Name: Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende a adquirir imágenes 3D de alta resolución de embriones de ratón mediante microscopía episcópica. Esta técnica mejora la penetración de tinte para análisis morfométrico detallado en biología del desarrollo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a los Dres. Yichen Huang, Chunming Guo y Zhenfang Zhou por su apoyo técnico. Esta investigación fue financiada por los NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) y la Asociación Americana del Corazón (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Todos los usos de animales son aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital Infantil de Boston. 1. Preparación de muestras <ol><li> apareamiento sincronizado <ol><li> Coloque una C57Bl6 tipo salvaje macho y una hembra juntos en la misma jaula. </li><li> Comprobar la formación de un tapón de apareamiento mañana siguiente temprano. La clavija de acoplamiento (aka, la vagina o el enchufe de la cópula) es una deposición gelatinosa endurecida que bloquea la vagina. </li><li> Ajuste la fecha enchufe como el día embrionario 0,5 (E0.5). </li></ol></li><li> El aislamiento de los embriones de ratón <ol><li> La eutanasia a las mujeres embarazadas por asfixia con CO2. </li><li> Ponga los ratones en posición supina sobre una almohadilla absorbente y rociar región abdominal con un 70% de etanol. </li><li> Levantar la piel y hacer una incisión de 5 mm inicial en la región abdominal caudal utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar y quitar la piel abdominal para exponer completamente los órganos internos </li><li> Cortar cerca de Vagina para extirpar todo el útero. </li><li> Cortar entre sitios de implantación a lo largo de la trompa uterina. Cada segmento o producto de la concepción deben tener un solo embrión en su interior. </li><li> Mantener los segmentos uterinos en solución salina 1x helada tamponada con fosfato (PBS). </li></ol></li><li> la disección de embriones <ol><li> Coloque cada embrión en un plato aparte con helado de PBS en un estereoscopio. </li><li> Retire los tejidos uterinos, la placenta y luego las membranas fetales utilizando secuencialmente pinza de disección finas. </li><li> Transferir el embrión diseccionado a un tubo de 50 ml con 1x PBS enfriado con hielo usando un gran pipeta de transferencia. Evitar la captación de embriones directamente con fórceps para minimizar el daño tisular. </li></ol></li><li> Fijación <ol><li> Fijar los embriones disecados en solución de formalina tamponada neutra al 10% a 4 ° C durante más de 24 horas con al menos 10 volúmenes de muestra de fijador. </li></ol></li><li> El pretratamiento <ol><li> Preparar la solución clarificadora: 4M urea, 10% de glicerol, 4% dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua bidestilada. </li><li> Vuelva a colocar el fijador con la Solución de Compensación. </li><li> gire suavemente la muestra sobre un balancín a temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Intercambiar la solución de aclarado una vez en el segundo y el tercer día. El espécimen se convierte poco a poco clara y translúcida. </li><li> Vuelva a colocar la solución de aclaramiento con formalina al 10% y dejar en un agitador durante 2 días. </li></ol></li><li> Deshidración <ol><li> Se lavan las muestras pretratadas con 1 x PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno. </li><li> Deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente en un agitador suave. Para los embriones E15.5, utilizar una serie de etanol ascendente incluyendo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100% de etanol, 2 hr cada paso. Para los embriones de más edad, el tiempo de incubación debe ser aumentado. </li></ol></li><li> tinción <ol><li> Preparar la solución de tinción: añadir 0.1375 gramos de eosina Y sal disódica y 0,0275 gramos de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) de sal a 50 ml de etanol al 100%. Se agita durante 2 hr. Filtro con un papel de filtro. Almacenar a temperatura ambiente y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio. </li><li> Transferir la muestra a la solución de tinción durante 1 hora. </li><li> Reemplazar con solución de tinción durante la noche fresca y mancha. </li></ol></li><li> Infiltración <ol><li> Preparar solución de infiltración: combinar 100 ml de solución A de JB-4 kit incrustación, 1,25 g de catalizador C, 0.275 g de eosina Y sal disódica y 0,055 g de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) sal. Revuelva para mezclar (200 rpm) en un cubo de hielo durante 2 horas, y luego filtrar con papel de filtro. </li><li> Almacenar la solución de infiltración a 4 ° C y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio. </li><li> La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones: solución de tinción (1: 1), y se incuba durante al menos 3 horas en un puente a 4 ° C. </li><li> La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones e incubar durante 3 hr en un agitador en una habitación fría. </li><li> Reemplazar solución de infiltración una vez al día, y dejar en un cuarto frío en un agitador suave durante tres días más. </li></ol></li></ol> 2. Incorporación <ol><li> Mantenga la solución B y la solución de infiltración en el hielo. </li><li> Hacer Solución incrustación (1:25 de la solución B y la solución de infiltración) inmediatamente antes de la incrustación. </li><li> Orientar el espécimen en un molde de inclusión, a continuación, vierta la solución incrustación fría en el molde de inclusión con suavidad. Vuelva a orientar con un alfiler, si es necesario. </li><li> Use un alfiler para examinar si la solución de incrustación se solidifica. Empuje a cabo primero la muestra, y el ajuste si es necesario. </li><li> Reorientar primero la muestra usando el molde separado para obtener una orientación transversal. </li><li> Poner un soporte de bloque en la parte superior del molde de inclusión. Vierta suavemente la solución incrustación en el molde hasta que el molde y el soporte del bloque están sumergidos mediante la incorporación de soluciones. </li><li> Mantenga la muestra en un recipiente secundario y dejarloen hielo durante 3 - 4 horas en una campana de humos. </li><li> Almacenar las muestras solidificadas en un 4 ° C. </li><li> Despegar el molde de inclusión. Ponga el bloque bajo el microscopio estereoscópico con iluminación oblicua a la posición de la muestra en el bloque de inspeccionar. En la cara del bloque, las líneas de cuadrícula en Todo el espécimen. </li><li> Recortar el bloque para eliminar el acceso cantidad de material aglomerante usando las líneas de la cuadrícula marcados como referencias. </li></ol> 3. Adquisición de imágenes <ol><li> Colocar primero la muestra para el microtomo y obtener una superficie recién cortada. Establecer espesor de corte (por ejemplo, e9.5-10.5, 1,5 micras; e11.5-12.5, 2,0 micras; e13.5-15.5, 2,5 micras; E16.5-mayores, 3 M). Mantenga la muestra / de bloques en la posición inicial del microtomo. </li><li> Montar el microscopio estéreo con zoom horizontalmente hacia la superficie del bloque de la muestra. </li><li> Encienda el ordenador y el microscopio, y ejecutar el software de adquisición de imágenes. </li><li> Visualizar y enfocar la óptica al bloque carabajo la modalidad de &quot;visualización en vivo&quot; de software de imágenes. </li><li> Alinear microscopio y micrótomo si es necesario de modo que el bloque de cara está en el centro de visor. </li><li> Ajuste el zoom de modo que el bloque entero cara está dentro del visor. </li><li> Seleccione la proteína fluorescente (GFP) filtro verde (excitación 470 ± 20 nm, dicroico 495 nm, emisión 525 ± 25 nm) y reorientar, si es necesario. </li><li> Medir y ajustar el tiempo de exposición manualmente (por ejemplo, el 80 - 400 mini-seg). </li><li> Adquirir imágenes del bloque de cara después de cada corte fresco y guardar las imágenes automáticamente, si es posible. </li><li> parámetros importantes de registro incluida la resolución, el espesor de la sección y el zoom. </li><li> Después de terminar la totalidad de la muestra, la exportación y convertir todos los archivos de imagen a formato JPEG si es necesario. </li><li> Invertir todas las imágenes originales usando un software de procesamiento de imágenes y ajustar el brillo y el contraste. </li><li> Guardar todas las imágenes procesadas en una carpeta separada. </li></ol> 4. 3DVisualización <ol><li> Sube todas las imágenes procesadas a un software de visualización 3D siguiendo las instrucciones. </li><li> Resolución de entrada y espesor de corte para convertir todas las imágenes en datos volumétricos (es decir, el tamaño del voxel) y guardar el archivo 3D. </li><li> Alinear todas las imágenes utilizando el modo automático. Ajustar las imágenes individuales de forma manual si es necesario. </li><li> Guarda la imagen alineada con un nuevo nombre de archivo. </li><li> Analizar las características morfométricas de la muestra utilizando el software de visualización 3D. </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29, 700-711 (2013).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+model+mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).</li>
<li>Sizarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+and+molecular+analysis+of+the+arterial+pole+of+the+developing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart.</a> J Anat. 220, 336-349 (2012).</li>
<li>Anderson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+intrapericardial+arterial+trunks+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice.</a> Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).</li>
<li>Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+mammalian+cloacal+morphogenesis+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dev Biol. 409, 106-113 (2016).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, presentamos un protocolo modificado mediante equipos de laboratorio de rutina para adquirir imágenes HREM de serie que son compatibles para la visualización 3D rápida y análisis morfométrico de las estructuras complejas. Debido a que las imágenes de alta resolución se toman directamente de la cara del bloque en lugar de secciones individuales, las características morfológicas finas se conservan y rápidamente reconstruidas digitalmente en un programa de visualización en 3D. im...

