Name: La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a detectar E. coli mediante una prueba de tornasol modificada que utiliza DNAzimas específicas y ureasas para producir un cambio de color visible. Este método rápido y sencillo permite la detección de bacterias en aplicaciones de punto de atención.

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La financiación para este proyecto de investigación fue proporcionada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a través de una Beca de Descubrimiento para YL.

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<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
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<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
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<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
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<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La traducción de la acción de la actividad RNA escisión de una ADNzima bacteria sensible a una prueba de fuego se hace posible mediante el uso de la ureasa y la separación magnética, como se ilustra en la Figura 1. Aunque la demostración de la prueba de fuego modificado para la detección bacteriana es hecho con una E. coli dependiente de ARN de escisión ADNzima, 5,19,20 el diseño en general se puede ampliarse para cualquier ADNzima ARN de escisión. Dada la gran disponibilidad de DNAz...

Los patógenos bacterianos son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad mundial. Los brotes de infecciones adquiridas en el hospital, patógenos transmitidos por los alimentos y contaminantes bacterianos en el medio ambiente plantean amenazas graves y continuas para la salud y la seguridad públicas. Para prevenir estos brotes, se necesitan herramientas eficaces que permitan la detección de patógenos de manera oportuna en una variedad de entornos. Las pruebas sencillas pero eficaces, que son portátiles y rentables, son muy codiciadas, especialmente en las regiones que son susceptibles a los brotes pero que no pueden permitirse costosas instalaciones de pruebas. 1-3 Aunque existe una multitud de métodos para detectar bacterias, muchos de ellos no son adecuados como herramientas de detección o pruebas in situ porque requieren largos tiempos de prueba, instrumentos costosos y procedimientos de prueba complicados. 
Las pruebas colorimétricas son particularmente atractivas para aplicaciones en el punto de atención o en el campo, ya que los cambios de color se pueden detectar fácilmente a simple vista. La prueba de fuego para el pH es simple, rápida y efectiva. Aunque es una tecnología muy antigua, sigue siendo muy utilizada hoy en día debido a su simplicidad y efectividad. Sorprendentemente, esta simple prueba nunca se había modificado para lograr la detección de otros analitos antes de que recientemente desarrolláramos un enfoque de modificación de esta prueba para las pruebas de E. coli. 4
La prueba de tornasol ampliada para E. coli emplea tres componentes adicionales: una DNAzima de escisión de ARN activada por E. coli (EC1), 5 ureasa y perlas magnéticas. Las DNAzimas se refieren a moléculas sintéticas de ADN monocatenario con actividad catalítica. 6 Se pueden aislar de grupos de ADN de secuencia aleatoria mediante selección in vitro. 7,8 Son muy estables y pueden producirse de forma rentable mediante la síntesis de ADN automatizada de alta eficiencia. 9 Por estas razones, las DNAzimas, en particular las DNAzimas que escindien el ARN, han sido ampliamente examinadas para aplicaciones de biodetección. Se han desarrollado 6,10,11 sensores de ADN que escindien el ARNzyme para detectar iones metálicos,12-16 moléculas pequeñas,17,18 patógenos bacterianos5,19-21 y células cancerosas. 22 Dada la gran disponibilidad de ADNzimas de escisión de ARN inducidas por el objetivo, cualquier ensayo que utilice una DNAzima puede ampliarse potencialmente para detectar una amplia gama de analitos.
La ureasa se elige por su capacidad para hidrolizar la urea en amoníaco,23,24 lo que resulta en un aumento del pH. La ureasa también es altamente eficiente, estable y susceptible de conjugación con otras biomoléculas. Por lo tanto, postulamos que un conjugado de una DNAzima de escisión de ARN con ureasa permitiría el uso de la prueba de fuego para la detección de otros objetivos. 5
La acción de la DNAzima que escinde el ARN se transmite al aumento del pH mediado por la ureasa mediante el uso de perlas magnéticas que se inmovilizan con el conjugado DNAzyme-ureasa. Debido a que la actividad de la DNAzima bajo investigación depende estrictamente de E. coli, la presencia de esta bacteria en la solución de prueba dará lugar a la liberación de ureasa de las perlas magnéticas a la solución, que luego se toma y se utiliza para hidrolizar urea en una solución reportera que contiene un colorante sensible al pH. El resultado final de este procedimiento es un cambio de color que puede ser reportado convenientemente por el tinte o el papel de pH.

