Name: A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda microscopía intravital de alta resolución en pulmón intacto usando una ventana de imagen estabilizada por vacío. Este método permite visualizar interacciones célula-tumor durante la metástasis durante hasta 12 horas.

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Esta investigación fue apoyada por NIH-CA100324, el P30CA013330 de apoyo al centro oncológico del Instituto Nacional del Cáncer Einstein, R01CA172451 al JWP y al Programa Integrado de Imágenes. Esta tecnología fue desarrollada en el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper y en el Programa de Imágenes Integradas de la Facultad de Medicina Albert Einstein. Agradecemos el apoyo de estos Centros en esta labor. Los autores agradecen a Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon y Anthony Leggiadro del taller mecánico Einstein por su hábil y oportuna artesanía, al laboratorio de Matthew Krummel por compartir generosamente sus dibujos de diseño de ventanas, a Kevin Elicieri y Jeremy Bredfeldt por su experiencia en microscopía y sus recomendaciones de amplificadores, y a Allison Harney y Bojana Gligorijevic por las discusiones informativas.

Los autores no tienen nada que revelar.

De alta resolución en imágenes ópticas vivo combinada con etiquetas funcionales marcados con fluorescencia, tales como proteínas y anticuerpos se ha incrementado dramáticamente nuestra comprensión de la cascada metastásica. Se ha habilitado la visualización directa y la cuantificación de una sola célula y los parámetros de sub-celulares en las células tumorales, las células huésped y su microambiente. Esta formación de imágenes en el tumor primario ha llevado, por ejemplo, al descubrimiento de microamb...

