Name: Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende a realizar grabaciones de patch clamp de células amacrinas Starburst en preparaciones de retina plana de ratón. Este método permite estudiar la diversidad neuronal y las conexiones sinápticas en neurobiología retinal.

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Agradecemos a Joung Jang y Xin Guan por su asistencia técnica. Agradecemos al Dr. Rory McQuiston de la Universidad de la Commonwealth de Virginia por establecer nuestro primer equipo de abrazadera de parche y por asesorarnos sobre los procedimientos experimentales. Agradecemos al Dr. Samuel Wu por sus sugerencias sobre el registro de pinzas de voltaje. El trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de los NIH EY013811, EY022228 y un EY002520 de subvenciones de Vision Core. C-KC es la cátedra de la Fundación Alice R. McPherson para la Investigación de la Retina en el Baylor College of Medicine.

Ética aprobación - los procedimientos que implican sujetos animales se realizaron de conformidad con las reglas y regulaciones de los Institutos Nacionales de Salud de los animales de investigación, tal como fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el uso comité de Baylor College of Medicine. 1. externa y de soluciones internas <ol><li> Use la solución de Ringer de mamíferos durante la disección retina y como la solución externa de registro electrofisiológico posterior. Preparar la solución de Ringer mamífero de la solución madre 10x (sin calcio) en el día de la grabación, y añadir CaCl2 gota a gota, después de 15 minutos de carbogenation (95% de O2 y 5% de CO 2). La solución final 1x contiene (en mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 y 10 D-glucosa. </li><li> Use dos soluciones internas para caracterizar las oscilaciones SAC. Pruebala utilidad de las soluciones preparadas en las grabaciones de patch clamp de células enteras prolongados en CGR de ratón adulto y almacenar los lotes verificados en 500 ml de alícuotas a -20 ° C hasta su uso. <ol><li> Para la grabación de potencial de membrana de oscilación, utilice una solución interna a base de potasio que contiene (en mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES y 0,2% biocitina (w / v). Ajustar el pH a 7,3 con KOH. </li><li> Para la grabación de excitación y de las corrientes postsinápticas inhibitorias, utilice una solución interna a base de cesio que contiene (en mM): 100 Cs-metanosulfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES y 0,2% biocitina ( Virginia Occidental). Ajustar el pH a 7,3 con CsOH. </li></ol></li></ol> 2. Preparación para el Día de la grabación <ol><li> Para preparar una membrana de nitrocelulosa con los agujeros abiertos, perforar manualmente la membrana con un golpeador personalizada a partir de una 16 G aguja de la jeringa romo y aplanar la membrana entre dos placas de vidrio limpias. Por su conjunto-montar retina, hacer un agujero central de 0,2 mm de diámetro y rodearlo de 4 agujeros más grandes que son 1-1,2 mm de diámetro. </li><li> Para hacer un filamento de material de relleno a medida para cargar solución interna en los electrodos, fundir una punta de pipeta de 10 l en el medio y alargar suavemente la parte fundida hasta que se enfría y se endurece. Justo antes de usar, usar una hoja de afeitar limpia para cortar el filamento hasta que es ligeramente más largo que las pipetas de parche. </li><li> Tire de pipetas de parche en un extractor programable de tubo de vidrio de borosilicato con un filamento interno. Fabricación las micropipetas el día del experimento y utilizarlos inmediatamente. NOTA: Para las ZEC de grabación, se utiliza la siguiente configuración de tirador: calor: 484; tire: 0; velocidad: 25; el tiempo de retardo: 1; presión: 400 y un valor de rampa de 462. El OD e ID de los tubos de borosilicato son 1,65 mm y 1,0 mm, respectivamente. Resistencia de las pipetas es 10-14 mO. </li><li> Una hora antes de la cosecha de tejidos, descongelar un tubo de solución interna por Shaking en un vórtice para&gt; 30 min. </li></ol> 3. La disección de la retina <ol><li> Anestesiar