Name: La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico murino mediante un sistema de transposón no viral. Este método seguro facilita aplicaciones terapéuticas en medicina regenerativa.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación CARIPARO Subvención número 13/04 y la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Subvención número 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin y Michela Pozzobon están financiadas por la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin está financiada por la Fundación CARIPARO Subvención número 13/04. Paolo De Coppi está financiado por la organización benéfica Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la ley italiana. muestras murino AF fueron cosechadas de los ratones gestantes en 13,5 días postcoital (DPC) de ratones C57BL / 6 ratones Tg (UBC-GFP) 30Scha / J llamada GFP. Producción 1. transposón NOTA: los vectores de expresión de transposones se generaron utilizando procedimientos de clonación estándar. El ADN plásmido para ratón AF células transfección se preparó usando kits comerciales. <ol><li> Mezclar 10 ng de ADN de plásmido con 50 l de bacterias DH5a en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar el tubo de microcentrífuga en hielo durante 20 min. </li><li> choque térmico a 42 ° C durante 40 segundos. </li><li> Coloque el tubo de microcentrífuga en hielo durante 2 min. </li><li> Añadir 250 l de caldo de caldo de lysogeny (LB) precalentado (37 ° C). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Spread 30 l de cada transformación sobre placas LB con 0,1 mg / ml de ampicilina. Permita que las placas se sequen y se incuban invertidas a 37 ° C overnight. </li><li> Al día siguiente, por la tarde, Pick 3 colonias, utilizando puntas estériles de 200 l, de cada transformación y transferencia a 0,1 mg / ml de LB amp. </li><li> Agitar bacterias (300 rpm) durante la noche a 37 ° C. </li><li> Para la purificación de plásmido utilizar kits comerciales. plásmidos de archivo a -20 ° C. </li></ol> 2. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Cultura <ol><li> El recubrimiento de las placas de 6 pocillos con 0,1% de gelatina <ol><li> recubrir placas bajo el capó adición de 1 ml de gelatina estéril al 0,1% a cada uno de los seis pozos. Deje que la gelatina se polimeriza en la incubadora (37 ° C) durante 1 hora. </li><li> Desechar el exceso, y secar las placas durante 1 hora. </li><li> Use parafina para sellar y las placas, almacenarlas a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> La inactivación de MEF con mitomicina C <ol><li> Descongelar un vial de 4 x 10 6 células MEF utilizando un baño de 37 ° C. </li><li> Semillas MEF en la campana en una placa de Petri (150 mm) con medio de MEF. </li><li> Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> (Precaución) Añadir mitomicina C (5 mg / ml) cuando las células son confluentes. </li><li> Células de lugar en una incubadora (37 ° C y 5% de CO2) durante 3 h. </li><li> Retire medio con células mitomicina C. Lavar tres veces con solución salina tampón fosfato 1x (PBS). </li><li> Añadir 2 ml de las células con tripsina y local comercial en el incubador a 37ºC durante 5 min. Después, añadir 18 ml de medio de bloqueo para detener la reacción con tripsina. </li><li> Contar las células utilizando una cámara Burker de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> centrifugar las células a 145 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante. </li><li> Seed 60.000 células / cm 2 de inactivada MEF sobre placas recubiertas de gelatina 0,1%. </li><li> Cultivar las células durante 24 horas a 37 ° C y CO 2 al 5%, antes de la siembra AF y / o células iPS-AF. </li></ol></li></ol> 3. aislamiento de células de ratón AF <ol><li> Configurar y comprobar los apareamientos programados PLU vaginalgs después de 24 h de co-vivienda. </li><li> Observe hasta 13,5 dpc y sacrificar presa embarazada a través de la dislocación cervical. </li><li> Limpiar la pared abdominal del animal usando 70% de etanol. </li><li> Con unas tijeras, realizar una incisión de laparotomía media la longitud de la pared abdominal para acceder a la cavidad abdominal. </li><li> Exponer el útero con unas pinzas. Quitar el útero utilizando tijeras y transferencia en una placa de Petri de 100 mm lleno de PBS estéril 1x colocó en hielo. </li><li> Utilizar un microscopio estereoscópico para recoger el AF a un aumento de 10X. </li><li> Sostener el útero con una pinza y quitar la pared uterina con unas tijeras. Tenga cuidado para evitar cualquier daño a las membranas fetales y la consiguiente pérdida de líquido amniótico. </li><li> Recoger los fetos en una placa de Petri de 100 mm estéril lleno de 1x PBS y colocar en hielo. </li><li> Agarre la placenta de un feto con una pinza de punta fina y colocar en un recipiente limpio 100 mm placa de Petri. </li><li> Retire el saco vitelino con unas pinzas de punta fina. </li><li&gt; perturbar el amnios con unas pinzas de punta fina y recoger 30 l de AF para cada feto usando una jeringa de insulina en un vial cónico de 