploraran no solo el papel de las plaquetas en la trombosis, sino también en diversas condiciones inflamatorias del endotelio. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un modelo de trombosis inducida por cloruro férrico en la arteria carótida de ratones para obtener resultados altamente reproducibles utilizando microscopía intravital. No olvide que el cloruro férrico puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal adecuado, al realizar este modelo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

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En este trabajo se describe el modelo de trombosis inducida por FeCl3 en ratones. Se presenta un método para monitorizar el crecimiento de trombos mediante la observación de microscopía intravital en un vaso mesentérico y mediante la medición del flujo sanguíneo en la arteria carótida.

Trombosis modelo de ratón de la arteria carótida y Mesenterio Embarcaciones inducida por cloruro férrico-

Aquí, presentamos las modificaciones necesarias a un bien caracterizado y utilizado animal inducida por el cloruro férrico (FECLAS3) arteria carótida lesiones modelo pequeño para uso en un modelo de lesión vascular animales grandes. El modelo resultante puede ser utilizado para la evaluación de ensayo preclínico de las intervenciones farmacológicas y mecánicas profilácticas y trombolíticos.

Trombosis de la arteria carótida canina cloruro férrico-inducida: Un modelo Animal grande de lesión Vascular

El presente protocolo describe cómo utilizar una lesión mediada por FeCl3 para inducir trombosis arterial, y cómo recoger y preparar muestras de lesión arterial en diversas etapas de trombosis para el análisis de microscopía electrónica.

Trombosis arterial inducida por cloruro férrico y recolección de muestras para análisis de microscopía electrónica 3D

Este estudio presenta un protocolo para establecer un modelo de rata reproducible y mínimamente invasivo de trombosis del seno sagital superior inducida por cloruro férrico, utilizando un método de sutura de seda en combinación con imágenes láser de contraste moteado y ultrasonidos de alta resolución para su evaluación.

Establecimiento de una trombosis sagital superior modificada inducida por cloruro férrico

La inducción electrolítica de activación endotelial en la superficie interna de la vena cava inferior resultados en la formación de un trombo venoso tipo debido a la activación endotelial y parcial de la estasis sanguínea, dos componentes de la tríada de Virchow.

Electrolítico de la vena cava inferior del modelo (EIM) de la Trombosis Venosa

El modelo de ratón completa estasis de la vena cava inferior trombosis cava produce cantidades cuantificables de los tejidos de la pared venosa y trombosis. Que ha demostrado ser útil para evaluar las interacciones entre la pared de la vena y el trombo oclusivo y en la evaluación de la progresión de la aguda a la inflamación crónica.

Ratón completo modelo de estasis Inferior Vena Cava trombosis

Análisis de contenido de grasa se realiza rutinariamente en los estudios que utilizan modelos murinos de obesidad. Métodos emergentes en pequeños animales y el análisis de imágenes de TC están proporcionando los detalles longitudinal rica análisis de contenido de grasa. A continuación le detallamos paso a paso los procedimientos para la realización de pequeños animales TAC, análisis y visualización.

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.

Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino

Se utilizan modelos preclínicos de hemorragia intracerebral para imitar ciertos aspectos de la enfermedad clínica. Por lo tanto, se pueden explorar los mecanismos de lesión y las posibles estrategias terapéuticas. En este protocolo se describen dos modelos de hemorragia intracerebral, inyecciones intraestriadas (ganglios basales) de sangre autóloga o colagenasa.

Inyección intraestriatal de sangre autóloga o clostridial colagenasa como modelos murinos de la hemorragia intracerebral

El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Aprende a inducir trombosis con cloruro férrico en arterias carótidas y mesentéricas de ratones usando microscopía intravital. Este método permite evaluar fármacos anticoagulantes y antiplaquetarios en tiempo real.

Férricos modelos murinos trombosis inducida por cloruro

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