al animal en un 4% de isoflurano en oxígeno hasta que el animal pierde la capacidad de respuesta a una pizca dedo del pie. Sacrificar al animal por dislocación cervical. </li><li> Corte ambos globos oculares fuera de los nervios ópticos a 1-2 mm de distancia de las cabezas del nervio óptico con Iris-rectas señalado tijeras. </li><li> Rollo de los globos oculares en una toalla de papel limpia para eliminar la sangre y luego sumergirlos en una solución de Ringer carbogenated mamíferos. Haz un agujero en el limbo con una aguja de 23 G y la bisectriz de los globos oculares cortando a lo largo del limbo con micro-tijeras. Retire la córnea y el cristalino utilizando unas pinzas finas. <ol><li> Para todo el montaje de la retina, pelar suavemente toda la retina fuera del epitelio pigmentado con unas pinzas finas y hacer cortes cuatro 1,5-2 mm ortogonales desde el borde hacia la cabeza del nervio óptico. </li></ol></li><li> Sumergir una membrana de nitrocelulosa perforado en el plato y arrastrar suavemente sobre la retina conGCL el lado hacia arriba. Coloque la cabeza del nervio óptico en el orificio central en la preparación de todo el montaje en una retina. La transferencia de la membrana con la retina en otro plato limpio. aplanar suavemente la retina con un pincel fino para parecerse a una cruz de Malta y sentar los cuatro bordes a través de los agujeros. <ol><li> Si una fracción de la retina debe ser examinado en un momento, corte cada ocular preparado a partir de la Etapa 3.3 en 3-4 piezas con una cuchilla de afeitar con el epitelio pigmentado permanece unido. Proteger las piezas no utilizadas de la luz en la solución externa carbogenated y usarlos dentro de las 12 horas. </li></ol></li><li> Seque la membrana de nitrocelulosa con un trozo de papel de filtro seco y eliminar la membrana limitante interna vítreo y con unas pinzas y un pincel. </li><li> Asegúrese de que todos los bordes de la retina están totalmente unidos a la membrana antes de transferir el conjunto en la cámara de grabación con un cubreobjetos de vidrio sellado en la parte inferior. Asegure la membrana con grasa de vacío a la hoja de la cubierta y rehydrate la retina con la solución externa. Tenga cuidado no para atrapar las burbujas de aire debajo de la asamblea. </li><li> Ajuste la cámara en el escenario de un microscopio vertical. Perfundir la cámara con (34-35 ° C) solución externa caliente carbogenated a una velocidad de ~ 3 ml por min. </li><li> Examinar la retina bajo una lente objetivo de 10x primero y, a continuación, utilizar una lente de 60x de inmersión en agua para ver neuronas GCL y INL bajo contraste de interferencia diferencial (DIC) y / o de epifluorescencia. Para visualizar las ZEC tdTomato expresan, utilice una fuente de luz blanca LED en combinación con un filtro de excitación de 554 nm y un filtro de emisión de 581 nm. </li></ol> 4.-Patch Clamp células enteras de grabación del plano de montaje en la retina <ol><li> Filtrar la solución interna a través de un filtro de jeringa en el filamento relleno personalizado. </li><li> Inserte el filamento en una micropipeta recién tirada y dispensar la solución interna cerca de la punta hasta que la solución cubre el electrodo de alambre de plata para&gt;5 mm. Sujetar la micropipeta sobre un soporte del electrodo con un poste de succión, a través del cual la presión dentro del electrodo se puede ajustar empujando o tirando el émbolo de una jeringa de plástico de 10 ml de tubo conectado. </li><li> Encuentra la pipeta con arreglo al objetivo y llevarlo hasta ~ 100 m por encima de la retina. Bajo el modo actual seguidor (I = 0), el uso DC offset a cero la señal de tensión de corriente continua de pie. Mida la resistencia de la pipeta bajo la grapa de corriente en modo (I Clamp) mediante la inyección de corrientes de onda cuadrada de amplitud fija a través de la pipeta mientras está en el baño y neutralizar la diferencia girando el mando rAccede. Utilice la lectura en el pomo rAccede para calcular la resistencia de la pipeta por la ley de Ohm. </li><li> Poco a poco llevar el electrodo de ~ 10 m por encima de la