A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

El objetivo general de este método es realizar imágenes de célula individual con resolución alta y a largo plazo del pulmón intacto utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer; por ejemplo, qué interacciones se establecen entre las células del estroma y las células tumorales durante las primeras etapas de la metástasis. La principal ventaja de esta técnica es que el pulmón intacto y vivo puede visualizarse teóricamente con resolución de célula individual durante hasta 12 horas.

Comience atando un trozo de 2,5 cm de longitud de sutura 2-0 a un catéter traqueal, a 0,6 cm por encima del casquillo, con un nudo doble. A continuación, aplique pomada oftálmica a los ojos de un ratón anestesiado y utilice crema depilatoria para eliminar el vello del lado izquierdo del animal, desde la línea media del tórax hasta un cuarto de la espalda y desde la axila hasta justo debajo de la caja torácica. Limpie cualquier crema excesiva y esterilice la piel expuesta con etanol al 70%.

A continuación, entube al animal y ate el hilo de sutura 2-0 alrededor del hocico, por debajo de los dientes frontales. Mueva al animal al área quirúrgica, teniendo cuidado de no desalojar los catéteres, y encienda el ventilador.

Conecte el ventilador al catéter traqueal. Luego, fije el catéter con cinta adhesiva al hocico y a la pata delantera izquierda al catéter. Después de confirmar la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie, use tijeras afiladas para eliminar un centímetro cuadrado de piel por encima de la pared torácica izquierda.

Levante la almohadilla de grasa mamaria y cauterice cualquier vaso sanguíneo expuesto. A continuación, reseccione la almohadilla de grasa y retire la capa muscular hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar la vena axilar en la base del miembro anterior. Utilice pinzas para levantar la sexta costilla.

A continuación, sosteniendo las tijeras afiladas en un ángulo bajo de cinco grados, corte el hueso costal cerca del borde de la abertura en la piel. Retire cuatro costillas consecutivas para ampliar la abertura en la pared torácica, exponiendo todo el lóbulo pulmonar. Luego, transfiera cuidadosamente el ratón a la platina del microscopio para la adquisición de imágenes.

Con el vacío desactivado, llene la cámara interna de la ventana de vacío con PBS. Invierta al ratón y coloque el pulmón expuesto sobre la ventana de cubreobjetos para imagen de vacío. Encienda lentamente el vacío.

Coloque un arnés de sujeción, hecho de papel de tissue doblado por la mitad, dos veces sobre el pecho del ratón y sujete el arnés con cinta adhesiva a la placa de la plataforma. A continuación, coloque un oxímetro de pulso en la pata del animal. Luego, coloque la cámara ambiental sobre la plataforma y encienda el calor para mantener al ratón a una temperatura fisiológica.

Cuando el animal esté en posición, acerque la lente objetiva de apertura numérica 25 por 95 al cubreobjetos. En el modo de epifluorescencia, observe el canal fitzy y enfoque el tejido pulmonar. A continuación, cargue una jeringa estéril con 100 microlitros de la suspensión de células tumorales, retire la jeringa de PBS del catéter de la vena caudal y conecte la jeringa con las células tumorales.

Inyecte lentamente las células tumorales en la vena de la cola. Luego, reconecte la jeringa de PBS al catéter de la vena de la cola y localice las células tumorales en todo el tejido pulmonar mediante el ocular del microscopio. Ahora, sustituya la jeringa de PBS por una jeringa cargada con 100 microlitros de dextrano de ródamina e inyecte lentamente el dextrano en el ratón a través del catéter de la cola.

Después de la administración de dextrano, realice una irrigación con 50 microlitros de PBS estéril. Luego, obtenga imágenes en cada una de las ubicaciones previas de las células tumorales para visualizar el flujo y la integridad de la vasculatura. Veinticuatro horas después de la inyección, pueden observarse células tumorales individuales interactuando con macrófagos y monocitos dentro de la vasculatura.

La estabilidad de la imagen es tal que se pueden adquirir Z-stacks secuenciales del campo y generar una reconstrucción tridimensional. Aquí se muestra un mosaico de cinco por cinco campos de imagen, que cubre un campo de visión de 890 micrones, durante 200 y cinco minutos, a 15 micrones por debajo de la superficie del pulmón de una lesión metastásica única, 12 días después de la inyección. A pesar del gran campo de visión, la alta resolución de los fotogramas subyacentes que componen el mosaico permite capturar eventos subcelulares, como la mitosis de una sola célula, evidenciada por la separación cromosómica.

La inyección intravascular de un dextrano de alto peso molecular marcado con fluorescencia provoca la marcación de la luz vascular; sin embargo, los eritrocitos y leucocitos circulantes no marcados pueden ocluir el dextrano. En los capilares pequeños del pulmón, esta oclusión provoca un parpadeo de la señal del dextrano y una pérdida de definición en los límites vasculares. La alta estabilidad espacial proporcionada por este protocolo permite el promediado temporal del canal sanguíneo sin desenfoque, restaurando así las oclusiones temporales.

Los otros canales de señal luego pueden superponerse sobre la vasculatura para obtener una vista clara de los límites de los vasos. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado de no cortar ningún vaso sanguíneo grande sin antes cauterizarlo y evitar tocar el tejido pulmonar por completo.

Tras seguir este procedimiento, se pueden visualizar las primeras etapas de la diseminación y proliferación de células tumorales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes intravitales en el pulmón intacto con una ventana de imagen estabilizada por vacío. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.