Name: La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a detectar E. coli mediante una prueba de tornasol modificada que utiliza DNAzimas específicas y ureasas para producir un cambio de color visible. Este método rápido y sencillo permite la detección de bacterias en aplicaciones de punto de atención.

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La financiación para este proyecto de investigación fue proporcionada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a través de una Beca de Descubrimiento para YL.

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+sense+and+sensibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biosensors: sense and sensibility.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).</li>
<li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li>
<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+catalytic+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nucleic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional nucleic acid sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La traducción de la acción de la actividad RNA escisión de una ADNzima bacteria sensible a una prueba de fuego se hace posible mediante el uso de la ureasa y la separación magnética, como se ilustra en la Figura 1. Aunque la demostración de la prueba de fuego modificado para la detección bacteriana es hecho con una E. coli dependiente de ARN de escisión ADNzima, 5,19,20 el diseño en general se puede ampliarse para cualquier ADNzima ARN de escisión. Dada la gran disponibilidad de DNAz...

Los patógenos bacterianos son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad mundial. Los brotes de infecciones adquiridas en el hospital, patógenos transmitidos por los alimentos y contaminantes bacterianos en el medio ambiente plantean amenazas graves y continuas para la salud y la seguridad públicas. Para prevenir estos brotes, se necesitan herramientas eficaces que permitan la detección de patógenos de manera oportuna en una variedad de entornos. Las pruebas sencillas pero eficaces, que son portátiles y rentables, son muy codiciadas, especialmente en las regiones que son susceptibles a los brotes pero que no pueden permitirse costosas instalaciones de pruebas. 1-3 Aunque existe una multitud de métodos para detectar bacterias, muchos de ellos no son adecuados como herramientas de detección o pruebas in situ porque requieren largos tiempos de prueba, instrumentos costosos y procedimientos de prueba complicados. 
Las pruebas colorimétricas son particularmente atractivas para aplicaciones en el punto de atención o en el campo, ya que los cambios de color se pueden detectar fácilmente a simple vista. La prueba de fuego para el pH es simple, rápida y efectiva. Aunque es una tecnología muy antigua, sigue siendo muy utilizada hoy en día debido a su simplicidad y efectividad. Sorprendentemente, esta simple prueba nunca se había modificado para lograr la detección de otros analitos antes de que recientemente desarrolláramos un enfoque de modificación de esta prueba para las pruebas de E. coli. 4
La prueba de tornasol ampliada para E. coli emplea tres componentes adicionales: una DNAzima de escisión de ARN activada por E. coli (EC1), 5 ureasa y perlas magnéticas. Las DNAzimas se refieren a moléculas sintéticas de ADN monocatenario con actividad catalítica. 6 Se pueden aislar de grupos de ADN de secuencia aleatoria mediante selección in vitro. 7,8 Son muy estables y pueden producirse de forma rentable mediante la síntesis de ADN automatizada de alta eficiencia. 9 Por estas razones, las DNAzimas, en particular las DNAzimas que escindien el ARN, han sido ampliamente examinadas para aplicaciones de biodetección. Se han desarrollado 6,10,11 sensores de ADN que escindien el ARNzyme para detectar iones metálicos,12-16 moléculas pequeñas,17,18 patógenos bacterianos5,19-21 y células cancerosas. 22 Dada la gran disponibilidad de ADNzimas de escisión de ARN inducidas por el objetivo, cualquier ensayo que utilice una DNAzima puede ampliarse potencialmente para detectar una amplia gama de analitos.
La ureasa se elige por su capacidad para hidrolizar la urea en amoníaco,23,24 lo que resulta en un aumento del pH. La ureasa también es altamente eficiente, estable y susceptible de conjugación con otras biomoléculas. Por lo tanto, postulamos que un conjugado de una DNAzima de escisión de ARN con ureasa permitiría el uso de la prueba de fuego para la detección de otros objetivos. 5
La acción de la DNAzima que escinde el ARN se transmite al aumento del pH mediado por la ureasa mediante el uso de perlas magnéticas que se inmovilizan con el conjugado DNAzyme-ureasa. Debido a que la actividad de la DNAzima bajo investigación depende estrictamente de E. coli, la presencia de esta bacteria en la solución de prueba dará lugar a la liberación de ureasa de las perlas magnéticas a la solución, que luego se toma y se utiliza para hidrolizar urea en una solución reportera que contiene un colorante sensible al pH. El resultado final de este procedimiento es un cambio de color que puede ser reportado convenientemente por el tinte o el papel de pH.