15 ml. </li><li> Después de la recogida AF, lavar cada feto con estéril 1x PBS suplementado con suero de 1% de bovino fetal (FBS) y recoger en los 15 ml tubo cónico que contiene el AF. </li><li> Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante bajo el capó y sembrar las células sedimentadas AF. </li></ol> 4. ratón AF cultivo celular <ol><li> Siembra de células de ratón AF <ol><li> Un día antes de la siembra, preparar una placa de 6 pocillos recubierta con gelatina 0,1% con MEF tratado con mitomicina C. </li><li> Después de la recogida de AF, sembrar las células obtenidas de una amniocentesis (alrededor de 1 x 10 7 células obtenidas de fetos 6) sobre el mitóticamente inactivados MEF utilizando medio de cultivo AF. </li><li> Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, cambiando el medio cada dos días. </li><li> Después de 7 días de cultivo, transfect células AF siguiendo el procedimiento descrito a continuación. </li></ol></li></ol> 5. La transfección, la generación de células iPS-AF y Cultura NOTA: células de ratón AF se transfectaron con el plásmido de transposón PB-tetO2-IRES-OKMS, en conjunción con un plásmido de expresión de la transposasa (mPBase) y con el transactivador de tetraciclina inversa plásmido transposón (PB-CAG-rtTA). Todos los plásmidos fueron proporcionados por el profesor Andras Nagy 33. <ol><li> Mezclar 1 g de PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 g de mPBase y 0,5 g de PB-CAG-rtTA (ADN total: 2 g) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Diluir el ADN a 100 l con medio libre de suero (de Eagle modificado por Dulbecco - DMEM). </li><li> Añadir 8 l de la reactivo de transfección (por ejemplo, FUGENE) (en la proporción de ADN plasmídico: agente de transfección de 2 g (ADN) a agente de transfección 8 l) en el ADN que contiene 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Incubar la transfección mezcla de reactivos / ADN durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir gota a gota 100 l de la mezcla de reactivo de transfección / DNA por pocillo a una placa de 6 pocillos con células AF ratón y distribuir por agitación suave, con un volumen final de 2 ml / pocillo. Dejar durante 24 h. </li><li> El día después, inducir la expresión de factores de la Yamanaka (Oct4, Klf4 cMyc, Sox2) por la alimentación de las células con medio fresco iPS-AF suplementado con 1,5 g / ml de doxiciclina (2 ml de medio para cada pocillo). </li><li> Alimentar a las células de todos los días, sin paso, en un medio con dox fresca (mantener las células en medios suplementados con doxiciclina hasta el punto 5.13). </li><li> Observar las células dentro de las 24 h para la expresión mCherry y diariamente durante la formación de colonias (colonias aparecen típicamente entre 20 y 30 días después de la transfección). </li><li> Un día antes de la recolección de colonia, preparar una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con MEF tratado con mitomicina C. </li><li> Recoger colonias individuales en 50 l de volumen usinga 200 pipeta l, y transferir de forma secuencial en una placa de 96 pocillos en pocillos individuales. </li><li> El día después, se disocian todas las colonias en células individuales mediante la adición de 50 l de la tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Pipetear arriba y abajo para desagregar la colonia. </li><li> Transferencia de 50 l de la tripsina que contiene la colonia disociada en un nuevo bien con inactivada MEF en una gelatina 0,1% recubierto de 96 pocillos de la placa llena con 100 l de medio fresco iPS-AF suplementado con doxiciclina. </li><li> Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió en un pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió 1: 2 a dos pocillos, uno con doxiciclina y la otra sin doxiciclina, para verificar si las colonias aparecen también en la condición sin doxiciclina. </li><li> Seguir manteniendo clones iPS-AF, doxiciclina independiente, en inactivada MEF en el medio IPS-AF. </li><li> Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, CHAnging medio diario. </li></ol> 6. La tinción de fosfatasa alcalina <ol><li> Realizar tinción de fosfatasa alcalina siguiendo el protocolo del fabricante cuando se produzca la aparición de células iPS-AF independientes doxiciclina. </li></ol> 7. La inmunofluorescencia <ol><li> Siempre que se produzca la aparición de células iPS independientes doxiciclina-AF, sembrar 150.000 células / cm2 en un pocillo de una placa de 24 pocillos con inactivada MEF, y hacer crecer las células durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> (Precaución) fijar las células mediante la adición de 300 l por pocillo de 4% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 300 l de 0,1% de células para permeabilizar NP-40. </li><li> Enjuagar las células con 300 l de 0,1% PBS-Tween 20. </li><li> Añadir 300 l de tampón de bloqueo de la (10% de suero de caballo en 1x PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente. </li><li> Utilice los siguientes anticuerpos primarios: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) y SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 con 1% de albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal al 10%, 0,3 M de glicina en 0,1% PBS-Tween-20. Diluir todos los otros anticuerpos con 10% de suero de caballo en 1x PBS. </li><li> Se incuban los anticuerpos durante la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuague con 300 l de 0,1% PBS-Tween-20. </li><li> Usa los anticuerpos secundarios diluidos en suero de caballo al 10% en 1 x PBS: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratón (1: 200), Alexa594-conjugado IgG de pollo anti-cabra (1: 200), Alexa594 conjugado de pollo anti-IgG de conejo (1: 200), de cabra conjugado con Alexa568 anti-IgM de ratón (1: 200). