Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

El objetivo general de este método es etiquetar anticuerpos con colorantes fluorescentes a partir de muestras purificadas o directamente a partir de medio celular utilizando perlas magnéticas de proteína A o G. Este método puede utilizarse para optimizar la química de etiquetado incluso de pequeñas cantidades de anticuerpos presentes en el medio celular, lo que conduce a una mejor aplicación posterior de los anticuerpos.

Las principales ventajas de esta técnica son que los anticuerpos no requieren purificación, se puede utilizar química de aminas o tioles, y el método puede ser automatizado o manual. Comience por resuspender uniformemente las perlas con agitación suave. Luego, agregue 50 microlitros de perlas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

A continuación, coloque el tubo en un soporte magnético. Después de 10 segundos, reemplace cuidadosamente el tampón de almacenamiento con 250 microlitros de tampón de unión de anticuerpos y mezcle bien las perlas. Después de otros 10 segundos, reemplace cuidadosamente el tampón de unión con un mililitro del anticuerpo de interés.

Y mezcle la muestra durante 60 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque nuevamente los tubos en el imán y retire el sobrenadante cuando las perlas hayan migrado hacia los lados del tubo. Luego, enjuague la mezcla de perlas y anticuerpo mediante dos lavados de 10 segundos cada uno, utilizando 250 µL de tampón de lavado para unión de anticuerpos por cada lavado.

Para etiquetar los anticuerpos utilizando química de aminas, después del segundo lavado, sustituya el tampón de lavado por 100 microlitros de tampón de conjugación de aminas y agregue 2,5 microlitros de colorante reactivo a aminas recién preparado por cada 100 microgramos de anticuerpo. Vortexee la muestra durante 60 minutos a temperatura ambiente para mantener las perlas en suspensión durante la etiquetación. Luego, coloque el tubo nuevamente sobre el imán durante 10 segundos y retire el sobrenadante.

Lave las perlas dos veces con tampón de lavado para la unión de anticuerpos, tal como se acaba de demostrar. A continuación, sustituya el tampón de lavado por 50 microlitros de tampón de elución y mezcle las perlas durante cinco minutos. Regrese el tubo al imán durante 10 segundos y transfiera el anticuerpo eluido a un nuevo tubo de microcentrifugado que contenga cinco microlitros de tampón de neutralización.

Eluir el anticuerpo una vez más, como se acaba de demostrar, recolectando las muestras eluidas. Luego, medir la absorbancia del conjugado de anticuerpo y colorante a 280 nanómetros y a la lambda máxima para el colorante. Para etiquetar los anticuerpos utilizando química de tiol, después del segundo lavado, reemplazar el tampón de lavado con 250 microlitros de tampón de conjugación de tiol y mezclar las perlas con pipeteo suave.

Después de 10 segundos, lave las perlas dos veces con tampón de lavado para unión de anticuerpos. Luego, reemplace el tampón de lavado con 100 microlitros de tampón de conjugación con tiol y agregue DTT hasta una concentración final de 2,5 milimolar. Incube las perlas durante otros 60 minutos.

Luego, coloque nuevamente las perlas en el imán durante 10 segundos y deseche el tampón. A continuación, añada 250 microlitros de tampón de conjugación con tiol a las perlas con mezcla suave. Después de 10 segundos, lave las perlas dos veces con tampón de lavado para unión de anticuerpos, reemplazando el segundo lavado con 100 microlitros de tampón de conjugación con tiol fresco.

Ahora, agregue 2,5 µL de colorante reactivo con tiol recién preparado por cada 100 µg de anticuerpo y mezcle las perlas durante 60 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque el tubo en el imán durante 10 segundos. Y reemplace el sobrenadante con 250 µL de tampón fresco de conjugación con tiol, mezclando suavemente.

Después de 10 segundos, lave las perlas dos veces. Luego, sustituya el tampón de lavado con 50 microlitros de tampón de elución y eluya el anticuerpo conjugado dos veces, tal como se acaba de demostrar. A continuación, mida la absorbancia del conjugado de anticuerpo-colorante a 280 nanómetros y a la lambda máxima del colorante.

La fuerte afinidad entre los anticuerpos y la proteína G, la elevada afinidad del imán por las perlas y la optimización del método antes de la purificación con perlas resultan conjuntamente en una pérdida nominal de anticuerpo durante la reacción de marcado, como lo demuestra la recuperación eficiente de tres isotipos diferentes de anticuerpos de ratón tras el marcado fluorescente doble en comparación con la purificación simple. Esta recuperación también se observa en geles de Coomassie, donde las bajas propiedades de unión no específica de las perlas magnéticas de proteína G producen la presencia de cadenas pesadas y ligeras altamente purificadas y marcadas con fluorescencia doble. El marcado sobre perlas con perlas magnéticas de proteína A también es compatible con múltiples colorantes fluorescentes, lo que resulta en una alta recuperación y buenas relaciones de colorante por anticuerpo.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos o tres horas, si se realiza correctamente. Permite manejar múltiples muestras manualmente o mediante una plataforma automatizada para mejorar el rendimiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las perlas magnéticas siempre en suspensión.

Seleccione el volumen adecuado de perlas magnéticas para la muestra y optimice la cantidad de colorante fluorescente para el anticuerpo de interés. Tras seguir este procedimiento, los anticuerpos marcados deben probarse para determinar su funcionalidad mediante ensayos biológicos pertinentes, como ELISA, citometría de flujo o ensayos basados en células.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo marcar anticuerpos purificados y no purificados con etiquetas fluorescentes u otras moléculas pequeñas, como biotina o fármacos citotóxicos, utilizando perlas magnéticas de Proteína A o G.