<table><tbody><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% solución de acrilamida/bisacrilamida (29:1)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Bioshop Canadá inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xilenecianol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% dodecil sulfato de sodio</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanoácido sulfónico (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (II) hexahidratado</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio trihidrato (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Alcoholes comerciales</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>tetrametileetilendiamina (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio al 10% (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidilo 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Ureasa</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Rojo de fenol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampón de reacción de polinucleótido quinasa</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampón de reacción de ADN ligasa</td> Bio <td>Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa (5 U/&#956; l)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Caldo</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleótido quinasa (10 U/&#956; l)</td> <td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Placas de vidrio</td><td>CBS scientific</td><td>NGP-250NR</td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores de 0,75 mm de espesor</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>Peine de 12 pocillos</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara UV UVP</td><td></td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Placa metálica</td><td>CBS scientific</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Filtros centrífugos MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack de separación magnética</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa (0.22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultivo de 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Limpiador ultrasónico</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cámara (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Cada vez hay más demanda de métodos sencillos pero eficaces que puedan utilizarse para detectar patógenos específicos en aplicaciones de punto de atención o de campo. Estos métodos deben ser fáciles de usar y producir resultados fiables que puedan ser fácilmente interpretados tanto por especialistas como por no profesionales. La prueba de tornasol para el pH es simple, rápida y efectiva, ya que informa el pH de una muestra de prueba a través de un simple cambio de color. Hemos desarrollado un enfoque para aprovechar la prueba de fuego para la detección de bacterias. El método explota una DNA escindidora de ARN específica de una bacteria para lograr dos funciones: reconocer una bacteria de interés y proporcionar un mecanismo para controlar la actividad de la ureasa. Mediante el uso de perlas magnéticas inmovilizadas con un conjugado DNAzima-ureasa, la presencia de bacterias en una muestra de prueba se transmite a la liberación de ureasa de las perlas a la solución. La ureasa liberada se transfiere a una solución de prueba para hidrolizar la urea en amoníaco, lo que resulta en un aumento del pH que se puede visualizar mediante la clásica prueba de tornasol.

El principio de la prueba de fuego bacteriano se explica en la Figura 1 La prueba utiliza tres materiales principales:. Una ADNzima RNA-cleaving que se activa por una bacteria específica, ureasa y perlas magnéticas. La ADNzima se utiliza como el elemento de reconocimiento molecular para lograr una detección altamente específica de una bacteria de interés. La ureasa y perlas magnéticas se utilizan para conseguir la transducción de señales de la actividad de ARN-escisión d...

Describimos un protocolo para la detección colorimétrica de E. coli utilizando una prueba de fuego modificada que aprovecha una DNAzima que escinde el ARN, ureasa y perlas magnéticas.