Alta resolución de imagen óptica intravital ha demostrado ser crucial para la comprensión de muchos procesos biológicos, lo que permite de una sola célula y parámetros sub-celulares que han de medirse y cuantificarse. En la investigación del cáncer, intravital de imágenes de las células tumorales y estroma ha llevado al descubrimiento de muchas interacciones microambientales 6-11 que sólo están presentes en el animal intacto. Descubrimientos sobre microambientes asociados con intravasación y diseminación de las células tumorales en el cáncer de mama utilizando imágenes ópticas resolución única célula in vivo, incluso ha dado lugar a nuevos marcadores de pronóstico y respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer de mama 12-16. Las mejores tecnologías de imagen disponibles para su visualización en lo profundo de los órganos vitales internos intactos son las modalidades clínicas (MRI, PET, CT) que ofrecen excelentes vistas de todo el órgano y pueden revelar patologías, incluso antes de que produzcan síntomas clínicos. Son incapaces, hin embargo, para revelar las primeras etapas de la metástasis y los mecanismos celulares de conducción progresión del tumor debido a su falta de resolución de una sola célula. En el momento en metástasis pulmonares son visibles en estas modalidades, que están bien establecidos y proliferando. Teniendo en cuenta la estimación de que el 90% de las células diseminadas de tumores que llegan al pulmón, o bien no sobreviven 17 o inicialmente permanecen en estado latente 18, y la observación de que llegan mucho antes de lo que esperaba 19, imágenes de los primeros pasos de la llegada y la supervivencia se convierte en crucial para la comprensión del proceso de la siembra metastásica y la recurrencia del crecimiento del tumor en sitios distantes. La realización de estas observaciones en el pulmón ha demostrado sin embargo extremadamente difícil; la gran mayoría de los estudios de imagen han utilizado preparaciones ex vivo o de explantes 20-23, que sólo dan una visión en el pulmón en puntos de tiempo individuales. Mientras que estas preparaciones proporcionan información útilconfirmación, no dan una completa comprensión de las interacciones, las relaciones de causa y efecto, y las dinámicas que se producen entre los diferentes componentes del microambiente. La falta de un sistema adecuado circulatorio (y el desequilibrio de la homeostasis concomitante) y la desconexión del resto del sistema inmunológico del cuerpo hace que sea deseoso para validar las conclusiones que estas preparaciones generan en el tejido intacto in vivo. Muchos grupos han realizado intravital de imágenes de los pulmones intactos 2,4,5,24-33 con Wearn y alemán siendo el primer quirúrgicamente exponer la capa pleural 24 y Terry los primeros en utilizar una ventana de imagen implantable 25. De alta resolución de imagen en el pulmón se ve obstaculizado en gran medida por el movimiento constante del pulmón y varias técnicas se han desarrollado para superar esta limitación. Wagner y Filley 27 estudiaron el movimiento natural del pulmón caninoy diseñado su protocolo quirúrgico para localizar su ventana implantado sobre una región relativamente estacionario mientras Wagner utiliza vacío en su preparación quirúrgica ventana para inmovilizar el tejido 28. Desde entonces, una variedad de técnicas han sido utilizados para la imagen del pulmón incluyendo: sujeción bronquio, apnea secuencial y de formación de imágenes cerrada, la adquisición de sobremuestreado, de encolado del lóbulo de pulmón y de vacío 34. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas, y ninguna técnica ha surgido como superior a otro 34. Por ejemplo, de sujeción bronquios y apnea secuencial alteran el intercambio normal de gases en el pulmón y pueden causar atelectasia. imágenes cerrada y la adquisición de sobremuestreo no sufren de estos inconvenientes, sino que requieren de alta velocidad o equipos de imágenes especializado no es ampliamente accesible. Por último, tanto el encolado del pulmón y de la técnica de vacío evitar tanto de los inconvenientes mencionados anteriormente, pero pueden mostrar lesiones fuerza inducida cizallamiento si no se tiene takes. En los últimos años, la ventana de vacío se ha miniaturizado y adaptado para su uso en ratones utilizando microscopía confocal y multifotónica 4,5,33 y excelentes imágenes de alta resolución se ha alcanzado 2. La Tabla 1 resume esta rica historia y destaca aquellos documentos que describen la novela los avances en el uso de las ventanas de imagen intravital de pulmón. Este protocolo describe el uso de prolongado lapso de tiempo de microscopía multifotónica intravital a la imagen metástasis en el vivo, pulmón intacto con la resolución más alta posible subcelular. Las imágenes se adquieren durante un máximo de 12 horas usando un microscopio multifotónica equipado con una lente de objetivo de alta apertura numérica y detectores múltiples tubo fotomultiplicador (PMT). modelos de ratones transgénicos se utilizan para la etiqueta fluorescente macrófagos nativas junto con dextrano fluorescente de alto peso molecular y las células tumorales transfectadas proteínas fluorescentes (para etiquetar las células tumorales y la vasculatura respectively). Mientras que esta elección de las células marcadas con fluorescencia permite la visualización de las interacciones célula-célula endotelial macrófagos tumorales y la dinámica, este protocolo funcionará para cualquier cepa de ratón fluorescente o no fluorescente. Después de la adquisición, el movimiento de deriva residual (si lo hay) se elimina utilizando un plugin de Fiji 35,36 y personalizados macros tiempo promedio que el canal vascular para eliminar intermitente causada por las células sanguíneas que circulan sin etiqueta. Mientras que este protocolo se centra en la metástasis de formación de imágenes, las técnicas son aplicables a muchos otros procesos biológicos observables con imágenes de alta resolución de una sola célula en el pulmón.