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague con 1x PBS. </li><li> núcleos de tinción con solución de Hoechst (1: 10.000) en 1x PBS. </li></ol> 8. En Vitro Diferenciación Celular <ol><li> Para formar gota colgante cuerpos embrioides (EBS), cultivar las gotas individuales (2.000 células / 20 l) sobre la tapa de las placas Petri, con el medio de diferenciación. </li><li> Incubar las placas a 37 ° Cy 5% de CO2 durante 4 días. </li><li> Transferir los EB en 100 mm platos bacteriana grado en el cultivo en suspensión durante 3 días en medio de diferenciación. </li><li> EBs de placas en placas de 24 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal (diluido 1:10 en DMEM) durante otros 14 días. </li><li> Para los análisis de inmunofluorescencia, utilizar anticuerpos primarios: T (1: 100), αfp (1: 200) y Tubb3 (1: 500) 37. </li></ol> Formación 9. En Vivo Teratoma <ol><li> Se inyectan 100 l de 1x PBS que contenía 1 x 10 6 células iPS-AF en el músculo de la extremidad posterior de Rag2 - / -? C - / - ratones. </li><li> Sacrificar los ratones mediante dislocación cervical 6 semanas después de la inyección de células. </li><li> Retire las masas tumorales, que se distinguen por su tamaño, de la extremidad posterior de los ratones durante los siguientes análisis. </li><li> Cortar 7-10 micras secciones transversales de espesor del tumor isopentano-congelado usando un criostato. </li><li> Para una Haematoxylind eosina (HE) de la mancha: <ol><li> Manchar con HE para evaluar la composición del tejido tumoral, siguiendo el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Para las manchas de inmunoperoxidasa: <ol><li> Fijar secciones teratoma con 4% PFA durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilizar con 0,1% Triton X-100. </li></ol></li><li> Incubar con los siguientes anticuerpos: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) y αSMA (1: 100) diluido en 1% de BSA en PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) o durante la noche a 4 ° C (para los otros anticuerpos). </li><li> peroxidasa bloque usando 100% de metanol durante 20 min. </li><li> Incubar durante 45 min a 37 ° C con el anticuerpo secundario conjugado con HRP (1: 150) anti-ratón. </li><li> Enjuague con 1x PBS. </li><li> Incubar con peroxidasa sustrato (HRP) (ver Materiales Tabla) durante 5 min. </li><li> Enjuague con agua del grifo durante 5 minutos. </li><li> Teñir con hematoxilina QS durante 9 s. </li><li> Enjuague con agua del grifo. </li></ol&gt; 10. Extracción de ARN a partir de células <ol><li> Utilice un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. </li></ol> 11. La extracción de RNA de teratoma <ol><li> Homogeneizar el teratoma usando una mano de mortero y mortero y nitrógeno líquido para evitar la descongelación de la muestra. </li><li> Pesar 25 mg de tejido. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo comercial para la extracción de RNA y 200 l de cloroformo. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 xg y 4 ° C durante 15 min. </li><li> Transferir el sobrenadante aclarado a un tubo nuevo. </li><li> Para purificar el RNA utilizar un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol> Análisis de la reacción en cadena de la polimerasa 12. Reverse Transcription <ol><li> Sintetizar la primera hebra de ADNc utilizando una transcriptasa inversa para la transcripción inversa (RT) reacción en cadena de polimerasa (PCR) y oligo accor (dT)ding con el protocolo del fabricante, para obtener 50 ng / l de cDNA. Diluir cDNA con agua libre de RNasa a una concentración de 10 ng / mL. </li><li> Realizar RT-PCR utilizando la polimerasa de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando 1 ng / l de cDNA. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método elegido para obtener la inducción de la pluripotencia es relevante para la seguridad clínica de células con respecto al trasplante a largo plazo. Hoy en día, existen varios métodos adecuados para la reprogramación. Entre los métodos no integrativos, la viral (SEV) vector Sendai es un virus de ARN que pueden producir grandes cantidades de proteína sin integrar en el núcleo de las células infectadas 40 y podría ser una estrategia para obtener células iPS. vectores SeV podría ser un candid...