retina. Aplicar presión positiva al electrodo. Ver el cambio de la reflexión cerca de la punta de la pipeta cuando se aproxima a la retina. Rápidamente, pero forzar suavemente la pipeta en el GCL y reducir el pressu positivovolver inmediatamente. </li><li> Mover la pipeta hacia una neurona marcada. Evitar el contacto con otras neuronas, vasos sanguíneos y endfeet de células de Muller. Aplique presión más positiva si es necesario para evitar la obstrucción del electrodo. </li><li> Coloque la punta de la pipeta cerca de la línea media de una neurona marcada hasta un hoyuelo es visible. Liberar la presión positiva y permitir que la membrana plasmática para rebotar de nuevo en la punta de la pipeta. </li><li> Aplicar 20 a 120 pA corrientes negativas a la pipeta para ayudar a la formación de un sello giga-ohm. Aplicar una succión suave si es necesario tirar de la membrana plasmática en la pipeta. Esperar 5 min después de la formación del sello a la ruptura de la membrana celular. Esto permite que la solución interna derramado a que se solucione mediante superfusión. Romper la membrana por una suave succión. </li><li> Después de la ruptura de la membrana y en el modo de fijación de corriente, cambiar el equilibrio del puente y ajustar con el mando rAccede. NOTA: Para una pequeña celda como el SAC, sólo es necesario un ligero ajuste, en su caso. Alterntivamente, ficha excitatoria y inhibitoria postsináptica corrientes en el modo de fijación de voltaje (V Clamp) por la celebración de la célula en los potenciales de inversión de cloruro (alrededor de -75 mV) y glutamato (en torno a 0 mV), respectivamente. Comprobar y ajustar la posición de la pipeta si es necesario para dar cabida a la retina ocasional y / o la deriva micromanipulador. </li><li> Para grabar el potencial de membrana o cambio de corriente antes, durante y después del tratamiento farmacológico, preparar bloqueadores sinápticas (por ejemplo, CNQX, AP5, picrotoxina, tubocurarina, etc.) y moduladores del canal (por ejemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenámico, etc.) fresca en el día del experimento de las existencias congeladas. Diluir los fármacos con solución de Ringer carbogenated. Aplicarlos de manera lotes a través de la perfusión. </li><li> Después de la grabación, eliminar suavemente la pipeta del soma. Transferir el conjunto de la cámara a un plato limpio. Desconecte y vuelva a colocar la retina en otra membrana de nitrocelulosa aplanado y sin hol perforadaes para asegurar la planitud retina durante la fijación. </li><li> Fijar la retina por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 30 min a RT. Retire la retina de la membrana de nitrocelulosa y enjuagarlo extensamente con PBS 1x. Revelar la morfología de las células registradas por O tinción / N con estreptavidina conjugada con colorante diluido en 1x PBS con 0,4% de Triton X-100 a 4 ° C 14. Montar la retina en un medio antifade y observar las células grabados utilizando un microscopio confocal de barrido. NOTA: Los procedimientos que implican paraformaldehído, que es volátil y tóxico, deben llevarse a cabo en un proyecto de la cámara de seguridad. </li></ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
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<li>Hoggarth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+wiring+of+distinct+amacrine+cells+in+the+directionally+selective+retinal+circuit+permits+independent+coding+of+direction+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size.</a> Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).</li>
<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchos laboratorios han registrado desde las neuronas GCL en la preparación 15-18 plana de montaje, pero nuestros procedimientos permiten la grabación de las neuronas de la INL. Por la presente hacemos hincapié en varios pasos que son críticos para las grabaciones de rutina con éxito. La frescura y planeidad de la retina son importantes para penetrar en él con una pipeta de grabación. En este sentido, la firma de la unión de la retina a la membrana de nitrocelulosa perforado es de...