<table><tbody><tr><td>Regulador de vacío de latón niquelado 1/8 NPT hembra, con manómetro, vacío de 0 - 20" Hg</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>Regulador de vacío</td></tr><tr><td>Adaptador de conexión de manguera de púas de latón para manguera de 1/4 "ID x 1/8" NPTF Tubo macho</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Adaptador de manguera regulador de vacío</td></tr><tr><td>Matraces de filtrado de la marca Pyrex con tubulación; Cuello labrado para tapón de goma n.º 4; Capacidad: 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>Frasco</td></tr> de <tr><td>vacío Cubreobjetos de vidrio redondos Espesor #1,5, 0,16 - 0,19 mm 10 mm de diámetro.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Cubreobjetos</td></tr><tr><td>Exel International Safelet S.I.V. Catéteres; 22 g x 1 pulg.&nbsp;</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>Catéter Traqueal</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Suturas de seda trenzada negra, ETHICON LIGAPAK Carrete dispensador tamaño 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>String</td></tr><tr><td>Liquid Super Glue, transparente, 0.14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Pegamento de ciano-acrilato</td></tr><tr><td>Isotiocianato de tetrametilrodamina &ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD</td></tr><tr><td>Tubo de PVC Tygon Transparente de Laboratorio, 1/16" de diámetro interior, 1/8" de diámetro exterior, 1/32" de espesor de pared, 25 pies de longitud</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>Tubo delgado & Tubería para</td></tr><tr><td>tubería de polietileno resistente a grietas Luer, 1/8" de diámetro interior, 1/4" de diámetro exterior, 1/16" de espesor de pared, blanco, 50 pies de longitud&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>Tubos gruesos</td></tr><tr><td>Loción depilatoria</td><td></td> <td>Nair-Micro</td><td></td></tr> <tr><td>Medical Tubing 95 Durómetro LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Tubo para catéter de vena de cola</td></tr><tr><td>30 G x 1 pulg. BD PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305128</td><td>Agujas para catéter de vena de cola</td></tr><tr><td>Puritan Hisopos no estériles con punta de algodón&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio de tubo de púas de policarbonato transparente, recto reductor para tubo de 3/32" x 1/16" ID</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Conectores entre tubos</td></tr><tr><td>Tapones de goma de un orificio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-135F</td><td>Tapón para matraz de vacío</td></tr><tr><td>Puntas de barrera de precisión SHARP, para P-100, 100 y micro; l</td><td>Denville Científico Inc.</td><td>P1125</td><td>Punta de pipeta</td></tr><tr><td>Cinta de laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein</td><td>Ungüento oftalmológico</td><td>008897</td> de salud animal</tr><tr><td>Gemini Kit de cauterización Kit de cauterio Appliance</td><td>Harvard</td><td>726067</td><td>Pluma de cauterización</td></tr><tr><td>Graefe Micro Disecters; Dentado; Ligera curva; Ancho de la punta de 0,8 mm; 4" de longitud</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>fórceps</td></tr><tr><td>Micro Tijeras de Disección Extra Finas 4" Rectas Afiladas/Afiladas 24 mm</td><td>Tijeras Afiladas</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td> Tijeras de</tr><tr><td>Micro Disección 4" Rectas Romanas/Romanas</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td><td>Tijeras</td></tr><tr><td>Romanas Toallitas</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>arnés</td></tr><tr><td>Sistema PhysioSuite</td><td>Kent</td><td>Scientific PhysioSuite</td><td>Vitals Monitor</td></tr><tr><td>1 ml Jeringa, Tuberculina Punta deslizante</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Jeringa</td></tr><tr><td>Grapas de</td><td>acrilato de ciano</td><td>LOC1647358</td><td>Adhesivo de deslizamiento</td></tr><tr><td>de cubierta Vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td><td>Adaptador de barrera de agua</td></tr><tr><td>Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm</td><td>Aparato Harvard</td><td>Conector de</td><td>catéter</td>734118</tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT Oxímetro de pulso</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurano)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de bola de PVC, empuje para conectar, 1/4 de pulgada</td><td>Grainger</td><td>3CGJ7</td><td>Válvula de vacío</td></tr><tr><td>Ventilador para animales pequeños</td><td>Harvard Apparatus</td><td>683</td><td>La alternativa está disponible en Kent Scientific: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Ratones</td><td>Jackson Laboratory</td><td>026051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico</td><td></td><td>Olympus Fluoview FV1000</td><td>Alternativa al visor personalizado</td></tr><tr><td>Recinto ambiental</td><td>Cámara de plásticos de precisión</td><td>para FV1000</td><td>Alternativa a la carcasa</td></tr> personalizada <tr><td>Salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potencia láser Campo</td><td>coherenteMaxIITOP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de medidor de potencia láser</td><td></td><td>coherente PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-trébol vector de proteína fluorescente</td><td>addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>g418 antibiótico selectivo de sulfato</td><td>thermofisher scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo clasificador de células fluorescentes&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Malla</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Plato de Pocillos</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plato de Cultivo</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Plato de Cultivo</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Laboratorio Mouse</td><td>Jackson</td><td>000664&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kim Toallitas</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

a largo plazo de alta resolución microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío estabilizado

