Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

El objetivo general de este procedimiento es verificar el efecto de las láminas de células madre derivadas del tejido adiposo combinadas con piel artificial en la cicatrización de heridas para un gran defecto cutáneo de espesor completo en ratas diabéticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la cicatrización de una herida crónica, como una herida diabética grande con hueso expuesto. La principal ventaja de esta técnica es que las células se trasplantan a la herida en láminas sólidas mediante la tecnología de láminas celulares, y el resultado es un trasplante viable y estable.

Para un donante de almohadillas de grasa, planee usar ratas Lewis de ocho a 33 semanas de edad. En el sitio quirúrgico, tenga listos varios aplicadores estériles con punta de algodón, gasas, un bisturí, un portaagujas, tijeras de operación, un par de pinzas y una sutura de nailon 5-0. Para la colocación temporal de pañuelos, cargue una placa de Petri de 100 mililitros con 10 mililitros de PBS.

Pese el plato cargado con PBS para luego encontrar la masa del tejido recolectado. Después de anestesiar a la rata, colóquela en decúbito supino sobre un paño estéril. A continuación, afeitar la zona operatoria y frotar la piel expuesta con varios exfoliantes alternos de etanol al 70%.

Ahora, haz una incisión de tres centímetros en la piel lateral inferior del abdomen. A continuación, exponga y diseccione el músculo oblicuo externo. Luego, exponer el tejido adiposo del epidídimo que rodea el epidídimo.

A continuación, extirpe cuidadosamente el tejido adiposo del epidídimo. Evite dañar el epidídimo, los testículos y los vasos sanguíneos del epidídimo. Transfiera el pañuelo al plato de PBS.

Luego, cierre la rata donante y siga las prácticas estándar de cuidado postoperatorio. Aísle los ASC de dos a tres gramos de tejido adiposo recolectado. Digierir el tejido durante una hora en colagenasa tipo A al 0,1% para obtener la fracción vascular estromal, o SVF.

Después de purificar el SVF, suspenda el SVF en 20 mililitros de medio. Divida la suspensión en dos placas de cultivo de 60 centímetros cuadrados y cultívelas durante 24 horas en condiciones estándar. Al día siguiente, lave las placas con PBS tres veces para eliminar las células y los residuos sueltos.

Después del lavado final, vuelva a agregar medio completo fresco. Luego, continúe pasando las celdas hasta que estén casi subconfluentes en el tercer día de cultivo. A continuación, se utiliza un mililitro de EDTA al 0,25% de tripsina en una breve incubación.

Retire las células de la placa. No permita que las células se expongan a la tripsina activa durante más de 10 minutos. Después de observar y contar las células, subcultívelas a una densidad de 1.700 por centímetro cuadrado.

Luego, pase las celdas cada tres días y complete tres pasajes antes de continuar. Después de pasar las ASC de rata subcultivadas por tercera vez, coloque 150.000 células en una placa de cultivo sensible a la temperatura de 35 milímetros de diámetro y dos mililitros de medio de cultivo. Cultive la placa durante tres días en una incubadora para hacer una hoja de células uniforme.

Tres días después, cambie el medio y agregue 16,4 microgramos por mililitro de AA. A continuación, cultive las células, cambiando el medio AA cada dos días. Después de cuatro o cinco días en el medio que contiene AA, verifique la proliferación de las ASC. Busque espacios entre las celdas y la hoja de celdas contigua.

Una vez que se establece una hoja de celdas contigua, las celdas se pueden usar para el modelo. Cuando sea necesario, recoja la lámina de celdas colocando la placa a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Debido a que la placa es sensible a la temperatura, las células se desprenderán espontáneamente como una lámina contigua y la lámina se puede quitar con pinzas.

Para el modelo de cicatrización de heridas de obesidad, utilice ratas ZDF macho adultas, de 16 a 18 semanas de edad y con un peso de entre 500 y 600 gramos. Coloque y anestesie la rata en el campo quirúrgico, y antes de afeitar la cabeza, límpiela con etanol al 70%. A continuación, afeitar la zona operatoria y limpiar la piel expuesta con exfoliantes alternos de etanol al 70%.

Alrededor de este tiempo, transfiera la placa sensible a la temperatura de las células madre adiposas al banco. Antes de que la lámina de celdas se desprenda de la placa, retire el medio y lave la lámina de celdas con PBS tres veces. Después de recoger la hoja de celda, sumérjala en PBS hasta que la necesite.

Una vez que las células estén listas, haz un defecto de piel de 15 por 10 milímetros de espesor completo en la cabeza de la rata. En primer lugar, retire el tejido cutáneo hasta el periostio. A continuación, extirpe la piel de un tejido cutáneo con un bisturí y unas tijeras quirúrgicas.

Para completar el defecto, retire el periostio con el raspador perióstico. A continuación, coloque la lámina de celda sobre el defecto. La lámina de células madre es suave y flexible.

Use fórceps para extenderlo a todos los rincones del defecto. Ahora, cubra la lámina de células y el defecto con un parche de 10 por 15 milímetros de piel artificial empapada en solución salina justo antes de usar, y cierre la herida con aproximadamente 10 puntos con sutura de nailon 5-0. Para proteger la herida, use una sutura de nailon 5-0 para asegurar un parche de 15 por 20 milímetros de apósito no adhesivo sobre la piel artificial.

Planee observar el vendaje cada dos días, porque la rata invariablemente lo quitará y, si es necesario, reemplazará el vendaje de inmediato. En dos grupos de seis ratas grasas diabéticas Zucker, se utilizó el protocolo descrito para crear un defecto del cráneo. Las ratas experimentales fueron tratadas con una lámina de células madre adiposas de rata, y los controles no.

Después de 14 días, las heridas del grupo de tratamiento eran significativamente más pequeñas que las de los controles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer una herida grande con hueso expuesto en ratas y luego tratar esa herida con células madre derivadas del tejido adiposo. Al intentar este procedimiento, asegúrese de utilizar una gestión estricta de la temperatura durante todo el proceso de uso de placas de cultivo sensibles a la temperatura.

De lo contrario, las células podrían desprenderse espontáneamente de los platos, retrasando sus experimentos.