A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado
6 de octubre de 2016
Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.
El objetivo general de este método es realizar imágenes de célula individual con resolución alta y a largo plazo del pulmón intacto utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer; por ejemplo, qué interacciones se establecen entre las células del estroma y las células tumorales durante las primeras etapas de la metástasis. La principal ventaja de esta técnica es que el pulmón intacto y vivo puede visualizarse teóricamente con resolución de célula individual durante hasta 12 horas.
Comience atando un trozo de 2,5 cm de longitud de sutura 2-0 a un catéter traqueal, a 0,6 cm por encima del casquillo, con un nudo doble. A continuación, aplique pomada oftálmica a los ojos de un ratón anestesiado y utilice crema depilatoria para eliminar el vello del lado izquierdo del animal, desde la línea media del tórax hasta un cuarto de la espalda y desde la axila hasta justo debajo de la caja torácica. Limpie cualquier crema excesiva y esterilice la piel expuesta con etanol al 70%.
A continuación, entube al animal y ate el hilo de sutura 2-0 alrededor del hocico, por debajo de los dientes frontales. Mueva al animal al área quirúrgica, teniendo cuidado de no desalojar los catéteres, y encienda el ventilador.
Conecte el ventilador al catéter traqueal. Luego, fije el catéter con cinta adhesiva al hocico y a la pata delantera izquierda al catéter. Después de confirmar la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie, use tijeras afiladas para eliminar un centímetro cuadrado de piel por encima de la pared torácica izquierda.
Levante la almohadilla de grasa mamaria y cauterice cualquier vaso sanguíneo expuesto. A continuación, reseccione la almohadilla de grasa y retire la capa muscular hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar la vena axilar en la base del miembro anterior. Utilice pinzas para levantar la sexta costilla.
A continuación, sosteniendo las tijeras afiladas en un ángulo bajo de cinco grados, corte el hueso costal cerca del borde de la abertura en la piel. Retire cuatro costillas consecutivas para ampliar la abertura en la pared torácica, exponiendo todo el lóbulo pulmonar. Luego, transfiera cuidadosamente el ratón a la platina del microscopio para la adquisición de imágenes.
Con el vacío desactivado, llene la cámara interna de la ventana de vacío con PBS. Invierta al ratón y coloque el pulmón expuesto sobre la ventana de cubreobjetos para imagen de vacío. Encienda lentamente el vacío.
Coloque un arnés de sujeción, hecho de papel de tissue doblado por la mitad, dos veces sobre el pecho del ratón y sujete el arnés con cinta adhesiva a la placa de la plataforma. A continuación, coloque un oxímetro de pulso en la pata del animal. Luego, coloque la cámara ambiental sobre la plataforma y encienda el calor para mantener al ratón a una temperatura fisiológica.
Cuando el animal esté en posición, acerque la lente objetiva de apertura numérica 25 por 95 al cubreobjetos. En el modo de epifluorescencia, observe el canal fitzy y enfoque el tejido pulmonar. A continuación, cargue una jeringa estéril con 100 microlitros de la suspensión de células tumorales, retire la jeringa de PBS del catéter de la vena caudal y conecte la jeringa con las células tumorales.
Inyecte lentamente las células tumorales en la vena de la cola. Luego, reconecte la jeringa de PBS al catéter de la vena de la cola y localice las células tumorales en todo el tejido pulmonar mediante el ocular del microscopio. Ahora, sustituya la jeringa de PBS por una jeringa cargada con 100 microlitros de dextrano de ródamina e inyecte lentamente el dextrano en el ratón a través del catéter de la cola.
Después de la administración de dextrano, realice una irrigación con 50 microlitros de PBS estéril. Luego, obtenga imágenes en cada una de las ubicaciones previas de las células tumorales para visualizar el flujo y la integridad de la vasculatura. Veinticuatro horas después de la inyección, pueden observarse células tumorales individuales interactuando con macrófagos y monocitos dentro de la vasculatura.
La estabilidad de la imagen es tal que se pueden adquirir Z-stacks secuenciales del campo y generar una reconstrucción tridimensional. Aquí se muestra un mosaico de cinco por cinco campos de imagen, que cubre un campo de visión de 890 micrones, durante 200 y cinco minutos, a 15 micrones por debajo de la superficie del pulmón de una lesión metastásica única, 12 días después de la inyección. A pesar del gran campo de visión, la alta resolución de los fotogramas subyacentes que componen el mosaico permite capturar eventos subcelulares, como la mitosis de una sola célula, evidenciada por la separación cromosómica.
La inyección intravascular de un dextrano de alto peso molecular marcado con fluorescencia provoca la marcación de la luz vascular; sin embargo, los eritrocitos y leucocitos circulantes no marcados pueden ocluir el dextrano. En los capilares pequeños del pulmón, esta oclusión provoca un parpadeo de la señal del dextrano y una pérdida de definición en los límites vasculares. La alta estabilidad espacial proporcionada por este protocolo permite el promediado temporal del canal sanguíneo sin desenfoque, restaurando así las oclusiones temporales.