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

La metástasis a sitios secundarios tales como el pulmón, el hígado y los huesos es un evento traumático con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 90% 1. De estos sitios, el pulmón es el más difícil de evaluar el uso de imágenes ópticas intravital debido a su posición cerrada dentro del cuerpo, la naturaleza delicada y papel vital en el mantenimiento de la fisiología adecuada. Mientras modalidades clínicas (tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética (MRI) y tomografía computarizada (TC)) son capaces de proporcionar imágenes no invasivas de este tejido, que carecen de la resolución necesaria para visualizar los eventos de siembra tempranas, con un solo píxel que consta de casi un millar de células. Los modelos actuales de pulmón metastásico postulado de siembra que los eventos justo después de la llegada de una célula tumoral son deterministas para la supervivencia y el crecimiento subsiguiente. Esto significa que se requieren herramientas de imágenes intravital en tiempo real con la resolución de una sola célula 2 con el fin de definir los fenotipos de la cel siembrals y poner a prueba estos modelos. Si bien las imágenes ópticas de alta resolución del pulmón se ha realizado utilizando diversas preparaciones ex vivo, estos experimentos son típicamente ensayos solo punto de tiempo y son susceptibles a artefactos y posibles conclusiones erróneas debido al ambiente dramáticamente alterado (temperatura, profusión, citoquinas, etc. ) como resultado de la eliminación de la cavidad torácica y el sistema circulatorio 3. Trabajos recientes han demostrado que las imágenes ópticas intravital-lapso de tiempo del pulmón intacta es posible utilizando un vacío estabiliza 2,4,5 ventana de imagen, sin embargo, los tiempos típicos de imagen se han limitado a aproximadamente 6 horas. Aquí se describe un protocolo para la realización de formación de imágenes intravital de lapso de tiempo a largo plazo del pulmón utilizando una ventana tal durante un período de 12 horas. Las secuencias de imágenes con lapso de tiempo obtenidos utilizando este método permiten la visualización y la cuantificación de las interacciones célula-célula, dinámica de la membrana y la perfusión vascular en el pulmón. más nos dESCRIBE una técnica de procesamiento de imágenes que proporciona una visión sin precedentes clara de la microvasculatura pulmonar.

Para demostrar el tipo de resultados que se pueden conseguir con este método, se inyectaron células tumorales E0771-LG etiquetados con el trébol de la proteína fluorescente en la vena caudal de los ratones MacBlue 44 en diferentes puntos de tiempo antes de la cirugía. Después de la cirugía, 155 kD rodamina dextrano marcado se inyectó IV para marcar se llevó a cabo la formación de imágenes vasculatura y de lapso de tiempo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