El diagnóstico prenatal es una importante herramienta clínica para evaluar enfermedades genéticas (es decir, aberraciones cromosómicas, enfermedades monogénicas o poligenéticos / multifactorial) y malformaciones congénitas (hernia diafragmática congénita es decir, lesiones pulmonares quísticas, onfalocele, gastrosquisis). El líquido amniótico (AF) las células son fáciles de obtener de forma rutinaria los procedimientos programados durante el segundo trimestre del embarazo (es decir, la amniocentesis y amniorreducción) o cesáreas 1, 2. La disponibilidad de las células AF de pacientes prenatales o neonatales ofrece la posibilidad de utilizar esta fuente para la medicina regenerativa, y varios investigadores investigó la posibilidad de tratar diferentes daños de tejidos o enfermedades utilizando una población de células madre aisladas de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La posibilidad de obtener fácilmente células AF de pacientes enfermos, en una ventana de tiempo en el que la enfermedad es a menudo estacionario, abre el camino a la idea de utilizar esta fuente de células para los propósitos de reprogramación. De hecho, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) derivadas de células AF podrían diferenciarse en las células de interés para las pruebas de fármacos in vitro o para los enfoques de ingeniería de tejidos, con el fin de preparar una terapia adecuada específica del paciente antes del parto. Muchos estudios ya han demostrado la capacidad de las células AF para ser reprogramado y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 &lt;/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Desde el descubrimiento por Takahashi y Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas a través de la expresión forzada de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y CMYC), se han hecho progresos en el campo de la reprogramación. Teniendo en cuenta los diferentes métodos, podemos distinguir entre los enfoques virales y no virales. La primera espera que el uso de vectores virales (retrovirus y lentivirus), que tienen una alta eficiencia, pero silenciamiento generalmente incompleta del transgén retroviral, tanto con la consecuencia de una línea de células parcialmente reprogramado y el riesgo demutagénesis por inserción 29, 30, 31. El método no viral utiliza diferentes estrategias: es decir, plásmidos, vectores, ARNm, proteínas, transposones. La derivación de células iPS libres de secuencias transgénicas pretende eludir los efectos potencialmente nocivos de la expresión del transgen con fugas y la mutagénesis por inserción. Entre todas las estrategias no virales mencionados anteriormente, el sistema de transposón / transposasa PiggyBac (PB) requiere sólo las repeticiones terminales invertidas que flanquean un transgén y la expresión transitoria de la enzima transposasa para catalizar eventos de inserción o de escisión 32. La ventaja en el uso de transposones sobre otros métodos para la generación de células iPS es la posibilidad de obtener células iPS libre de vectores con un enfoque de vector no viral que muestra la misma eficacia de los vectores retrovirales. Esto es posible mediante escisión trace-menos de la codificación transposón integrado para la reprogramming siguientes factores de una nueva expresión transitoria de la transposasa en las células iPS 33. Dado que PB es eficiente en diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, es más adecuado para un enfoque clínico con respecto a los vectores virales, y permite la producción de células iPS sin xeno contrario a protocolos de producción virales actuales que utilizan xenobiótico condiciones, este sistema se utiliza para obtener células iPS a partir murino AF. Aquí proponemos un protocolo detallado siguientes trabajos ya publicados para mostrar la producción de iPS a partir de células pluripotentes clones AF de ratón (células iPS-AF) 38.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri de grado bacteriano de 100 mm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Para in vitro diferenciación</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Para AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación</td></tr><tr><td>Alexa568 conjugado anti-ratón de cabra IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado pollo anti-cabra IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado pollo anti-conejo IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado de cabra anti-ratón IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)</td></tr><tr><td>Kit de fosfatasa alcalina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Fosfatasa alcalina&nbsp; tinción</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Para la selección bacteriana</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>DH5 y células alfa;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bacterias para el procedimiento</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de clonación <tr><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>Para MEF, AF de ratón, células iPS-AF y medio</td></tr> <tr><td>de diferenciaciónDoxiciclina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Para