La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

El objetivo general de este experimento es demostrar una prueba de litmus modificada y sencilla para la detección bacteriana. Este método describe cómo una enzima de ADN que corta ARN activada por E.coli puede acoplarse con una plataforma de transducción de señales basada en ureasa para generar un cambio de color en respuesta a E.coli. Las dos principales ventajas de esta técnica son la simplicidad de la prueba y su aplicabilidad a otras enzimas de ADN que cortan ARN y responden a analitos.

El procedimiento será demostrado por Seperh Manchehry y Dingran Chang, estudiantes de posgrado del laboratorio del Dr. Yingfu Li en la Universidad McMaster. Después de preparar los reactivos y tampones según el protocolo descrito, prepare una solución stock de succinimidil 4-ciclohexano-1-carboxilato, o SMCC, disolviendo un miligramo de SMCC en 676 microlitros de DMSO. Agite en vórtex y coloque en hielo hasta su uso.

Disuelva un miligramo de ureasa en un mililitro de PBS 1x y colóquelo también en hielo hasta su uso. Para sintetizar el ADN de ureasa, o UrDNA, agregue 10 microlitros de LD1 100 micromolar a un tubo microcentrífugo de 2,5 mililitros. Luego, agregue 140 microlitros de agua doblemente destilada y 40 microlitros de PBS 10x y vortexee.

A continuación, agregue 80,5 µL del stock de SMCC y 159,5 µL de DMSO. Luego, vortexee nuevamente y use una centrífuga de banco para hacer un breve centrifugado. Incube la reacción a 37 °C en un incubador o bloque térmico durante 60 minutos.

Después de la incubación, agregue 200 microlitros de PBS 1x, 60 microlitros de acetato de sodio tres molar y 1,5 mililitros de etanol frío al 100 % al tubo. Mezcle mediante vortex, e incube la reacción a menos 20 grados Celsius durante 30 minutos. Centrifugue la solución a 20.000 ×g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Luego, retire el sobrenadante y seque el precipitado al vacío. Al precipitado seco, agregue 400 microlitros de stock de ureasa e incube a temperatura ambiente durante 5 horas. Transfiera 200 microlitros del conjugado crudo a una columna centrífuga de filtro con corte de peso molecular de 100.000 previamente lavada.

Centrifugar la columna a 14.000 × g durante cinco minutos. Transferir los 200 microlitros restantes del conjugado crudo a la columna y centrifugar a 14.000 × g durante cinco minutos. A continuación, retirar la columna y colocarla boca abajo en un nuevo tubo colector de microcentrífuga de dos mililitros.

Centrifugar la columna invertida y el tubo a 1.000 × g durante dos minutos. Después de retirar el tubo de recolección, añadir 30 microlitros de PBS 1x a la columna centrífuga para lavar la membrana y obtener una recuperación adicional de los conjugados. Volver a invertir la columna y colocarla nuevamente en el tubo de recolección.

Centrifugar la columna a 1.000 × g durante dos minutos. Retirar y desechar la columna. Almacenar el UrDNA a cuatro grados Celsius hasta su uso.

Para ensamblar una DNAzima activada por E.coli que escinde ARN, o EC1, y UrDNA en perlas magnéticas, mezcle bien el stock de perlas magnéticas y transfiera 100 microlitros de la suspensión de perlas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Luego, coloque el tubo en un soporte para rack magnético para aislar las perlas. Retire el sobrenadante mediante pipeteo y agregue 150 microlitros de tampón de unión, o BB, al tubo.

Retire el tubo del soporte y golpee suavemente el tubo para volver a suspender las perlas en una solución homogénea. Después de repetir la lavado con BB dos veces más con las perlas en suspensión con BB, agregue 10 microlitros de EC1 a 10 micromolar. Mezcle cuidadosamente golpeando suavemente el tubo.