Como parte fácilmente accesible del sistema nervioso central, la retina ha sido durante décadas un modelo útil en los estudios de neurociencia. El marcaje genético de las neuronas ha permitido una caracterización detallada de las conexiones sinápticas en la retina. Con muchas metodologías disponibles para examinar la función y la morfología de las neuronas de la retina, la técnica de registro de pinzas de parche ha sido fundamental en nuestra comprensión actual de las señales transmitidas verticalmente en la retina. Estas señales se originan a partir de la absorción de fotones en los fotorreceptores y se envían a los centros visuales del cerebro a través de la estimulación de las células ganglionares de la retina (RGC). A pesar de la gran cantidad de conocimientos acumulados hasta ahora, la diversidad neuronal en la retina vascularizada de los mamíferos sigue sin resolverse y obstruye la apreciación completa de los circuitos retinianos que subyacen a la visión normal. Esto se debe en parte a que la mayoría de las grabaciones se realizaron en cortes de retina para intercambiar la integridad del circuito lateral por el acceso a las neuronas retinianas más proximales1-3. Para obtener una imagen completa de cómo la retina computa las señales visuales, es deseable registrar las neuronas en montajes planos en los que las conexiones laterales, grandes y pequeñas, pueden conservarse mejor.
Cuando la transmisión sináptica de los fotorreceptores a las células bipolares se interrumpe debido a una vía de señalización defectuosa del receptor metabotrópico de glutamato 6 (mGluR6) en las células bipolares despolarizadas4-6 o simplemente como resultado de la pérdida de fotorreceptores en retinas degeneradas7-10, muchas RGC exhiben actividades oscilatorias. Estas oscilaciones se originan en múltiples fuentes, sin embargo, la que involucra el acoplamiento de la unión de brecha entre las células amacrinas AII (AII-AC) y las células bipolares de cono despolarizante (DCBC) ha recibido la mayor atención y, por lo tanto, se comprende mejor1,7,11. Hemos encontrado otra fuente, que persiste bajo bloqueo farmacológico de la red AII-AC/DCBC antes mencionada y que impulsa la oscilación de SACs de tipo OFF en ratones RhoΔCTA y Nob con retinas deafferentes7,8,12. A continuación, detallamos nuestro protocolo de preparación de monturas planas de retina para el registro de neuronas INL. Este enfoque utiliza líneas de ratones comerciales (código Jax 006410 y 007905) para marcar las neuronas colinérgicas de la retina mediante la expresión de proteínas fluorescentes (tdTomato) que son identificables bajo un microscopio fluorescente equipado con óptica de mejora de contraste. Algunos resultados experimentales obtenidos a través de este abordaje han sido reportados previamente4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>Microscopio fluorescente de platina fija con micromanipuladores DIC</td><td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de pinza de parche</td> Sistema <td>A-M</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>Convertidor AD</td><td>National Instrument</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de calefacción</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>En línea calentador</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Rainin</td><td>Dynamax</td><td></td></tr><tr><td>extractor de pipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio con filamento</td><td>King Precision Glass</td><td>Estimulador personalizado</td><td></td></tr><tr><td></td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-metanosulfonato</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>Rainin</td><td></td><td></td>17013002</tr><tr><td>10 &mu; l punta de pipeta</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp grabación de células amacrinas starburst en un plano de montaje preparación de deafferentated retina del ratón

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

La retina de mamífero es un tejido en capas compuesta de múltiples tipos neuronales. Para entender cómo las señales visuales se procesa dentro de su red sináptica intrincada, registros electrofisiológicos se utilizan con frecuencia para estudiar las conexiones entre las neuronas individuales. Hemos optimizado un preparado de montaje plana para la grabación de patch clamp de neuronas marcadas genéticamente en tanto GCL (capa de células ganglionares) y INL (capa nuclear interna) de las retinas de ratones. Grabación de las neuronas en INL-montajes planos se ve favorecida sobre las rebanadas porque las conexiones verticales y laterales se conservan en la antigua configuración, permitiendo que los circuitos de la retina con grandes componentes laterales para ser estudiado. Hemos utilizado este procedimiento para comparar las respuestas de las neuronas espejo, mediante asociación en las retinas como las células amacrinas starburst colinérgicos (ZEC).

