Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

El objetivo general de este protocolo es fabricar versiones degradables de hidrogeles termosensibles con escalas de longitud y geometrías controladas. Este método puede ayudar a abordar desafíos clave en el escenario de los materiales biomédicos, como facilitar la administración local de fármacos mínimamente invasivos a largo plazo, crear andamios sensibles para la ingeniería de tejidos o diseñar nanoterapias dirigidas. La principal ventaja de nuestra técnica es una química rápida de biohidrazona inversa que nos permite controlar el tamaño y la forma de los hidrogeles degradables cambiando la geometría de mezcla del precursor del polímero.

Esta flexibilidad nos permite fabricar geles fólicos, microgeles, nanogeles y nanofibras, todos con el mismo material de partida. En primer lugar, prepare unos dos mililitros de cada una de las soluciones de polímeros precursores termosensibles funcionalizados con hidazida y aldehído funcionalizado con concentraciones entre el cinco y el 40% en peso y solución salina tamponada con fosfato 10 milimolares. Utilice jeringas de un solo barril para cargar las soluciones de polímeros precursores en cilindros separados de una jeringa de doble cilindro 1:1 de 2,5 mililitros.

A continuación, conecte un mezclador estático de 1,5 pulgadas a una jeringa de doble barril 1:1 de 2,5 mililitros. Si lo desea, conecte una aguja de 1.5 pulgadas de calibre 18 o calibre 20 al mezclador estático. Luego, corte de una lámina suave de caucho de silicona del grosor deseado.

Una pieza del tamaño de un portaobjetos de microscopio estándar. Utilice un juego de punzones para perforar al menos un agujero de la forma deseada en la lámina de caucho de silicona. Coloque el molde de caucho de silicona en un portaobjetos de vidrio limpio, asegurándose de que todos los orificios estén respaldados por el vidrio.

Presione suavemente el molde contra la corredera para fijarlo en su lugar. Las láminas de caucho de silicona también se pueden usar como respaldo para garantizar una buena adherencia del sustrato. Co extruya las soluciones de polímeros funcionalizados con hidrazida y aldehído a través del mezclador estático en los pocillos del molde hasta que los pocillos se llenen por completo.

Cubra el molde con un segundo portaobjetos de vidrio limpio y espere a que termine la gelificación. Luego, retire la corredera superior y use una espátula para separar los hidrogeles del molde de caucho de silicona. Levanta el molde del portaobjetos para recuperar los hidrogeles.

Antes del procedimiento, fabrique un chip microfluídico para la generación de micropartículas. Sintetizar poli NIPAM funcionalizado con hidrazida y aldehído. Para comenzar, prepare dos mililitros cada uno de soluciones de 6% en peso de hidrazida y poli NIPAM funcionalizado con aldehído en agua desionizada.

Cargue las soluciones precursoras del polímero en jeringas separadas de cinco mililitros. A continuación, prepare 150 mililitros de una solución al 1% en peso de monooleato de sorbitán en aceite de parafina espesa. Cargue esta solución en dos jeringas estándar de 60 mililitros.

Monte las cuatro jeringas en bombas de jeringa de infusión separadas. A continuación, conecte un tubo de silicona de 45 centímetros de longitud a la salida del chip microfluídico. Coloque el extremo del tubo de salida en un contenedor de residuos.

Conecte las jeringas de solución de polímero a los canales de entrada de polímero en el chip microfluídico con tubos de silicona de 30 centímetros de longitud. Conecte una jeringa de solución de aceite de parafina al canal de entrada de aceite aguas arriba con un tubo de silicona. Conecte la otra jeringa de aceite a ambos canales de entrada de aceite aguas abajo mediante un tubo de silicona y una junta de jeringa en forma de U.

Ajuste los caudales de las bombas equipadas con jeringas de aceite entre 1,1 y 5,5 mililitros por hora. Haga fluir el aceite a través del chip microfluídico durante al menos 30 minutos para cebar el chip y confirmar que el chip está libre de defectos. A continuación, suministre simultáneamente ambas soluciones poliméricas al chip cebado a 03 mL por hora.

Deje que el flujo de polímero y aceite se equilibre durante 30 minutos a una hora. Para evitar la gelificación prematura de los polímeros precursores en la boquilla microfluídica, es esencial cebar cuidadosamente el tubo e iniciar el flujo de polímero exactamente al mismo tiempo para evitar el reflujo hacia cualquiera de los depósitos de polímero. Una vez que se formen micropartículas de gel uniformes en la boquilla del chip microfluídico, recoja las partículas en un tubo de centrífuga de plástico con una barra de agitación magnética activa.

Detenga las bombas de jeringa y el motor de agitación cuando se haya consumido el aceite. Una vez que las micropartículas de gel se hayan asentado en el tubo, decantar el aceite de parafina con una pipeta. Añadir al matraz 10 mililitros de pentano por cada 5 mL de micropartículas.

Mezcle vigorosamente la emolución durante aproximadamente un minuto. Deje que las partículas se asienten durante una o dos horas antes de decantar el pentano con una pipeta. Repita este lavado de pentano al menos cinco veces.