El advenimiento de las tecnologías de imagen 3D ha abierto la posibilidad de un análisis sistémico de características morfológicas detalladas durante el desarrollo fetal. En la actualidad se dispone de una variedad de modalidades de obtención de imágenes en 3D, como la resonancia magnética micromagnética (micro-RMN), la microtomografía computarizada, la ecografía de alta frecuencia, la tomografía de coherencia óptica, la tomografía óptica de proyectos y la microscopía episcópica1-4. Cada modalidad tiene sus propias características únicas en resolución, contraste, velocidad, costo, capacidad en el útero y disponibilidad.
La captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) y la microscopía episcópica de alta resolución (HREM) son métodos de obtención de imágenes de microscopía episcópica4. Aquí, las imágenes en serie de alta resolución se capturan continuamente desde la cara del bloque en lugar de secciones de tejido. Las imágenes resultantes reflejan fielmente las características morfológicas detalladas con una distorsión mínima o nula del tejido. Los datos volumétricos adquiridos se convierten fácilmente en imágenes 3D de alta resolución adecuadas para un análisis morfométrico preciso. Debido a su relativo bajo costo y alta resolución, HREM y EPIC se han convertido en las alternativas superiores para la evaluación sistémica de modelos de ratón de defectos congénitos humanos2,4-8.
Tanto los métodos EFIC como los HREM requieren que las muestras se incrusten en el medio adecuado. EFIC detecta la autofluorescencia emitida por el tejido incrustado. Debido a esto, se limita a los especímenes que emiten altos niveles de autofluorescencia, pero no a aquellos con una autofluorescencia relativamente débil, como los embriones en etapas tempranas9. Para superar la dependencia de la autofluorescencia, las muestras se tiñen con un tinte fluorescente como la eosina para la obtención de imágenes HREM. La elección de los colorantes y los métodos de tinción también hacen que la HREM sea más compatible para detectar señales moleculares en el contexto de la arquitectura y la morfología de los tejidos4,10.
En este artículo, presentamos un protocolo HREM mejorado adecuado para la evaluación de cuerpo entero de embriones de ratón en etapa tardía. Para facilitar la tinción, incluimos un paso de pretratamiento para aumentar la penetración en el tejido, lo que permite la obtención de imágenes HREM de embriones de ratón más viejos.