Grabaciones representativas de dentro y fuera de tipo ZEC de una retina del ratón deafferentated se muestran en la Figura 1. Células colinérgicas en tanto GCL y INL se pueden identificar de forma fiable mediante fluorescencia tdTomato y específicas para la grabación de células enteras patch clamp bajo DIC (Figura 1A) para revelar la oscilación de sus potenciales de membrana (Top trazas) y las corrientes sinápticas que la impulsan (trazas de fondo, <stron...

Este protocolo muestra cómo realizar la grabación de células enteras patch clamp en neuronas de la retina de una preparación plana de montaje.

Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar grabaciones de voltaje con parche en células completas de neuronas de la retina interna en preparaciones de retina de ratón montadas en plano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología retiniana, como la diversidad de las neuronas y sus conexiones sinápticas en condiciones normales y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que se conservan tanto las conexiones verticales como las laterales, lo que permite estudiar circuitos retinianos con componentes laterales amplios.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la retina es un tejido delgado y delicado que debe manipularse con mucho cuidado y paciencia. Sin embargo, la práctica es la mejor manera de dominarlo. Para comenzar este procedimiento, enrolle los ojos del ratón en una toalla de papel limpia para eliminar cualquier rastro de sangre.Luego, sumérjalos en la solución de Ringer para mamíferos carbogenada. A continuación, haga un orificio en el limbo con una aguja de calibre 23 y divida los ojos por la mitad cortando a lo largo del limbo con tijeras microquirúrgicas. Después, retire la córnea y el cristalino utilizando pinzas finas.Para el montaje completo de la retina, desprenda suavemente toda la retina del epitelio pigmentado con pinzas finas y realice cuatro cortes ortogonales de 1,5 a dos milímetros desde el borde hacia la cabeza del nervio óptico. A continuación, sumerja una membrana de nitrocelulosa perforada en la placa e impulse suavemente la retina sobre ella con el lado de la capa ganglionar (GCL) hacia arriba. Luego, coloque la cabeza del nervio óptico en el orificio central al preparar una retina en montaje completo.Posteriormente, transfiera la membrana con la retina a otro recipiente limpio. Aplane suavemente la retina en forma de cruz de Malta con un pincel fino y coloque los cuatro bordes sobre los orificios. Seque la membrana de nitrocelulosa con un trozo de papel filtro seco y retire el humor vítreo y la membrana limitante interna con pinzas y un pincel.Asegúrese de que todos los bordes de la retina estén completamente adheridos a la membrana antes de transferir el conjunto a la cámara de registro con un cubreobjetos de vidrio sellado en la base. Fije la membrana al cubreobjetos con grasa de vacío y rehidrate la retina con la solución externa. Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo del conjunto.A continuación, coloque la cámara sobre la platina de un microscopio vertical. Perfunda la cámara con una solución externa carbogenada a 34 grados Celsius a una velocidad de aproximadamente tres mililitros por minuto. Examine la retina primero con un objetivo de 10x.Luego, utilice un objetivo de inmersión en agua de 60x para observar las neuronas de la capa de células ganglionares (GCL) y de la capa nuclear interna (INL) mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) y en configuración de epifluorescencia. Para visualizar las células amacrinas sustancia P (SAC) que expresan tdTomato, use una fuente de luz LED blanca en combinación con un filtro de excitación de 554 nanómetros y un filtro de emisión de 581 nanómetros. En este procedimiento, filtre la solución interna a través de un filtro de jeringa hacia el filamento personalizado para rellenado posterior.Luego, inserte el filamento en una micropipeta recién jalada y desprenda la solución interna cerca de la punta hasta que la solución cubra el alambre del electrodo de plata por más de cinco milímetros. Posteriormente, sujete firmemente la micropipeta a un porta-electrodos con una conexión de succión a través de la cual se puede ajustar la presión dentro del electrodo empujando o jalando el émbolo de una jeringa de plástico conectada, de 10 mililitros. A continuación, ubique la pipeta debajo del objetivo y bájela hasta aproximadamente 100 micrómetros por encima de la retina.En el modo de seguidor actual, utilice