El objetivo general de este método es realizar imágenes de célula individual con resolución alta y a largo plazo del pulmón intacto utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer; por ejemplo, qué interacciones se establecen entre las células del estroma y las células tumorales durante las primeras etapas de la metástasis. La principal ventaja de esta técnica es que el pulmón intacto y vivo puede visualizarse teóricamente con resolución de célula individual durante hasta 12 horas.Comience atando un trozo de 2,5 cm de longitud de sutura 2-0 a un catéter traqueal, a 0,6 cm por encima del casquillo, con un nudo doble. A continuación, aplique pomada oftálmica a los ojos de un ratón anestesiado y utilice crema depilatoria para eliminar el vello del lado izquierdo del animal, desde la línea media del tórax hasta un cuarto de la espalda y desde la axila hasta justo debajo de la caja torácica. Limpie cualquier crema excesiva y esterilice la piel expuesta con etanol al 70%.A continuación, entube al animal y ate el hilo de sutura 2-0 alrededor del hocico, por debajo de los dientes frontales. Mueva al animal al área quirúrgica, teniendo cuidado de no desalojar los catéteres, y encienda el ventilador.Conecte el ventilador al catéter traqueal. Luego, fije el catéter con cinta adhesiva al hocico y a la pata delantera izquierda al catéter. Después de confirmar la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie, use tijeras afiladas para eliminar un centímetro cuadrado de piel por encima de la pared torácica izquierda.Levante la almohadilla de grasa mamaria y cauterice cualquier vaso sanguíneo expuesto. A continuación, reseccione la almohadilla de grasa y retire la capa muscular hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar la vena axilar en la base del miembro anterior. Utilice pinzas para levantar la sexta costilla.A continuación, sosteniendo las tijeras afiladas en un ángulo bajo de cinco grados, corte el hueso costal cerca del borde de la abertura en la piel. Retire cuatro costillas consecutivas para ampliar la abertura en la pared torácica, exponiendo todo el lóbulo pulmonar. Luego, transfiera cuidadosamente el ratón a la platina del microscopio para la adquisición de imágenes.Con el vacío desactivado, llene la cámara interna de la ventana de vacío con PBS. Invierta al ratón y coloque el pulmón expuesto sobre la ventana de cubreobjetos para imagen de vacío. Encienda lentamente el vacío.Coloque un arnés de sujeción, hecho de papel de tissue doblado por la mitad, dos veces sobre el pecho del ratón y sujete el arnés con cinta adhesiva a la placa de la plataforma. A continuación, coloque un oxímetro de pulso en la pata del animal. Luego, coloque la cámara ambiental sobre la plataforma y encienda el calor para mantener al ratón a una temperatura fisiológica.Cuando el animal esté en posición, acerque la lente objetiva de apertura numérica 25 por 95 al cubreobjetos. En el modo de epifluorescencia, observe el canal fitzy y enfoque el tejido pulmonar. A continuación, cargue una jeringa estéril con 100 microlitros de la suspensión de células tumorales, retire la jeringa de PBS del catéter de la vena caudal y conecte la jeringa con las células tumorales.Inyecte lentamente las células tumorales en la vena de la cola. Luego, reconecte la jeringa de PBS al catéter de la vena de la cola y localice las células tumorales en todo el tejido pulmonar mediante el ocular del microscopio. Ahora, sustituya la jeringa de PBS por una jeringa cargada con 100 microlitros de dextrano de ródamina e inyecte lentamente el dextrano en el ratón a través del catéter de la cola.Después de la administración de dextrano, realice una irrigación con 50 microlitros de PBS estéril. Luego, obtenga imágenes en cada una de las ubicaciones previas de las células tumorales para visualizar el flujo y la integridad de la vasculatura. Veinticuatro horas después de la inyección, pueden observarse células tumorales individuales interactuando con macrófagos y monocitos dentro de la vasculatura.La estabilidad de la imagen es tal que se pueden adquirir Z-stacks secuenciales del campo y generar una reconstrucción tridimensional. Aquí se muestra un mosaico de cinco por cinco campos de imagen, que cubre un campo de visión de 890 micrones, durante 200 y cinco minutos, a 15 micrones por debajo de la superficie del pulmón de una lesión metastásica única, 12 días después de la inyección. A pesar del gran campo de visión, la alta resolución de los fotogramas subyacentes que componen el mosaico permite capturar eventos subcelulares, como la mitosis de una sola célula, evidenciada por la separación cromosómica.La inyección intravascular de un dextrano de alto peso molecular marcado con fluorescencia provoca la marcación de la luz vascular; sin embargo, los eritrocitos y leucocitos circulantes no marcados pueden ocluir el dextrano. En los capilares pequeños del pulmón, esta oclusión provoca un parpadeo de la señal del dextrano y una pérdida de definición en los límites vasculares. La alta estabilidad espacial proporcionada por este protocolo permite el promediado temporal del canal sanguíneo sin desenfoque, restaurando así las oclusiones temporales.Los otros canales de señal luego pueden superponerse sobre la vasculatura para obtener una vista clara de los límites de los vasos. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado de no cortar ningún vaso sanguíneo grande sin antes cauterizarlo y evitar tocar el tejido pulmonar por completo.Tras seguir este procedimiento, se pueden visualizar las primeras etapas de la diseminación y proliferación de células tumorales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes intravitales en el pulmón intacto con una ventana de imagen estabilizada por vacío. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.

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Investigación

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Investigación del cáncer

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

En este video, describimos la imagen intravital de un páncreas de ratón a través de una ventana estabilizada para la visualización a largo plazo de la dinámica celular.

Imágenes intravitales: un método para la observación a nivel celular del páncreas de ratón a través de una ventana de imagen estabilizada

Este protocolo describe la imagen intravital de ratones transgénicos que expresaban marcadores fluorescentes específicos de la célula. La proyección de imagen intravital proporciona un método no invasivo para observaciones de alta resolución en animales vivos utilizando windows implantables a través del cual es posible la visualización microscópica de los procesos. Este método es especialmente útil para estudiar procesos longitudinales.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

La microscopía de fluorescencia intravital se puede utilizar para estudiar las interacciones leucocitario-endotelial y la perfusión capilar en tiempo real. Este protocolo describe métodos para obtener imágenes y cuantificar estos parámetros en la microcirculación pulmonar utilizando un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas por vacío.

Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprenda microscopía intravital de alta resolución en pulmón intacto usando una ventana de imagen estabilizada por vacío. Este método permite visualizar interacciones célula-tumor durante la metástasis durante hasta 12 horas.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

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