<table><tbody><tr><td>Ratones</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Etílico</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, Absoluto, ACS/USP/Grado Kosher</td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Solución de Limpieza</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>Solución</td></tr> <tr><td>de LimpiezaSulfato de dodecilo sódico</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Solución de limpieza</td></tr><tr><td>Eosina Y sal disódica</td><td>Fisher Solución</td> de <td>infiltración</td>de <td>BP241925</td> científico</tr><tr><td>Acridina Naranja de acridina sal de hemi (cloruro de zinc)</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Solución de infiltración</td></tr><tr><td>Papel Whatman</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Kit de incrustación - Solución A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Kit</td></tr><tr><td>de incrustación de solución de infiltración JB-4 - Solución B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Solución de incrustación</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Kit de incrustación - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Moldes</td></tr><tr><td>de incrustación</td> de soluciones de infiltración <td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>Moldes</td></tr><tr><td>de incrustación afilados Peel-A-Way de</td> 16 x 8 mm <td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1 Cuadrado de</td><td>22 mm x 22 mm, truncado a 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Soportes de bloques de plástico</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de transferencia graduados desechables</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petrl</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Pinzas de disección de embriones</td></tr><tr><td>Punta de acero inoxidable</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Disección de embriones</td></tr><tr><td>Pinza de tejido Graefep</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Disección de embriones</td></tr><tr><td>Tijera de operación delicada</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Disección de embriones</td></tr><tr><td>14 ml Tubos de polipropileno de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos cónicos de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cubitera</td> Magic <td>Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3.4 onzas) Pesaje de poliestireno antiestático</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11,2 oz.) Pesaje antiestático de poliestireno</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>Solución de PBS</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Solución de PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>Solución de PBS</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia con zoom estereoscópico</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de fibra óptica</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de micrótomo desechable</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de un solo filo</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Ordenador</td><td>Dell T7600, 2 discos duros SAS de 900 GB y 64 GB de memoria</td><td></td><td></td>DDR3 RDIMM</tr><tr><td>Vibradores de plataforma oscilante</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa caliente estándar</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

adquisición rápida de imágenes en 3d de alta resolución usando episcópico microscopía