el desplazamiento de corriente continua (DC) para ajustar a cero la señal de voltaje DC constante. Mida la resistencia de la micropipeta en el modo de fijación de corriente inyectando corrientes cuadradas de amplitud fija a través de la micropipeta mientras está en el baño. Neutralice la diferencia girando el botón Raccess y utilice la lectura de este botón para calcular la resistencia de la micropipeta.Después de eso, acerque lentamente el electrodo a unos 10 micrómetros por encima de la retina. Aplique presión positiva al electrodo. Luego, observe cómo cambia el reflejo cerca de la punta de la pipeta mientras se aproxima a la retina.Rápida pero suavemente, introduzca la pipeta en la LCG y reduzca inmediatamente la presión positiva. Mueva la pipeta hacia una neurona marcada y evite el contacto con otras neuronas, vasos sanguíneos y piezas terminales de las células de Müller. Aplique más presión positiva, si es necesario, para evitar el obstrucción del electrodo.A continuación, coloque la punta de la pipeta cerca de la neurona marcada hasta que sea visible un hundimiento. Luego, libere la presión positiva y permita que la membrana plasmática retroceda hasta la punta de la pipeta. Aplique corrientes negativas de 20 a 120 picoamperios a la pipeta para favorecer la formación de un sello gigaohmio.Permitir que la membrana celular recupere su forma tras liberar la presión positiva es importante porque un sello excelente se forma naturalmente entre la membrana y la abertura de la pipeta, lo cual es fundamental para preservar la morfología celular tras la grabación. Si es necesario, aplique una succión suave para atraer la membrana plasmática hacia el interior de la pipeta. Espere cinco minutos tras la formación del sello para romper la membrana celular, con el fin de permitir la eliminación de la solución interna derramada mediante la superfusión.Después de que se haya roto la membrana y mientras se encuentra en el modo de fijación de corriente, active el equilibrio de puente y ajústelo utilizando el botón Raccess. Registre las corrientes postsinápticas excitadoras e inhibitorias en el modo de fijación de voltaje manteniendo la célula en potenciales de inversión. Después del registro, retire suavemente la pipeta del soma.Transfiera el ensamblaje desde la cámara a un recipiente limpio. Luego, despegue y vuelva a adherir la retina sobre otra membrana de nitrocelulosa plana sin hacer perforaciones, para asegurar la planitud de la retina durante la fijación. El tejido ya está listo para la tinción.Estas imágenes muestran que las células colinérgicas tanto en la capa de células ganglionares (GCL) como en la capa nuclear interna (INL) pueden identificarse de manera confiable mediante la fluorescencia de tdTomato y dirigirse para realizar grabaciones de parche en modo de célula completa bajo DIC. La oscilación de sus potenciales de membrana puede revelarse mediante grabación en modo de clamping de corriente, y la oscilación inducida por corrientes sinápticas inhibitorias y excitatorias se revela manteniendo las células a cero milivoltios y a setenta y cinco milivoltios negativos, respectivamente, bajo condiciones de clamping de voltaje. Aquí, la caracterización histológica post registro de las células grabadas indica la morfología dendrítica típica de las células amacrinas sustancia P (SAC) y los niveles de estratificación en la capa plexiforme interna (IPL).Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurar el ensamblaje de la membrana retiniana en la cámara de registro y rehidratarlo sin atrapar burbujas de aire debajo, de manera firme y delicada, para obtener una muestra grabable. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como grabaciones con doble parche para responder preguntas adicionales, como si las oscilaciones de múltiples células objetivo están impulsadas por los mismos mecanismos sinápticos. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología retiniana exploren la sincronicidad de las oscilaciones entre neuronas retinianas vecinas en retinas con degeneración de fotorreceptores.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo eliminar el humor vítreo y preparar una montura plana de la retina para realizar grabaciones con parche a escala completa dirigidas a neuronas retinianas internas.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

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Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón

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