La extracción de sustancias poliméricas extracelulares estructural de lodo granular aerobio
26 de septiembre de 2016
El protocolo proporciona una metodología para solubilizar lodo granular aeróbico con el fin de extraer los polímeros extracelulares de alginato-como (ALE).
El objetivo general del siguiente experimento es mostrar una metodología de extracción para obtener sustancias extracelulares poliméricas estructurales, o EPS, a partir de bioespumas, específicamente de lodo granular aeróbico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del lodo granular, como comprender el proceso de granulación y analizar la composición de las EPS.
La principal ventaja de esta técnica es que la presencia de polímeros formadores de gel en el EPS se puede probar en poco tiempo. Centrifugue el lodo granular a 4.000 × g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos, y deseche el sobrenadante. Recoja los gránulos en el sedimento para la extracción.
Caliente 150 mililitros de agua del grifo en un vaso de vidrio de 1.000 mililitros sobre un agitador magnético hasta 80 grados Celsius. Transfiera tres gramos de gránulos a un matraz bafado de 250 mililitros y complete el matraz hasta 50 mililitros con agua desmineralizada. Añada 0,67 gramos de carbonato de sodio decahidratado al matraz para obtener una concentración de carbonato de sodio al 0,5% peso por volumen.
Coloque el matraz que contiene la mezcla en el baño de agua. Cubra el matraz y el vaso de precipitados por separado con papel de aluminio, para evitar la evaporación. Agite la mezcla durante 35 minutos a 400 RPM y 80 grados Celsius.
Transfiera la mezcla a un tubo de centrifugación de 50 mililitros. Centrifugue el tubo que contiene la mezcla a 4.000 × g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Recopile el sobrenadante y deseche el sedimento.
El paso de diálisis es opcional para obtener EPS estructural a partir de lodo granular aeróbico. Sin embargo, tiene varias ventajas que se describen en el protocolo. Pipetee el sobrenadante en una bolsa de diálisis, con un límite de peso molecular de 3.500 daltons, y realice la diálisis durante 24 horas frente a 1000 ml de agua ultra pura.
Cambie el agua de diálisis después de 12 horas para mejorar el efecto de la diálisis. Transfiera el extracto dializado a un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml y agite lentamente la extracción a 100 rpm y temperatura ambiente. Monitoree constantemente los cambios de pH con un electrodo de pH, mientras añade ácido clorhídrico 1 molar hasta alcanzar un pH final de 2,2 05 para obtener ale en su forma ácida.
Después de ajustar el pH a 2,2, transfiera el extracto a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifugue a 4000 × g y cuatro grados Celsius durante veinte minutos. Deseche el sobrenadante y recoja el sedimento con aspecto de gel. El sedimento con aspecto de gel es ale en forma ácida.
Para obtener la forma sódica del ale, agregue lentamente hidróxido de sodio 0,5 molar al gel, mientras mezcla el gel lentamente con un bastón de vidrio a mano hasta alcanzar un pH de 8,5. Utilizando una pipeta de Pasteur, gotee lentamente el extracto de ale sódico en una solución de cloruro de calcio. Si el EPS extraído tiene propiedades formadoras de geles hidrogeles iónicos, se formarán perlas esféricas con forma de gota.
Alternativamente, si el EPS extraído no tiene propiedades de formación de geles hidrogeles iónicos, el extracto se dispersará en la solución de cloruro de calcio. Mantenga las perlas de hidrogel y la solución de cloruro de calcio durante 30 minutos. Utilice una cuchara para retirar las perlas de hidrogel de la solución de cloruro de calcio y transfiéralas a una solución de EDTA.
Guarde las perlas de hidrogel en 10 ml de solución de EDTA durante tres horas a cuatro grados Celsius. Esta prueba demuestra un ejemplo de las pruebas de estabilidad descritas en el protocolo. Observe si hay desintegración visible de las perlas durante este almacenamiento, para evaluar si las perlas pueden soportar estas condiciones.
Si la extracción fue exitosa, el lodo granular aeróbico se solubilizará después del paso de extracción alcalina, y se obtendrá un pellet tras acidificar y centrifugar los EPS extraídos. Si los EPS extraídos son EPS estructurales y tienen la capacidad de formar hidrogeles con iones calcio, se formarán perlas de gel al gotear los EPS extraídos en la solución de calcio. Si se extraen EPS que no tienen esta capacidad de formación de geles, la solución de EPS se dispersará en la solución de calcio.
Después de ver este video, usted debería ser capaz de realizar la extracción de EPS estructurales del lodo granular aeróbico. También debería ser capaz de evaluar la capacidad gelificante de los EPS obtenidos con iones calcio. Optamos por mostrar esta metodología de extracción para ilustrar el impacto de la técnica de extracción sobre los EPS obtenidos del lodo granular aeróbico.