Transfiera las micropartículas de gel lavadas a un pequeño frasco de centelleo de vidrio. Vuelva a suspender las partículas en uno o dos mililitros de agua desionizada. Para comenzar este procedimiento, prepare cinco mililitros cada uno de soluciones al 1% de hidrazida y poli NIPAM funcionalizado con aldehído en agua desionizada.

Caliente cinco mililitros de la solución de poli NIPAM funcionalizada con hidrazida a 70 grados centígrados mientras revuelve. Monitoree la solución a medida que se vuelve opaca y confirme que no se forme ningún precipitado visible. A continuación, añada 0,25 mililitros de la solución de poli NIPAM funcionalizada con aldehído gota a gota a la solución de poli NIPAM funcionalizada con hidrazida calentada en el transcurso de cinco a 10 segundos.

Remueve la mezcla durante 15 minutos a 70 grados centígrados. Luego, retire la mezcla del baño de aceite y deje que se enfríe a temperatura ambiente durante la noche para obtener los nanogeles para la purificación. Coloque la mezcla de nano gel en una membrana de diálisis cortada de 3500 kilodalton de peso molecular.

Diálisis los nanogeles contra el agua dionizada seis veces durante ciclos de seis horas para eliminar los polímeros no reticulados. Si lo desea, liofililice los nanogeles purificados para su almacenamiento. Para comenzar el procedimiento de fabricación de nanofibras en gel, prepare un mililitro de soluciones al 15% en peso de hidrazida y POEGMA funcionalizado con aldehído en agua desionizada.

Luego, prepare dos mililitros de una solución al 5% en peso de óxido de polietileno de alto peso molecular en agua desionizada. Combine cada solución precursora de POEGMA con un mililitro de la solución de óxido de polietileno. Cargue las soluciones precursoras en barriles separados de la jeringa de doble barril.

A continuación, conecte un mezclador estático de 1,5 pulgadas y una aguja de calibre 18 con punta roma a una jeringa de doble cilindro 1:1 de 2,5 mililitros. Monte la jeringa de doble barril en una bomba de jeringa de infusión. Luego, monte un colector de electrospinning de disco de aluminio a 10 centímetros del extremo de la aguja.

Conecte a tierra una fuente de alimentación de alto voltaje en el colector y conecte la fuente de alimentación a la aguja. Ajuste la bomba de jeringa a 0,48 mililitros por hora y la fuente de alimentación a 10 kilovoltios. Encienda simultáneamente la bomba de jeringa y la fuente de alimentación para iniciar el electrohilado.

Continúe hasta alcanzar el espesor deseado o hasta que se agoten los precursores. Una vez finalizada la producción de nanofibras, apague y desconecte el conjunto de electrohilado. Remoje las nanofibras de gel recolectadas en agua desionizada durante 24 horas para eliminar el óxido de polietileno.

La administración de jeringa de doble barril produjo hidra-geles a granel POEGMA reticulados con hidrazona con una variedad de mecánicas, tiempos de gelificación y transparencias según la concentración del polímero precursor, la densidad del grupo funcional reactivo y el número de unidades repetidas de óxido de etileno en los monómeros. Los caudales tanto del aceite de parafina como de las soluciones de precursores poliméricos afectaron a los tamaños de las micropartículas de gel de poli NIPAM reticuladas de hidrozona fabricadas con el dispositivo microfluídico. Se observó hinchazón reversible dependiente de la temperatura con microscopía óptica de etapa caliente.

Las micropartículas de gel se degradaron a sus precursores oligoméricos con el tiempo. Los tamaños de los nanogeles de poli NIPAM reticulados de hidrazona autoensamblados variaron con la relación entre el precursor y la masa del polímero funcionalizado de aldehído a hidrazida, pero permanecieron altamente monodispersos. A medida que aumentaba la relación de masa, se observó menos deshinchamiento térmico.

Al igual que las micropartículas de gel, los nanogeles se degradaron a los precursores oligoméricos con el tiempo. Las nanofibras de hidrogel POEGMA reticulado con diámetros del orden de 300 nanómetros se produjeron mediante electrohilado reactivo. La hidratación de las nanofibras fue aproximadamente dos órdenes de magnitud más rápida que la hidratación de un gel a granel con la misma composición polimérica.

Las nanofibras conservaron su morfología nanofibrosa durante más de ocho semanas antes de degradarse en condiciones fisiológicas. La degradación más rápida se produjo en ambientes ácidos. Las nanofibras eran mecánicamente robustas tanto en el estado seco como en el hinchado.

Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo crear hidrogeles degradables y termosensibles mediante el control de la geometría en la que se fabrican los polímeros precursores del gel. Recuerde asegurarse de que el tiempo de gelificación del precursor del polímero coincida con las necesidades de cada partícula. La gelificación demasiado rápida inhibirá la fabricación de microgel y nanofibras.

Una gelificación demasiado lenta dará lugar a las morfologías completamente congénitas. Estas técnicas allanan el camino para los investigadores en las áreas de administración de fármacos e ingeniería de tejidos. y diseñar andamios de hidrogel bien definidos para controlar la velocidad o la ubicación de la liberación del fármaco o estimular la regeneración de tejidos.