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El objetivo general de este experimento es estudiar las consecuencias sobre la integridad y la permeabilidad de las células endoteliales tras su interacción con linfocitos T activados. Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la neuroinmunología, como por ejemplo cómo afecta la interacción directa entre linfocitos T y células endoteliales a la integridad y permeabilidad de la barrera hematoencefálica. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación automatizada y en tiempo real de la función de la barrera tras la modulación específica de la interacción entre linfocitos T y células endoteliales.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de trastornos autoinmunes del SNC, ya que proporciona información sobre la ruptura de la barrera hematoencefálica mediada por linfocitos T, un paso crucial en la patogénesis de estas enfermedades. Este método se centra en las propiedades de la barrera hematoencefálica marina durante la EAE. Sin embargo, también puede aplicarse a modelos de barrera hematoencefálica roja o humana, así como a estudios de otros trastornos autoinmunes del SNC.

Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido a posibles problemas con el momento óptimo para combinar el cultivo primario de células endoteliales y la activación de linfocitos T. Desarrollamos este método por primera vez cuando iniciamos la investigación sobre los efectos de distintos niveles de activación de linfocitos T en las propiedades de la barrera hematoencefálica durante la EAE, un modelo animal de la esclerosis múltiple. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el establecimiento de cultivos co-cultivos de linfocitos T y células endoteliales es difícil de aprender, porque pequeñas variaciones iniciales de T entre pozos pueden llevar posteriormente a representaciones erróneas de los resultados.

Para comenzar este procedimiento, en el día cinco después del aislamiento de MBMEC, recubra los insertos permeables con 80 microlitros de solución de recubrimiento de MBMEC por inserto. Incúbelos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante tres horas. Después de eliminar la solución de recubrimiento de MBMEC de los insertos, lave las MBMEC agregando dos mililitros de PBS a temperatura ambiente a cada pozo, aspire después de un minuto y luego repita este procedimiento una vez más.

A continuación, agregue 0,05 % de tripsina-EDTA a 300 microlitros por pocillo e incube durante cinco a diez minutos. Posteriormente, agregue dos mililitros de medio MBMEC a cada pocillo para detener la tripsinización. Luego, transfiera las células recolectadas a un tubo de centrifugación de 15 mililitros y centrifugue la muestra a 700 × g durante ocho minutos a cuatro grados Celsius.

Después de ocho minutos, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de medio MBMEC sin puromicina. Para contar las células, mezcle 90 microlitros de azul de tripano al 0,04 % con 10 microlitros de suspensión celular; luego, pipete 10 microlitros de la mezcla entre la cubierta de vidrio y el hemocitómetro.

A continuación, siembre dos veces 10 a la cuarta células por inserto. Añada 810 microlitros de medio MBMEC al compartimento inferior de cada pocillo y coloque la placa con los insertos en el incubador hasta que esté listo para proceder con la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER). Para estimular las células T positivas para CD4, recubra previamente una placa de 96 pocillos con fondo redondo con anticuerpo anti-CD3 de ratón purificado a una concentración final deseada durante tres horas a 37 grados Celsius.

Después de aislar los linfocitos T, lave la placa recubierta dos veces con PBS. A continuación, agregue el anticuerpo anti-CD28 purificado a los linfocitos T aislados a una concentración final deseada y mezcle bien. Luego, incube los linfocitos T y déjelos a 37 grados Celsius durante dos o tres días.

Para configurar la medición de la resistencia transepitelial (TEER), coloque el módulo de 24 pocillos del instrumento TEER en la cabina de flujo laminar. Retire las tapas y coloque los insertos con MBMEC en el instrumento, utilizando pinzas. A continuación, agregue mediante pipeta 810 microlitros de medio fresco al compartimento inferior de los pocillos del módulo, añadiendo cuidadosamente el medio entre el inserto y la pared del pocillo del módulo.

