Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón

El objetivo general de este procedimiento es realizar el registro de pinzas de parche de células completas de las neuronas internas de la retina en la preparación de la retina de ratón de montaje plano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología de la retina, como la diversidad de las neuronas, sus conexiones sinápticas en condiciones normales y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que se conservan tanto las conexiones verticales como las laterales, lo que permite estudiar los circuitos de la retina con grandes componentes laterales.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la retina es un tejido delgado y delicado que debe manipularse con mucho cuidado y paciencia. La práctica, sin embargo, es la mejor manera de dominarlo. Para comenzar este procedimiento, enrolle los globos oculares del ratón en una toalla de papel limpia para eliminar la sangre.

Luego, sumérjalos en la solución Ringer de mamíferos carbogenados. A continuación, haz un agujero en el limbo con una aguja de calibre 23 y divide los globos oculares cortando a lo largo del limbo con microtijeras. A continuación, retire la córnea y el cristalino con unas pinzas finas.

En el caso de la retina de montaje completo, despegue suavemente toda la retina del epitelio pigmentado con pinzas finas y haga cuatro cortes ortogonales de 1,5 a dos milímetros desde el borde hacia la cabeza del nervio óptico. Después de eso, sumerja una membrana de nitrocelulosa perforada en el plato y arrastre suavemente la retina sobre ella con el lado GCL hacia arriba. Luego, coloque la cabeza del nervio óptico en el orificio central cuando prepare una retina de montaje completo.

Posteriormente, transfiera la membrana con la retina a otro plato limpio. Aplana suavemente la retina como una cruz de Malta con un pincel fino y coloca los cuatro bordes sobre los agujeros. Seque la membrana de nitrocelulosa con un trozo de papel de filtro seco y retire la membrana limitante vítrea e interna con pinzas y un pincel.

Asegúrese de que todos los bordes de la retina estén completamente unidos a la membrana antes de transferir el conjunto a la cámara de grabación con una cubierta de vidrio sellada en la parte inferior. Asegure la membrana al cubreobjetos con grasa para vacío y rehidrate la retina con la solución externa. Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo del conjunto.

A continuación, coloque la cámara en la platina de un microscopio vertical. Profuse la cámara con una solución externa carbogenada a 34 grados centígrados a una velocidad de aproximadamente tres mililitros por minuto. Primero examine la retina bajo una lente subjetiva de 10x.

A continuación, utilice una lente de inmersión en agua de 60x para ver las neuronas GCL e INL bajo DIC y el entorno epifluorescente. Para visualizar tdTomato expresando SAC, utilice una fuente de luz LED blanca en combinación con un filtro de excitación de 554 nanómetros y un filtro de emisión de 581 nanómetros. En este procedimiento, filtre la solución interna a través de un filtro de jeringa en el filamento de relleno personalizado.

A continuación, inserte el filamento en una micropipeta recién extraída y dispense la solución interna cerca de la punta hasta que la solución cubra el alambre del electrodo de plata durante más de cinco milímetros. A continuación, fije la micropipeta a un portaelectrodos con un tirador de succión a través del cual se puede ajustar la presión dentro del electrodo empujando o tirando del émbolo de una jeringa de plástico de 10 mililitros conectada a un tubo. A continuación, ubique la pipeta debajo del objetivo y bájela hasta unos 100 micrómetros por encima de la retina.

En el modo de seguidor de corriente, use el desplazamiento de CC para poner a cero la señal de voltaje de CC permanente. Mida la resistencia de la pipeta en el modo de pinza amperimétrica inyectando corrientes de onda cuadrada de amplitud fija a través de la pipeta mientras está en el baño. Neutralice la diferencia girando la perilla Raccess y use la lectura para calcular la resistencia de la pipeta.

Después de eso, lleve lentamente el electrodo a unos 10 micrómetros por encima de la retina. Aplique presión positiva al electrodo. Luego, observe cómo cambia el reflejo cerca de la punta de la pipeta a medida que se acerca a la retina.

De forma rápida pero suave, fuerce la pipeta en el GCL y reduzca la presión positiva inmediatamente. Mueva la pipeta hacia una neurona marcada y evite el contacto con otras neuronas, vasos sanguíneos y pies terminales de las células de Müller. Aplique más presión positiva, si es necesario, para evitar la obstrucción de los electrodos.

A continuación, coloque la punta de la pipeta cerca de la neurona marcada hasta que se vea un hoyuelo. A continuación, libere la presión positiva y permita que la membrana plasmática rebote en la punta de la pipeta. Aplique corrientes negativas de 20 a 120 picoamperios a la pipeta para ayudar a la formación de un sello de gigaohmios.

Permitir que la membrana celular se recupere después de liberar la presión positiva es importante porque un excelente sellado formado naturalmente entre la membrana y la abertura de la pipeta es importante para preservar la morfología celular después del registro. Si es necesario, aplique una succión suave para introducir la membrana plasmática en la pipeta. Espere cinco minutos después de la formación del sello para romper la membrana celular con el fin de permitir la eliminación de la solución interna derramada por superfusión.

Después de que la membrana se haya roto y mientras está en el modo de pinza actual, encienda el equilibrio del puente y ajústelo con la perilla Raccess. Registre las corrientes postsinápticas excitadoras e inhibidoras en el modo de pinza de voltaje sosteniendo la celda a potenciales de inversión. Después de grabar, retire suavemente la pipeta del soma.

Transfiera el conjunto de la cámara a un plato limpio. A continuación, separe y vuelva a unir la retina a otra membrana de nitrocelulosa aplanada sin perforar agujeros para garantizar la planitud de la retina durante la fijación. El tejido ya está listo para la tinción.

Estas imágenes muestran que las células colinérgicas tanto en GCL como en INL pueden identificarse de forma fiable mediante la fluorescencia de tdTomato y dirigirse al registro de pinzas de parche de células completas bajo DIC. La oscilación de sus potenciales de membrana se puede revelar mediante el registro de la pinza amperimétrica, y la oscilación impulsada por las corrientes sinápticas inhibitoria y excitatoria se revela manteniendo las celdas a cero milivoltios y menos 75 milivoltios respectivamente en las condiciones de pinza de voltaje. Aquí, la caracterización histológica post-hoke de las células registradas indica la morfología dendrítica típica de SAC y los niveles de estratificación en la IPL.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurar el ensamblaje de la membrana de la retina en la cámara de grabación y rehidratarse sin atrapar burbujas de aire debajo de una manera apretada y delicada para proporcionar una muestra grabable. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los registros de pinza de doble parche, para responder a preguntas adicionales, como si las oscilaciones de las múltiples células objetivo están impulsadas por los mismos mecanismos sinápticos. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología de la retina exploren la sincronicidad de la oscilación entre las neuronas de la retina vecinas en retinas degeneradas con fotorreceptores.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo eliminar el humor vítreo y preparar un montaje plano de retina para la grabación de pinza de parche a gran escala dirigida desde las neuronas internas de la retina.