La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

El objetivo general de este experimento es demostrar una prueba de litmus modificada y sencilla para la detección bacteriana. Este método describe cómo una enzima de ADN que corta ARN activada por E.coli puede acoplarse con una plataforma de transducción de señales basada en ureasa para generar un cambio de color en respuesta a E.coli. Las dos principales ventajas de esta técnica son la simplicidad de la prueba y su aplicabilidad a otras enzimas de ADN que cortan ARN y responden a analitos.El procedimiento será demostrado por Seperh Manchehry y Dingran Chang, estudiantes de posgrado del laboratorio del Dr. Yingfu Li en la Universidad McMaster. Después de preparar los reactivos y tampones según el protocolo descrito, prepare una solución stock de succinimidil 4-ciclohexano-1-carboxilato, o SMCC, disolviendo un miligramo de SMCC en 676 microlitros de DMSO. Agite en vórtex y coloque en hielo hasta su uso.Disuelva un miligramo de ureasa en un mililitro de PBS 1x y colóquelo también en hielo hasta su uso. Para sintetizar el ADN de ureasa, o UrDNA, agregue 10 microlitros de LD1 100 micromolar a un tubo microcentrífugo de 2,5 mililitros. Luego, agregue 140 microlitros de agua doblemente destilada y 40 microlitros de PBS 10x y vortexee.A continuación, agregue 80,5 µL del stock de SMCC y 159,5 µL de DMSO. Luego, vortexee nuevamente y use una centrífuga de banco para hacer un breve centrifugado. Incube la reacción a 37 °C en un incubador o bloque térmico durante 60 minutos.Después de la incubación, agregue 200 microlitros de PBS 1x, 60 microlitros de acetato de sodio tres molar y 1,5 mililitros de etanol frío al 100 % al tubo. Mezcle mediante vortex, e incube la reacción a menos 20 grados Celsius durante 30 minutos. Centrifugue la solución a 20.000 ×g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.Luego, retire el sobrenadante y seque el precipitado al vacío. Al precipitado seco, agregue 400 microlitros de stock de ureasa e incube a temperatura ambiente durante 5 horas. Transfiera 200 microlitros del conjugado crudo a una columna centrífuga de filtro con corte de peso molecular de 100.000 previamente lavada.Centrifugar la columna a 14.000 × g durante cinco minutos. Transferir los 200 microlitros restantes del conjugado crudo a la columna y centrifugar a 14.000 × g durante cinco minutos. A continuación, retirar la columna y colocarla boca abajo en un nuevo tubo colector de microcentrífuga de dos mililitros.Centrifugar la columna invertida y el tubo a 1.000 × g durante dos minutos. Después de retirar el tubo de recolección, añadir 30 microlitros de PBS 1x a la columna centrífuga para lavar la membrana y obtener una recuperación adicional de los conjugados. Volver a invertir la columna y colocarla nuevamente en el tubo de recolección.Centrifugar la columna a 1.000 × g durante dos minutos. Retirar y desechar la columna. Almacenar el UrDNA a cuatro grados Celsius hasta su uso.Para ensamblar una DNAzima activada por E.coli que escinde ARN, o EC1, y UrDNA en perlas magnéticas, mezcle bien el stock de perlas magnéticas y transfiera 100 microlitros de la suspensión de perlas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Luego, coloque el tubo en un soporte para rack magnético para aislar las perlas. Retire el sobrenadante mediante pipeteo y agregue 150 microlitros de tampón de unión, o BB, al tubo.Retire el tubo del soporte y golpee suavemente el tubo para volver a suspender las perlas en una solución homogénea. Después de repetir la lavado con BB dos veces más con las perlas en suspensión con BB, agregue 10 microlitros de EC1 a 10 micromolar. Mezcle cuidadosamente golpeando suavemente el tubo.Incube la solución con agitación suave durante 30 minutos. Para evitar la agregación de las perlas, golpee suavemente el tubo cada dos o tres minutos. A continuación, coloque el tubo de microcentrífuga nuevamente en el soporte magnético para aislar las perlas y retire el sobrenadante mediante pipeteo.Luego, use 150 microlitros de BB para lavar las perlas tres veces. Una vez completado el lavado, suspenda las perlas en un total de 150 microlitros de BB. A esta solución, agregue 15 microlitros de UrDNA y caliente la muestra a 45 grados Celsius durante dos minutos, luego enfríe la solución a temperatura ambiente e incube durante dos horas. Coloque el tubo de microcentrífuga nuevamente en el soporte magnético para aislar las perlas y retire el sobrenadante mediante pipeteo.Añada 100 microlitros de tampón de reacción, o RB, luego retire el tubo del soporte magnético y re-suspenda cuidadosamente las perlas. Después de preparar las células de E.coli según el protocolo descrito en el texto, pre-lave un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros añadiendo y agitando mediante vortex 100 microlitros de RB. A continuación, deseche el tampón. Añada 15 microlitros del EC1 ensamblado al tubo lavado, luego coloque el tubo en el soporte magnético y aspire el sobrenadante.Retire el tubo del soporte, agregue 100 microlitros de RB y re-suspenda cuidadosamente las perlas magnéticas. Después de lavar las perlas con RB dos veces más y eliminar el RB, agregue 10 microlitros de la muestra de E.coli al tubo y mezcle suavemente el contenido golpeando ligeramente el tubo. A continuación, incube la reacción a temperatura ambiente durante una hora.Después de la incubación, agregue 90 microlitros de agua doblemente destilada y coloque el tubo en el soporte magnético. Tras aproximadamente tres minutos de separación magnética, transfiera cuidadosamente 85 microlitros del sobrenadante a un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros. Es muy importante pipetear la solución con cuidado sin aspirar ninguna de las perlas magnéticas.Estas perlas están cargadas con ureasa y generarán una señal falsa positiva. Añada 15 microlitros de rojo de fenol al 0,04 % y 100 microlitros de solución de sustrato. Luego, tome fotografías en intervalos de tiempo específicos para registrar el cambio de color.El color inicial de la prueba de tornasol debe ser amarillo, lo que indica un pH de la solución por debajo de 5,5. Si es necesario, el pH inicial de la prueba de tornasol puede ajustarse con un tampón débil, como tampón de acetato de sodio uno milimolar a pH cinco. Esta figura muestra los resultados de la prueba bacteriana de tornasol, en la que se utilizó como DNAzima la DNAzima rompedora de ARN activada por E.coli EC1 y como indicador de pH se utilizó rojo de fenol.Como lo muestra la ausencia de cambio de color en ausencia de E.coli, EC1 es altamente específico y presenta una actividad mínima frente a otras bacterias. La intensidad del cambio de color depende tanto del número de células de E.coli utilizadas en el paso de activación del DNAcima como del tiempo permitido para la hidrólisis de la urea. Un mayor número de células de E.coli produce un cambio de color más intenso, y un tiempo más prolongado para la hidrólisis de la urea permite la detección de un número menor de células.Este gráfico muestra el cambio de pH medido mediante un pH-metro portátil. La presencia de 10 a la siete células de E.coli provocó un aumento gradual del pH de tres unidades en 10 minutos. En contraste, la ausencia de E.coli no causó cambios detectables de pH en las mismas condiciones.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la ureasa es muy activa, y un lavado deficiente o una contaminación conducirán a un falso positivo. Tras seguir este procedimiento, este método puede realizarse para probar la presencia de E. coli en condiciones más relevantes, como en la evaluación de la calidad del agua ambiental.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo aprovechar una prueba sencilla de papel tornasol para la detección de E.coli. No olvide que esta prueba puede utilizarse para detectar E.coli patógena, la cual es extremadamente peligrosa. Debe recibir capacitación en seguridad biológica antes de realizar cualquiera de las pruebas para bacterias patógenas.

