Detección de la actividad dependiente del pH de Escherichia coli Acompañante HdeB In Vitro y En Vivo

El objetivo general de estos ensayos in vivo e in vitro de chaperonas es caracterizar la actividad dependiente del pH de la chaperona HdeB de Escherichia coli en condiciones de pH ácido. Las chaperonas activadas por ácido solo tienen un trabajo que hacer, necesitan proteger las proteínas contra el despliegue y la degradación de proteínas inducidos por ácido. Esta función es particularmente importante para las bacterias entéricas, que tienen que sobrevivir al ambiente ácido del estómago si quieren colonizar con éxito el intestino.

Los métodos que presentamos aquí permiten identificar y caracterizar las chaperonas activadas por ácido, y definir las condiciones de pH que conducen a su activación. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo caracterizar las chaperonas, como HdeB in vitro e in vivo, lo que te ayuda a descifrar el mecanismo de su activación. Estos métodos se han aplicado con éxito para otras chaperonas protectoras de ácidos, como la HDA, y pueden modificarse aún más para trabajar con otras chaperonas y/o condiciones de estrés.

Se monitoriza la influencia del HdeB purificado en la agregación de la malato deshidrogenasa mitocondrial porcina que se despliega térmicamente a diferentes valores de pH. MDH dializado a cuatro grados Celsius durante la noche contra cuatro litros de tampón C. A continuación, concentre la proteína a aproximadamente 100 micromolares utilizando unidades de filtro centrífugo con un corte de peso molecular de 30 kilodaltons. Para eliminar los agregados, centrifugar la proteína durante 20 minutos a 20.000 veces G a cuatro grados centígrados.

Determine la concentración de MDH por absorbancia a 280 nanomolares. A continuación, prepare 50 micro litros de alícuotas de MDH y congele rápidamente las alícuotas para su almacenamiento. Coloque una cubeta de cuarzo de un mililitro en un espectrofotómetro fluorescente equipado con portamuestras y agitadores con control de temperatura.

Establezca la longitud de onda de excitación y admisión en 350 nanómetros. Añada a la cubeta los volúmenes adecuados de tampón D precalentado a los valores de pH deseados. El volumen total es de 1.000 microlitros.

Ajuste la temperatura en el soporte de cubetas a 43 grados centígrados. Añada 12,5 micromolares de HdeB al tampón, seguido de la adición de 0,5 micromolares de MDH. Comience a monitorear la dispersión de la luz.

Incubar la reacción durante 360 segundos para permitir un despliegue suficiente de MDH. Eleve el pH a siete agregando un volumen de 0,16 a 0,34 de fosfato dipotásico no tamponado de dos molares, y continúe registrando la dispersión de la luz durante otros 440 segundos. Analice los datos tal y como se describe en el protocolo de texto.

Transformar el plásmido que expresa HdeB o el control vectorial MD, PBAD 18, en la cepa BB7224 Delta RPOH utilizando células químicamente competentes. Esta cepa es sensible a la temperatura y debe cultivarse a 30 grados centígrados. Después de 45 segundos de choque térmico a 42 grados centígrados y antes de la siembra, incube las células a 30 grados centígrados y 200 RPM.

Realice una sola colonia de clones positivos e incube durante la noche a 30 grados centígrados. Prepare un cultivo nocturno en 50 mililitros de LB con ampicilina y cultive las células a 200 RPM y 30 grados centígrados. Diluir durante la noche los cultivos 40 veces en 25 mililitros de LB con ampicilina.

Cultive las bacterias en presencia de 0,5% de arabinosa a 30 grados Celsius y 200 RPM a una densidad óptica de 600 nanómetros, o OD 600 igual a 1,0, para inducir la expresión de la proteína HDEB. Para los experimentos de cambio de pH, use LB con ampicilina y arabinosa para diluir las células a un OD 600 de 0.5. Ajuste a los valores de pH respectivos agregando volúmenes apropiados de ácido clorhídrico de cinco molares.

Después de los puntos de tiempo indicados, neutralice los cultivos mediante la adición de los volúmenes apropiados de hidróxido de sodio de cinco molares. Monitoree el crecimiento de los cultivos neutralizados y el cultivo líquido durante 12 horas a 30 grados Celsius utilizando mediciones de OD. Para investigar el pH óptimo de la actividad chaperona de HdeB in vitro, el MDH nativo se diluyó en un tampón precalentado del pH indicado en presencia o ausencia de HdeB.

Después de 360 segundos de incubación, se desencadenó la agregación de MDH a 43 grados Celsius a través de la neutralización. En presencia de HdeB, la señal de dispersión de la luz disminuye significativamente tras la neutralización a partir de un pH cuatro, lo que indica que HdeB evita la agregación de MDH. Las mediciones de agregación son muy sensibles a los cambios en la temperatura o en el contenido de tampón.

Para eliminar los resultados falsos positivos, se investigó la influencia del búfer de almacenamiento de acompañantes en la agregación de clientes. El búfer de almacenamiento HdeB no tuvo ningún efecto en la agregación de MDH. Para investigar los efectos del HdeB in vivo, se realizaron ensayos de supervivencia dependientes del pH utilizando la cepa de deleción de RPOH sensible a la temperatura.

Esta cepa carece de la mayoría de las chaperonas y, por lo tanto, es más susceptible a temperaturas elevadas, pH bajo o estrés oxidado. La sobreexpresión de HdeB en condiciones de pH neutro no mostró ningún efecto sobre la tasa de crecimiento de la cepa, que creció comparativamente bien con la cepa de control que alberga el vector vacío, PBAD 18. Por el contrario, se encontraron claras diferencias en su capacidad para reanudar el crecimiento con los tratamientos con pH tres o pH cuatro, con la cepa de sobreexpresión de HdeB mostrando una recuperación mejorada de forma reproducible con el tratamiento de pH bajo en comparación con la cepa de control.

Una vez dominado, la purificación se puede realizar en tres días, el ensayo de dispersión in vitro en un día y los ensayos de supervivencia in vivo en dos días si se realiza correctamente. Cuando realices estos experimentos, asegúrate de considerar cuidadosamente tu diseño experimental, tanto en lo que respecta al tipo de proteínas cliente, sus concentraciones como las condiciones tampón que utilizas. La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a obtener una comprensión más detallada sobre el mecanismo de activación de las chaperonas y sus efectos en un contexto in vivo.

Y no olvide que estudiar el pH óptimo de una chaperona protectora de ácidos puede ser todo un desafío. Esto se debe a que es probable que el comportamiento de agregación de la proteína cliente que utilice también cambie con el pH. Por lo tanto, asegúrese de elegir sistemas tampón que sean adecuados tanto para la chaperona como para la proteína cliente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de espín por página SCS, en la supresión mediada por chaperonas autocuantificadas de la agregación de clientes.