la expresión de factores exógenos</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.706</td><td>Para la producción de PB&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>para AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación</td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 10270106</td><td></td><td>para MEF medio</td></tr><tr><td>Pinza de punta fina</td><td>F.S.T</td><td>. Dumont #5&nbsp;</td><td>Aislamiento de AF</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Utilizada al 0,1%, diluida en PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>Para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x</td></tr><tr><td>Hematoxilina QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Detección de núcleos</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Análisis histológico del teratoma</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Suero de caballo de detección</td></tr><tr><td>de núcleos&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Para solución bloqueante</td></tr><tr><td>HRP-conjugada de cabra anti-ratón IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Anticuerpo secundario (inmunoperoxidasa)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Sustrato de peroxidasa</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina con aguja (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Procedimiento de amniocentesis</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>IgG</td></tr><tr><td>L-glutamina</td> policlonal de conejo<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Para AF de ratón, células iPS-AF y caldo LB de medio de diferenciación</td></tr><tr><td>(Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Para el crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Para ratón AF y células iPS-AF medio</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Para <ellos> diferenciación in vitro. Diluido 1:10 en DMEM</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Bloqueo de peroxidasa</td></tr><tr><td>MULTIWELL Placa de 24 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>Para diferenciación in vitro</td></tr><tr><td>MULTIWELL Placa de 6 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>Para el cultivo de células MEF, AF de ratón e iPS-AF</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>IgG policlonal de conejo</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Para ratón AF, células iPS-AF y medio de diferenciación</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>Para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>Para permeabilización celular. Diluido en PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td> Oligo (dT) <td>monoclonal IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de ratón<tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>para RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (solución)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fijador, diluido en PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, libre de Ca2+/Mg2+. Diluido con agua estéril para obtener PBS 1x</td></tr><tr><td>Penicilina - Estreptomicina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Para MEF, AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación Placa de</td></tr><tr><td>Petri (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Para cultivo de MEF, cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Plásmido de expresión de transposasa PiggyBac&nbsp;</td><td>Proporcionado por el profesor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratorio-mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plásmido de transposón</td><td>Proporcionado por el profesor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratorio-PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>Para la purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Para la purificación</td></tr> <tr><td>de plásmidosPlásmido transactivador de transposón de tetraciclina inversa&nbsp;</td><td>Proporcionado por el profesor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratorio-rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>para extracción de ARN</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>IgG policlonal de cabra</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>IgM monoclonal de ratón</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptasa inversa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>para RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>IgG policlonal de conejo Taq</td></tr><tr><td>ADN polimerasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Pasaje de cultivo celular</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>Para permeabilización celular, diluido en PBS 1x</td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>Para extracción</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de ARN <tr><td>Tubb3&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G712A</td><td>IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> monoclonal de ratón <tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Para permeabilización celular, diluido en PBS 1x</td></tr><tr><td>&alpha; fp&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>IgG1 monoclonal de ratón</td></tr><tr><td>&alpha;SMA&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td> Reactivo de transfección <td>IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> monoclonal de ratón <tr><td>(FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>Para la transfección de células AF</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>Para realizar amniocentesis&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu; l consejos</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td><td>Para recoger colonias de bacterias</td></tr><tr><td>Tijera</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 inoxidable 25U</td><td>Para realizar amniocentesis&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>Para limpiar la pared abdominal de la madre embarazada</td></tr><tr><td>Placa de Petri para cultivo de tejidos (150 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>para la expansión de MEF</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>para la inactivación de MEF</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>MULTIWELL BD Falcon</td><td>353071</td><td>para cultivo iPS-AF</td></tr></tbody></table>

la producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se generan a partir de células somáticas de ratón y humanas mediante la expresión forzada de factores de transcripción definidos utilizando diferentes métodos. Aquí, producimos células iPS a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral. Todas las líneas celulares iPS obtenidas mostraron características de células pluripotentes, incluida la capacidad de diferenciarse hacia derivados de las tres capas germinales in vitro e in vivo. Esta estrategia abre la posibilidad de utilizar células de fetos enfermos para desarrollar nuevas terapias para los defectos congénitos.

Para evaluar la capacidad de la reprogramación, se recogieron las células de ratón AF de fetos de ratones GFP. Las células fueron transfectadas con el plásmido de transposón circular PB-tetO2-IRES-OKMS, que expresa los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 y cmyc) vinculados a la proteína fluorescente mCherry de una manera inducible por doxiciclina, y revertir transactivador de tetraciclina (PB- CAG-rtTA) plásmidos junto con el plásmido de expresión de la transposasa (mPBase). Células de r...

En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y reprogramar las células murinas del líquido amniótico mediante un sistema de transposones. La principal ventaja de esta técnica es que se realiza fácilmente. En un entorno terapéutico, las células de fetos de enfermedades humanas se pueden diferenciar en células de interés para pruebas de fármacos o ingeniería de tejidos, con el fin de preparar de otra manera la terapia específica de la paciente antes del parto.Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la programación. El sistema de transposones es eficiente en diferentes tipos de células. Es más adecuado para el abordaje clínico con respecto a vectores virales y permite la producción de células IPS libres de oxino.Para comenzar el aislamiento, limpie la pared abdominal de la presa con etanol al 70 por ciento. Con unas tijeras, realice una laparotomía de línea media, haciendo una incisión a lo largo de la pared abdominal para acceder a la cavidad abdominal. Use fórceps para exponer el útero y luego extirparlo con unas tijeras.Transfiera el útero a un plato de 100 milímetros lleno de 1xPBS estéril y manténgalo en hielo. Coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10X y sujete el útero con pinzas mientras retira la pared uterina con unas tijeras, teniendo cuidado de no dañar las membranas fetales. Recoja los fetos en un plato de 100 milímetros lleno de 1XPBS estéril y colóquelos en hielo.Agarre la placenta de un feto con las pinzas de punta fina y muévala a un plato limpio de 100 milímetros. Aquí, retire con cuidado el saco vitelino. Rompe el amnios con las pinzas y con una jeringa de insulina, recoge 30 microlitros de líquido amniótico.Transfiera el líquido a un vial cónico de 15 mililitros. Repita este proceso para cada feto, recogiendo el líquido en el mismo vial cada vez. A continuación, lave cada feto con 1XPBS estéril suplementado con suero fetal bovino al uno por ciento y recoja este feto en el tubo cónico de 15 mililitros junto con el líquido amniótico.Centrifugar el tubo a 145 veces G durante cinco minutos y luego, bajo una campana de flujo laminar, retire el sobrenadante. Vuelva a suspender las células peletizadas en dos mililitros de medio de cultivo de líquido amniótico. Tome una placa de seis pocillos recubierta de gelatina con un uno por ciento de punto cero que contenga fibroblastos embrionarios de ratón tratados con miomicina-C o MEF y luego siembre dos mililitros de células en la placa.Cultive las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono, cambiando el medio cada dos días. Continúe