A continuación, cierre las tapas y coloque el instrumento en el incubador. Conecte el instrumento al ordenador. Luego, encienda el controlador del instrumento y abra el software.

En la ventana emergente, seleccione "Nueva medición" y marque las casillas "Mostrar TER" y "Mostrar Ccl". Luego, presione inicio. Después de completar la primera medición, seleccione "Marcar todos los pocillos" en la pestaña Resultados para ver todos los valores de TEER y Ccl.

A continuación, guarde el archivo. Luego, elija el punto temporal para co-cultivar MBMECs con linfocitos T cuando Ccl sea estable y menor a un microfaradio por centímetro cuadrado y cuando la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) haya alcanzado su nivel máximo. Revise cuidadosamente los valores absolutos de TEER y Ccl, y excluya los pocillos en los que las MBMECs no hayan desarrollado monocapas suficientemente confluentes desmarcando dichos pocillos.

Agrupe el resto de los pocillos haciendo clic con el botón derecho en los pocillos y seleccionando "agregar pocillo a nuevo pocillo promedio". Asígnele un nombre en la ventana emergente y haga lo mismo para todos los pocillos individuales que desee agrupar. Luego, revise todos los pocillos promedio para confirmar que todos tengan las mismas condiciones iniciales antes del co-cultivo. En la pestaña de experimento, presione pausa.

Desconecte el instrumento y sáquelo del incubador. Luego, retire las tapas en la cabina de flujo laminar. Posteriormente, retire algo del medio del inserto en el compartimento de la cámara superior.

Añada linfocitos T a las MBMEC pipeteando cuidadosamente 150 microlitros de medio. A continuación, vuelva a conectar el instrumento y presione reanudar medición. Después de 24 horas, presione detener en la pestaña de experimento y guarde el archivo.

Se muestra aquí la morfología en forma de huso en la tinción de inmunofluorescencia de PECAM-1 y Cldn-5 cinco días después del aislamiento de MBMEC. A continuación se presentan los valores de TEER y Ccl antes y después de agrupar los pocillos individuales previamente a la adición de linfocitos T. La curva azul no se utiliza en el experimento, ya que las MBMEC en este pocillo no han desarrollado un TEER tan alto como en otros pocillos.

En este experimento, se estimularon de 35 a 55 linfocitos T positivos para CD4 específicos marcados de forma antigénica durante cinco días. Los linfocitos T naïve y las citocinas proinflamatorias, interferón gamma y TNF-alfa, sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente. Aquí, los linfocitos T fueron estimulados con la misma cantidad de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, y los cultivados durante tres días mostraron una mayor propensión a la alteración de la barrera en comparación con los linfocitos T cultivados solo durante dos días.

Los resultados aquí mostrados indican que las células T estimuladas, pero no sus sobrenadantes, causaron un daño sustancial a las MBMEC, lo que sugiere que el contacto directo entre las células T y las MBMEC es fundamental para la alteración de la barrera. Por otro lado, la adición del inhibidor de granzima B dos al cultivo de células T restauró la integridad de las MBMEC en mayor medida, lo que señala a esta molécula citolítica como un factor importante en el daño a las MBMEC y la consiguiente disminución del TEER. Una vez dominado, este experimento puede realizarse en 12 días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar elegir el punto de tiempo adecuado para establecer el cultivo en co-cultivo de células T y células endoteliales.

Tras seguir este procedimiento, se pueden emplear otros ensayos, como microscopía de inmunofluorescencia, citometría de flujo y ensayos de probabilidad. Para abordar preguntas adicionales, como ¿cómo afecta esta interacción la expresión de las moléculas de la unión estrecha, la permeabilidad y el grado de transmigración de linfocitos T? Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neuroinmunología exploraran trastornos autoinmunes del sistema nervioso central en ratones.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo evaluar los efectos directos entre las células T activadas y las células endoteliales en lo que respecta a la integridad y permeabilidad de la barrera hematoencefálica.