<table><tbody><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% solución de acrilamida/bisacrilamida (29:1)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Bioshop Canadá inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xilenecianol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% dodecil sulfato de sodio</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanoácido sulfónico (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (II) hexahidratado</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio trihidrato (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Alcoholes comerciales</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>tetrametileetilendiamina (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio al 10% (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidilo 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Ureasa</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Rojo de fenol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampón de reacción de polinucleótido quinasa</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampón de reacción de ADN ligasa</td> Bio <td>Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa (5 U/&#956; l)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Caldo</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleótido quinasa (10 U/&#956; l)</td> <td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Placas de vidrio</td><td>CBS scientific</td><td>NGP-250NR</td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores de 0,75 mm de espesor</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>Peine de 12 pocillos</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara UV UVP</td><td></td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Placa metálica</td><td>CBS scientific</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Filtros centrífugos MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack de separación magnética</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa (0.22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultivo de 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Limpiador ultrasónico</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cámara (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Cada vez hay más demanda de métodos sencillos pero eficaces que puedan utilizarse para detectar patógenos específicos en aplicaciones de punto de atención o de campo. Estos métodos deben ser fáciles de usar y producir resultados fiables que puedan ser fácilmente interpretados tanto por especialistas como por no profesionales. La prueba de tornasol para el pH es simple, rápida y efectiva, ya que informa el pH de una muestra de prueba a través de un simple cambio de color. Hemos desarrollado un enfoque para aprovechar la prueba de fuego para la detección de bacterias. El método explota una DNA escindidora de ARN específica de una bacteria para lograr dos funciones: reconocer una bacteria de interés y proporcionar un mecanismo para controlar la actividad de la ureasa. Mediante el uso de perlas magnéticas inmovilizadas con un conjugado DNAzima-ureasa, la presencia de bacterias en una muestra de prueba se transmite a la liberación de ureasa de las perlas a la solución. La ureasa liberada se transfiere a una solución de prueba para hidrolizar la urea en amoníaco, lo que resulta en un aumento del pH que se puede visualizar mediante la clásica prueba de tornasol.

El principio de la prueba de fuego bacteriano se explica en la Figura 1 La prueba utiliza tres materiales principales:. Una ADNzima RNA-cleaving que se activa por una bacteria específica, ureasa y perlas magnéticas. La ADNzima se utiliza como el elemento de reconocimiento molecular para lograr una detección altamente específica de una bacteria de interés. La ureasa y perlas magnéticas se utilizan para conseguir la transducción de señales de la actividad de ARN-escisión d...

Describimos un protocolo para la detección colorimétrica de E. coli utilizando una prueba de fuego modificada que aprovecha una DNAzima que escinde el ARN, ureasa y perlas magnéticas.

La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

El objetivo general de este experimento es demostrar una prueba de litmus modificada y sencilla para la detección bacteriana. Este método describe cómo una enzima de ADN que corta ARN activada por E.coli puede acoplarse con una plataforma de transducción de señales basada en ureasa para generar un cambio de color en respuesta a E.coli. Las dos principales ventajas de esta técnica son la simplicidad de la prueba y su aplicabilidad a otras enzimas de ADN que cortan ARN y responden a analitos.El procedimiento será demostrado por Seperh Manchehry y Dingran Chang, estudiantes de posgrado del laboratorio del Dr. Yingfu Li en la Universidad McMaster. Después de preparar los reactivos y tampones según el protocolo descrito, prepare una solución stock de succinimidil 4-ciclohexano-1-carboxilato, o SMCC, disolviendo un miligramo de SMCC en 676 microlitros de DMSO. Agite en vórtex y coloque en hielo hasta su uso.Disuelva un miligramo de ureasa en un mililitro de PBS 1x y colóquelo también en hielo hasta su uso. Para sintetizar el ADN de ureasa, o UrDNA, agregue 10 microlitros de LD1 100 micromolar a un tubo microcentrífugo de 2,5 mililitros. Luego, agregue 140 microlitros de agua doblemente d