el cultivo durante siete días hasta que las células estén listas para la transfección. Para comenzar la transfección, en un tubo de microcentrífuga de un punto cinco milímetros, mezcle un microgramo de plásmido de transposón con cero coma cinco microgramos de plásmido de expresión de transposasa y cero coma cinco microgramos de plásmido transactivador de tetraciclina inversa.Diluir a 100 microlitros con d-man. Agregue ocho microlitros de reactivo de transfección en el tubo de microcentrífuga que contiene el ADN. Incuba esta mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente.Tomando la placa de seis pocillos con células AF de ratón, agregue gota a gota 100 microlitros de la mezcla de ADN del agente de transfección por pocillo, distribuyendo mediante un suave remolino con un volumen final de dos mililitros por pocillo. Deje las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en un cinco por ciento de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire el medio de cultivo y luego alimente cada pocillo de células con dos mililitros de medio iPS AF fresco suplementado con un punto cinco microgramos por mililitro de doxiciclina para inducir la expresión de los factores de Yamanaka.Alimente las células diariamente con medio fresco que contenga dox sin pasar a partir de este punto. Observe las células bajo el microscopio de florescencia dentro de las 24 horas posteriores al primer tratamiento con doxicicina para buscar cualquier expresión de mCherry y, a partir de este momento, diariamente para la formación de colonias. Una vez que se observe la formación de colonias, recoja colonias individuales en 50 microlitros de medio de cultivo celular.A continuación, transfiéralos secuencialmente a pocillos separados de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con MEF tratado con miomicina c. Al día siguiente, agregue 50 microlitros de tripsina a cada pocillo e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados para disociar las colonias en células individuales. Después de la incubación, pipetee el líquido hacia arriba y hacia abajo para desagregar aún más las colonias.Transfiera 50 microlitros de la mezcla de células de tripsina a un nuevo pocillo que contenga MEF inactivado y luego devuelva las células a la incubadora. Cuando las células alcancen el 60 al 70 por ciento de confluencia, divídalas en un nuevo pocillo de una placa de 24 pocillos y luego continúe la incubación a temperatura ambiente. Una vez que estas células alcancen el 60 al 70 por ciento de confluencia, voltea las celdas una o dos en dos pocillos, uno que contenga doxiciclina y otro sin ella para verificar que las colonias también crezcan en ausencia de doxiciclina.Continuar manteniendo las colonias de IPS AF y el medio independiente de doxiciclina en MEF inactivado a 37 grados Celsius en cinco por ciento de dióxido de carbono. Cambie el medio diariamente hasta que las células estén listas para la tinción, la obtención de imágenes y la extracción de ARN. Aquí, las células positivas de GFP amniótica de ratón con pleuripotencia inducida independiente de doxiciclina estable expresan los marcadores de pleuripotencia necesarios para confirmar una reprogramación exitosa.El análisis RTPCR utilizando células madre embrionarias R1 como control mostró la expresión de los marcadores de pleuripotencia inducida en presencia o ausencia de doxiciclina. La expresión del gen de limpieza, beta dos microglobulina, también se observó en los tres tipos de células. Los teratomas aislados de ratones inyectados con las células pleuropotentes inducidas se inmunotiñeron.La detección de proteína alfa fetal, alfa actina de músculo liso y beta tres tubulina en las masas confirma la diferenciación celular en las tres capas germinales, ectodermo, mesodermo y endodermo. Además, el análisis RTPCR de cuerpos embrioides in vitro y células de teratoma in vivo confirma la expresión de genes marcadores específicos de la capa germinal para el mesodermo, el endodermo y el ectodermo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y reprogramar las células del líquido amniótico murino.Se trata de un procedimiento sencillo y seguro que puede aplicarse también a las células del líquido amniótico humano a partir de una muestra obtenida de diagnósticos rutinarios o cesáreas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

El fibroblasto embrionario de ratón puede ser reprogramado en células madre pluripotentes inducidas con baja eficiencia mediante la expresión forzada de los factores de transcripción Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Los raros intermediarios de la reacción de reprogramación son los FACS aislados mediante marcaje con anticuerpos contra los fabricantes de superficie celular Thy-1.2, Ssea-1 y Epcam.

Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico murino mediante un sistema de transposón no viral. Este método seguro facilita aplicaciones terapéuticas en medicina regenerativa.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

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