La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

El objetivo general de este procedimiento es aislar y reprogramar las células murinas del líquido amniótico mediante un sistema de transposones. La principal ventaja de esta técnica es que se realiza fácilmente. En un entorno terapéutico, las células de fetos de enfermedades humanas se pueden diferenciar en células de interés para pruebas de fármacos o ingeniería de tejidos, con el fin de preparar de otra manera la terapia específica de la paciente antes del parto.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la programación. El sistema de transposones es eficiente en diferentes tipos de células. Es más adecuado para el abordaje clínico con respecto a vectores virales y permite la producción de células IPS libres de oxino.

Para comenzar el aislamiento, limpie la pared abdominal de la presa con etanol al 70 por ciento. Con unas tijeras, realice una laparotomía de línea media, haciendo una incisión a lo largo de la pared abdominal para acceder a la cavidad abdominal. Use fórceps para exponer el útero y luego extirparlo con unas tijeras.

Transfiera el útero a un plato de 100 milímetros lleno de 1xPBS estéril y manténgalo en hielo. Coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10X y sujete el útero con pinzas mientras retira la pared uterina con unas tijeras, teniendo cuidado de no dañar las membranas fetales. Recoja los fetos en un plato de 100 milímetros lleno de 1XPBS estéril y colóquelos en hielo.

Agarre la placenta de un feto con las pinzas de punta fina y muévala a un plato limpio de 100 milímetros. Aquí, retire con cuidado el saco vitelino. Rompe el amnios con las pinzas y con una jeringa de insulina, recoge 30 microlitros de líquido amniótico.

Transfiera el líquido a un vial cónico de 15 mililitros. Repita este proceso para cada feto, recogiendo el líquido en el mismo vial cada vez. A continuación, lave cada feto con 1XPBS estéril suplementado con suero fetal bovino al uno por ciento y recoja este feto en el tubo cónico de 15 mililitros junto con el líquido amniótico.

Centrifugar el tubo a 145 veces G durante cinco minutos y luego, bajo una campana de flujo laminar, retire el sobrenadante. Vuelva a suspender las células peletizadas en dos mililitros de medio de cultivo de líquido amniótico. Tome una placa de seis pocillos recubierta de gelatina con un uno por ciento de punto cero que contenga fibroblastos embrionarios de ratón tratados con miomicina-C o MEF y luego siembre dos mililitros de células en la placa.

Cultive las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono, cambiando el medio cada dos días. Continúe el cultivo durante siete días hasta que las células estén listas para la transfección. Para comenzar la transfección, en un tubo de microcentrífuga de un punto cinco milímetros, mezcle un microgramo de plásmido de transposón con cero coma cinco microgramos de plásmido de expresión de transposasa y cero coma cinco microgramos de plásmido transactivador de tetraciclina inversa.

Diluir a 100 microlitros con d-man. Agregue ocho microlitros de reactivo de transfección en el tubo de microcentrífuga que contiene el ADN. Incuba esta mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Tomando la placa de seis pocillos con células AF de ratón, agregue gota a gota 100 microlitros de la mezcla de ADN del agente de transfección por pocillo, distribuyendo mediante un suave remolino con un volumen final de dos mililitros por pocillo. Deje las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en un cinco por ciento de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire el medio de cultivo y luego alimente cada pocillo de células con dos mililitros de medio iPS AF fresco suplementado con un punto cinco microgramos por mililitro de doxiciclina para inducir la expresión de los factores de Yamanaka.

Alimente las células diariamente con medio fresco que contenga dox sin pasar a partir de este punto. Observe las células bajo el microscopio de florescencia dentro de las 24 horas posteriores al primer tratamiento con doxicicina para buscar cualquier expresión de mCherry y, a partir de este momento, diariamente para la formación de colonias. Una vez que se observe la formación de colonias, recoja colonias individuales en 50 microlitros de medio de cultivo celular.

A continuación, transfiéralos secuencialmente a pocillos separados de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con MEF tratado con miomicina c. Al día siguiente, agregue 50 microlitros de tripsina a cada pocillo e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados para disociar las colonias en células individuales. Después de la incubación, pipetee el líquido hacia arriba y hacia abajo para desagregar aún más las colonias.

Transfiera 50 microlitros de la mezcla de células de tripsina a un nuevo pocillo que contenga MEF inactivado y luego devuelva las células a la incubadora. Cuando las células alcancen el 60 al 70 por ciento de confluencia, divídalas en un nuevo pocillo de una placa de 24 pocillos y luego continúe la incubación a temperatura ambiente. Una vez que estas células alcancen el 60 al 70 por ciento de confluencia, voltea las celdas una o dos en dos pocillos, uno que contenga doxiciclina y otro sin ella para verificar que las colonias también crezcan en ausencia de doxiciclina.

Continuar manteniendo las colonias de IPS AF y el medio independiente de doxiciclina en MEF inactivado a 37 grados Celsius en cinco por ciento de dióxido de carbono. Cambie el medio diariamente hasta que las células estén listas para la tinción, la obtención de imágenes y la extracción de ARN. Aquí, las células positivas de GFP amniótica de ratón con pleuripotencia inducida independiente de doxiciclina estable expresan los marcadores de pleuripotencia necesarios para confirmar una reprogramación exitosa.

El análisis RTPCR utilizando células madre embrionarias R1 como control mostró la expresión de los marcadores de pleuripotencia inducida en presencia o ausencia de doxiciclina. La expresión del gen de limpieza, beta dos microglobulina, también se observó en los tres tipos de células. Los teratomas aislados de ratones inyectados con las células pleuropotentes inducidas se inmunotiñeron.

La detección de proteína alfa fetal, alfa actina de músculo liso y beta tres tubulina en las masas confirma la diferenciación celular en las tres capas germinales, ectodermo, mesodermo y endodermo. Además, el análisis RTPCR de cuerpos embrioides in vitro y células de teratoma in vivo confirma la expresión de genes marcadores específicos de la capa germinal para el mesodermo, el endodermo y el ectodermo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y reprogramar las células del líquido amniótico murino.

Se trata de un procedimiento sencillo y seguro que puede aplicarse también a las células del líquido amniótico humano a partir de una muestra obtenida de diagnósticos rutinarios o cesáreas.