Además, queríamos demostrar que ninguna técnica de extracción de EPS es universalmente aplicable.
Descripción general
Este protocolo describe una metodología para extraer polímeros extracelulares tipo alginato (ALE) a partir de lodo granular aeróbico. El proceso de extracción está diseñado para mejorar la comprensión de la composición y propiedades de las sustancias poliméricas extracelulares (EPS).
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biotecnología
- Ciencias ambientales
Antecedentes
- Las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) desempeñan un papel crucial en la formación y estabilidad de los biofilms.
- El lodo granular aeróbico es una tecnología prometedora para el tratamiento de aguas residuales.
- Comprender la composición de las EPS puede proporcionar información sobre el proceso de granulación.
- Evaluar las propiedades formadoras de gel de las EPS puede tener implicaciones para diversas aplicaciones.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una metodología confiable para la extracción de EPS a partir de lodo granular aeróbico.
- Analizar las propiedades estructurales de los EPS extraídos.
- Evaluar la capacidad de formación de geles de los EPS extraídos con iones calcio.
Métodos Utilizados
- Centrifugación del lodo granular para separar el sobrenadante y el sedimento.
- Extracción alcalina utilizando carbonato de sodio para solubilizar los EPS.
- Dialización para purificar los EPS extraídos.
- Ajuste de pH para obtener formas similares a alginato de los EPS.
Resultados principales
- Extracción exitosa de gránulos de aspecto gelatinoso que indican la presencia de ALE.
- Demostración de las propiedades formadoras de gel cuando el EPS se mezcla con cloruro de calcio.
- Evaluación de la estabilidad de las perlas de hidrogel bajo diversas condiciones.
- Información sobre el impacto de la técnica de extracción en las propiedades del EPS.
Conclusiones
- La metodología desarrollada extrae eficazmente el EPS del lodo granular aeróbico.
- Comprender las propiedades del EPS puede orientar investigaciones futuras en el tratamiento de aguas residuales.
- Se necesitan estudios adicionales para explorar la aplicabilidad de esta técnica de extracción.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La extracción y caracterización de sustancias poliméricas extracelulares estructurales (EPS) del lodo granular aeróbico permite una interrogación precisa de los componentes de la matriz del biofilm relevantes para el bioprocesamiento y la biotecnología ambiental. La capacidad de aislar polímeros similares a alginato que forman geles (ALE) apoya la reducción mecanicista de riesgos en flujos de trabajo donde la composición de EPS afecta la estabilidad del proceso y las propiedades del material. Esta metodología orienta la validación inicial de objetivos y la estandarización para el desarrollo de ensayos posteriores en líneas de biofármacos y biotecnología industrial.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis directo de la composición de EPS para aclarar las vías estructurales del biofilm.
- Apoya la validación funcional de polímeros formadores de geles esenciales para la integridad del biofilm.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de protocolos de extracción para matrices biológicas complejas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona extractos estandarizados de EPS para ensayos posteriores reproducibles.
- Permite la evaluación cuantitativa de la capacidad gelificante mediante la formación de perlas inducida por calcio.
- Facilita la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma mediante la definición de parámetros de extracción.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los resultados de la extracción con modelos de biopelículas relevantes para la enfermedad o para el proceso, según corresponda.
- Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la caracterización consistente del EPS.
- Reduce la ambigüedad mecanicista en las intervenciones dirigidas a biopelículas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo de extracción sitúa el aislamiento de EPS en la interfaz entre el descubrimiento temprano y el desarrollo de ensayos, apoyando flujos de trabajo desde la prueba de hipótesis hasta la validación de modelos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: aclara el papel del EPS estructural en la formación y estabilidad del biofilm.
- Selección: proporciona lecturas cuantitativas reproducibles en forma de gel para análisis comparativo.
- Análisis: ofrece resultados medibles como la estabilidad de las perlas y los umbrales de solubilización.
- Investigación Traducional: permite alinear la extracción de EPS con modelos relevantes de biofilm o materiales.
- Reutilización Empresarial: establece una capacidad estandarizada de extracción para diversas aplicaciones de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en los estudios de biopelículas relacionados con EPS.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización en los flujos de trabajo de extracción y ensayo.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o no continuar en el desarrollo de procesos dirigidos a biopelículas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de iniciativas de I+D centradas en biopelículas y EPS.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de biopelículas y técnicas de extracción de polímeros.
- Necesita acceso a instrumentación para centrifugación, control de pH y diálisis.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de extracción y pruebas de estabilidad.
- Puede requerir adaptación para diferentes sistemas de lodo o biopelículas según la composición de la matriz.
- La eficacia de la extracción y la evaluación de la formación de geles dependen del método y no son universalmente transferibles.