Incube la solución con agitación suave durante 30 minutos. Para evitar la agregación de las perlas, golpee suavemente el tubo cada dos o tres minutos. A continuación, coloque el tubo de microcentrífuga nuevamente en el soporte magnético para aislar las perlas y retire el sobrenadante mediante pipeteo.

Luego, use 150 microlitros de BB para lavar las perlas tres veces. Una vez completado el lavado, suspenda las perlas en un total de 150 microlitros de BB. A esta solución, agregue 15 microlitros de UrDNA y caliente la muestra a 45 grados Celsius durante dos minutos, luego enfríe la solución a temperatura ambiente e incube durante dos horas. Coloque el tubo de microcentrífuga nuevamente en el soporte magnético para aislar las perlas y retire el sobrenadante mediante pipeteo.

Añada 100 microlitros de tampón de reacción, o RB, luego retire el tubo del soporte magnético y re-suspenda cuidadosamente las perlas. Después de preparar las células de E.coli según el protocolo descrito en el texto, pre-lave un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros añadiendo y agitando mediante vortex 100 microlitros de RB. A continuación, deseche el tampón. Añada 15 microlitros del EC1 ensamblado al tubo lavado, luego coloque el tubo en el soporte magnético y aspire el sobrenadante.

Retire el tubo del soporte, agregue 100 microlitros de RB y re-suspenda cuidadosamente las perlas magnéticas. Después de lavar las perlas con RB dos veces más y eliminar el RB, agregue 10 microlitros de la muestra de E.coli al tubo y mezcle suavemente el contenido golpeando ligeramente el tubo. A continuación, incube la reacción a temperatura ambiente durante una hora.

Después de la incubación, agregue 90 microlitros de agua doblemente destilada y coloque el tubo en el soporte magnético. Tras aproximadamente tres minutos de separación magnética, transfiera cuidadosamente 85 microlitros del sobrenadante a un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros. Es muy importante pipetear la solución con cuidado sin aspirar ninguna de las perlas magnéticas.

Estas perlas están cargadas con ureasa y generarán una señal falsa positiva. Añada 15 microlitros de rojo de fenol al 0,04 % y 100 microlitros de solución de sustrato. Luego, tome fotografías en intervalos de tiempo específicos para registrar el cambio de color.

El color inicial de la prueba de tornasol debe ser amarillo, lo que indica un pH de la solución por debajo de 5,5. Si es necesario, el pH inicial de la prueba de tornasol puede ajustarse con un tampón débil, como tampón de acetato de sodio uno milimolar a pH cinco. Esta figura muestra los resultados de la prueba bacteriana de tornasol, en la que se utilizó como DNAzima la DNAzima rompedora de ARN activada por E.coli EC1 y como indicador de pH se utilizó rojo de fenol.

Como lo muestra la ausencia de cambio de color en ausencia de E.coli, EC1 es altamente específico y presenta una actividad mínima frente a otras bacterias. La intensidad del cambio de color depende tanto del número de células de E.coli utilizadas en el paso de activación del DNAcima como del tiempo permitido para la hidrólisis de la urea. Un mayor número de células de E.coli produce un cambio de color más intenso, y un tiempo más prolongado para la hidrólisis de la urea permite la detección de un número menor de células.

Este gráfico muestra el cambio de pH medido mediante un pH-metro portátil. La presencia de 10 a la siete células de E.coli provocó un aumento gradual del pH de tres unidades en 10 minutos. En contraste, la ausencia de E.coli no causó cambios detectables de pH en las mismas condiciones.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la ureasa es muy activa, y un lavado deficiente o una contaminación conducirán a un falso positivo. Tras seguir este procedimiento, este método puede realizarse para probar la presencia de E. coli en condiciones más relevantes, como en la evaluación de la calidad del agua ambiental.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo aprovechar una prueba sencilla de papel tornasol para la detección de E.coli. No olvide que esta prueba puede utilizarse para detectar E.coli patógena, la cual es extremadamente peligrosa. Debe recibir capacitación en seguridad biológica antes de realizar cualquiera de las pruebas para bacterias patógenas.