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Investigación

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Biología

Un método simple para la identificación de los patógenos bacterianos prioridad es el uso de fagos reportero de la ingeniería genética. Estos fagos reportero, que son específicos de su especie huésped particular, son capaces de transducir una respuesta rápida de la señal bioluminiscente a las células huésped. En este documento, se describe el uso de fagos reportero para la detección...

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Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

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Este video muestra un método colorimétrico de detección de E. coli, que involucra un biomarcador de E. coli que activa una DNAzyme, lo que lleva a la escisión del enlace de ARN y al desprendimiento de un conjugado DNAzyme-ureasa. Un ensayo colorimétrico posterior detecta el biomarcador de E. coli a través de los cambios de pH inducidos por el amoníaco.

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Este video demuestra la detección cuantitativa de bacterias multiplexadas empleando microesferas de poliestireno magnético carboxilado teñidas en conjuntos distintos. El procedimiento abarca la formación de complejos de perlas y bacterias, la separación magnética y el análisis basado en flujo, lo que permite la cuantificación precisa y simultánea de múltiples bacterias en el mismo pozo de reacción.

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Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped.

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A diferencia de la observada para eucariotas, hay una escasez de estudios que despolarización detalle de la membrana y la concentración de iones cambios en las bacterias, principalmente como su pequeño tamaño hace que los métodos convencionales de medición de difícil. En este sentido, los protocolos de detalle para el seguimiento de estos eventos en el Gram-positivas patógeno significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescencia.

Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de tintes fluorescentes

Aquí se presenta un protocolo que implica la concentración integrada, el enriquecimiento y la detección colorimétrica de puntos finales de patógenos transmitidos por los alimentos en grandes volúmenes de agua agrícola.  El agua se filtra a través de hisopos de Moore modificados (MMS), enriquecidos con medios selectivos o no selectivos, y la detección se realiza mediante dispositivos analíticos basados en papel (μPAD) incrustados con sustratos colorimétricos indicativos de bacterias.

Colorimétrico Papel a base de Detección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp,. Y<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; De grandes volúmenes de agua en la agricultura

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la motilidad bacteriana basada en una reacción de color. Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y más preciso, y no requiere equipo especializado.

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Aprende a detectar E. coli mediante una prueba de tornasol modificada que utiliza DNAzimas específicas y ureasas para producir un cambio de color visible. Este método rápido y sencillo permite la detección de bacterias en aplicaciones de punto de atención.

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