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Investigación

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Biología

Un método simple para la identificación de los patógenos bacterianos prioridad es el uso de fagos reportero de la ingeniería genética. Estos fagos reportero, que son específicos de su especie huésped particular, son capaces de transducir una respuesta rápida de la señal bioluminiscente a las células huésped. En este documento, se describe el uso de fagos reportero para la detección...

&quot;Bioluminiscente &#39;reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

Se describe un método de ensayo sensor electroquímico para la detección e identificación bacteriana rápida. El ensayo implica una serie de sensores funcionalizado con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN para ARN ribosomal (ARNr) secuencias específicas de la especie. Sandwich hibridación de ARNr objetivo con la sonda de captura y una sonda de oligonucleótido detector de ADN unido a peroxidasa de rábano picante produce una corriente amperométrica medible.

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Este video describe un ensayo colorimétrico para la medición de lactato en lisados celulares mediante el uso de la enzima lactato deshidrogenasa. Esta enzima convierte el lactato en piruvato, junto con la conversión de NAD en NADH que reacciona con los colorantes de tetrazolio y da un producto coloreado que se puede medir espectrofotométricamente para cuantificar el lactato.

Ensayo colorimétrico para la cuantificación de lactato en muestras de ensayo

Este video muestra un método colorimétrico de detección de E. coli, que involucra un biomarcador de E. coli que activa una DNAzyme, lo que lleva a la escisión del enlace de ARN y al desprendimiento de un conjugado DNAzyme-ureasa. Un ensayo colorimétrico posterior detecta el biomarcador de E. coli a través de los cambios de pH inducidos por el amoníaco.

Detección colorimétrica de un biomarcador bacteriano mediante una prueba de tornasol modificada

Este video demuestra la detección cuantitativa de bacterias multiplexadas empleando microesferas de poliestireno magnético carboxilado teñidas en conjuntos distintos. El procedimiento abarca la formación de complejos de perlas y bacterias, la separación magnética y el análisis basado en flujo, lo que permite la cuantificación precisa y simultánea de múltiples bacterias en el mismo pozo de reacción.

Detección cuantitativa multiplexada de bacterias mediante microesferas magnéticas marcadas con colorantes

Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped.

Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

A diferencia de la observada para eucariotas, hay una escasez de estudios que despolarización detalle de la membrana y la concentración de iones cambios en las bacterias, principalmente como su pequeño tamaño hace que los métodos convencionales de medición de difícil. En este sentido, los protocolos de detalle para el seguimiento de estos eventos en el Gram-positivas patógeno significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescencia.

Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de tintes fluorescentes

Aquí se presenta un protocolo que implica la concentración integrada, el enriquecimiento y la detección colorimétrica de puntos finales de patógenos transmitidos por los alimentos en grandes volúmenes de agua agrícola.  El agua se filtra a través de hisopos de Moore modificados (MMS), enriquecidos con medios selectivos o no selectivos, y la detección se realiza mediante dispositivos analíticos basados en papel (μPAD) incrustados con sustratos colorimétricos indicativos de bacterias.

Colorimétrico Papel a base de Detección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp,. Y<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; De grandes volúmenes de agua en la agricultura

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la motilidad bacteriana basada en una reacción de color. Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y más preciso, y no requiere equipo especializado.

Visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color

Aprende a detectar E. coli mediante una prueba de tornasol modificada que utiliza DNAzimas específicas y ureasas para producir un cambio de color visible. Este método rápido y sencillo permite la detección de bacterias en aplicaciones de punto de atención.

La detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de fuego

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