Los otros canales de señal luego pueden superponerse sobre la vasculatura para obtener una vista clara de los límites de los vasos. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado de no cortar ningún vaso sanguíneo grande sin antes cauterizarlo y evitar tocar el tejido pulmonar por completo.
Tras seguir este procedimiento, se pueden visualizar las primeras etapas de la diseminación y proliferación de células tumorales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes intravitales en el pulmón intacto con una ventana de imagen estabilizada por vacío. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo describe el uso de la microscopía de multiphotón para realizar imágenes de célula individual con resolución elevada y a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real, mediante una ventana de imagen estabilizada por vacío. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación del cáncer sobre las interacciones entre las células del estroma y las células tumorales durante la metástasis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Investigación del cáncer
Antecedentes
- La imagenología a largo plazo de tejidos vivos es fundamental para comprender las interacciones celulares.
- La microscopía de múltiples fotones permite obtener imágenes de alta resolución.
- Esta técnica puede visualizar el pulmón intacto con resolución a nivel de célula individual.
- Comprender la metástasis es esencial para desarrollar terapias contra el cáncer.
Objetivo del estudio
- Visualizar las interacciones entre las células estromales y tumorales.
- Profundizar en la comprensión de las primeras etapas de la metástasis.
- Proporcionar un método para la obtención de imágenes a largo plazo del tejido pulmonar.
Métodos Utilizados
- Microscopía de múltiples fotones para la obtención de imágenes.
- Uso de una ventana de imagen estabilizada al vacío.
- Preparación del modelo de ratón para la obtención de imágenes.
- Aplicación de anestésicos y pomada oftálmica para el bienestar animal.
Resultados principales
- Visualización exitosa del pulmón intacto durante hasta 12 horas.
- Imágenes de alta resolución de células individuales obtenidas.
- Información sobre las interacciones celulares durante la metástasis.
- Demuestra la eficacia del método en imágenes en vivo.
Conclusiones
- Este método proporciona una herramienta poderosa para la investigación del cáncer.
- La imagenología a largo plazo puede revelar procesos biológicos críticos.
- Estudios futuros pueden basarse en esta técnica para obtener conocimientos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagenología intravital a largo plazo del pulmón intacto permite la observación directa de eventos metastásicos tempranos con resolución a nivel de célula individual, abordando una brecha crítica en la investigación preclínica del cáncer. Esta capacidad facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización de las interacciones entre el tumor y el estroma, así como de la dinámica vascular en un contexto fisiológicamente relevante. Estas observaciones mejoran la validación de dianas terapéuticas y la confianza predictiva en las etapas de descubrimiento de fármacos oncológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de interacciones en tiempo real entre células tumorales y componentes estromales durante la iniciación de la metástasis.
- Valor operativo: Proporciona validación funcional de dianas mediante la observación directa de fenotipos celulares en tejido íntegro.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar los principales factores moleculares impulsores del establecimiento metastásico temprano.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de interacciones entre células, dinámica de membranas y perfusión para la calibración de ensayos.
- Valor operativo: Establece condiciones de imagen reproducibles durante 12 horas, lo que permite la evaluación consistente de los efectos de compuestos.
- Escalabilidad: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para flujos de trabajo de cribado de alto contenido.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Une el descubrimiento y la validación preclínica al mantener la relevancia fisiológica durante la observación longitudinal.
- Decisiones Ajustadas al Riesgo: Orienta los criterios de avance mediante la visualización de eventos subcelulares como la mitosis y la integridad vascular.
- Correlación con Biomarcadores: Permite asociar fenotipos de imagen con posibles biomarcadores traslacionales del potencial metastásico.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, al proporcionar datos dinámicos y cuantitativos sobre los procesos metastásicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar las interacciones entre células estromales y tumorales que determinan la supervivencia y el crecimiento iniciales.
- Cribado: Proporciona condiciones estandarizadas y listas para ensayos, con lecturas cuantitativas de la vascularización y las células, para el cribado de compuestos.
- Analítica: Permite el promedio temporal y la reconstrucción tridimensional para extraer señales vasculares estables y dinámicas subcelulares destinadas al análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Mantiene la integridad del sistema relevante para la enfermedad desde el descubrimiento hasta las etapas preclínicas, apoyando observaciones alineadas con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagenología intravital reutilizable, aplicable en diversos proyectos de oncología que requieran modelos de metástasis pulmonar.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los modelos de metástasis mediante la visualización directa y a largo plazo de las interacciones celulares.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad y la estandarización mediante una ventana estabilizada por vacío y controles ambientales.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar información predictiva temprana sobre la competencia metastásica.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en los efectos anti-metastásicos observados en tejido intacto.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía intravital, microscopía de múltiples fotones y procesamiento de imágenes para la reconstrucción vascular.
- Depende de instrumentación especializada que incluye ventana de imagen estabilizada por vacío, cámara ambiental y objetivos de alta apertura numérica.
- Necesita una estandarización entre equipos para lograr resultados consistentes en las etapas de cirugía, adquisición de imágenes y análisis.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros modelos de tumores o fondos genéticos.
- Está limitado por la complejidad técnica de la cirugía torácica y la necesidad de acceso vascular preciso y estabilización pulmonar.