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

La tecnología de microscopía episcópica de alta resolución (HREM) permite la adquisición rápida de datos morfométricos digitales volumétricos y tridimensionales (3D) de alta resolución. Aquí, describimos el protocolo detallado para obtener imágenes de todo el embrión de ratón. El protocolo consta de cuatro secciones principales: preparación de muestras, incrustación, adquisición de imágenes y, por último, visualización en 3D. La tecnología requiere que las muestras se tiñan con un tinte fluorescente, lo que puede ser problemático para muestras grandes o densas. Para superar esta limitación, hemos mejorado el protocolo existente para mejorar la penetración del colorante en los tejidos mediante el tratamiento previo de la muestra con una solución que contiene urea y dodecil sulfato de sodio. El protocolo utiliza solo equipos y reactivos de laboratorio de rutina para una fácil adaptación en entornos de laboratorio estándar. Demostramos que las imágenes 3D de alta resolución resultantes recapitulan fielmente las características morfológicas detalladas de los órganos internos de los embriones de ratón, lo que permite realizar análisis morfométricos. Juntos, presentamos un protocolo detallado y mejorado que utiliza equipos de laboratorio estándar para adquirir imágenes 3D de alta resolución de muestras de tamaño pequeño y grande.

Hemos informado imágenes HREM de alta calidad de los embriones de ratón entre E9.5 y E13.5 8. La calidad de imagen de los embriones por etapas finales de los años, sin embargo, se ve comprometida de manera significativa debido a la limitada penetración en el tejido de la eosina colorante fluorescente. Para aumentar la eficiencia de la tinción, hemos probado varios métodos de tratamiento previo que son compatibles con imágenes fluorescentes 11. En concreto, los embri...

Describimos un protocolo detallado que utiliza microscopía episcópica de alta resolución para adquirir imágenes tridimensionales (3D) de embriones de ratón. Este protocolo mejorado utiliza un método de preparación de tejido modificado para mejorar la penetración del tinte fluorescente, lo que permite el análisis morfométrico de muestras de tamaño pequeño y grande.

Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

El objetivo general de este protocolo es obtener rápidamente imágenes digitales 3D de alta resolución de especímenes biológicos utilizando equipos de laboratorio estándar. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo mediante la visualización y dinámica de características morfológicas complejas. Las principales ventajas de esta técnica son que utiliza equipos de laboratorio convencionales y requiere mínima experiencia previa.El procedimiento será demostrado por Jungang Huang, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de la disección y fijación del embrión según se describe en el protocolo escrito, sustituya el fijador por la solución de clarificación y agite suavemente la muestra en un agitador rotatorio a temperatura ambiente durante una a dos semanas. Al final de la incubación, transfiera la muestra a formalina al 10% y déjela en el agitador durante otros dos días.El tercer día, lave la muestra con PBS mediante tres lavados de cinco minutos cada uno. A continuación, deshidrate las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente, en un agitador suave durante dos horas por cada concentración. Tras la deshidratación con etanol al 100 %, transfiera el espécimen a la solución de tinción durante una hora, protegido de la luz.Luego, reemplace la solución con una solución de tinción fresca para la marcación nocturna de la muestra. A la mañana siguiente, sumerja la muestra en una mezcla de volúmenes uno a uno de soluciones de infiltración y tinción recién preparadas durante al menos tres horas en un agitador rotatorio a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, transfiera el embrión a la solución de infiltración para otra incubación con agitación rotatoria de tres horas.Luego, reemplace el sobrenadante con una solución de infiltración fresca durante tres días más de agitación a cuatro grados Celsius. En el cuarto día, oriente el embrión en un molde de inclusión y coloque el molde sobre hielo. Mezcle la solución B con la solución de infiltración y luego sumerja suavemente el molde en la solución de inclusión fría a cuatro grados Celsius.Después de aproximadamente tres horas, utilice una punta para confirmar que la solución se ha solidificado y empuje la muestra fuera del molde. Recorte cualquier material de inclusión excesivo, luego reoriente el bloque de la muestra en un nuevo molde en una orientación cruzada. A continuación, coloque todo el conjunto sobre hielo en una campana extractora.Agregue suavemente la solución de inclusión al nuevo molde hasta que el molde quede sumergido. Luego, coloque un portabloques encima del molde. Después de tres a cuatro horas, retire cuidadosamente el molde de inclusión y coloque el bloque bajo un microscopio estereoscópico con iluminación oblicua para determinar la posición del espécimen dentro del bloque.En la superficie del bloque, marque líneas de cuadrícula alrededor de la muestra y utilice estas líneas como guía para recortar cualquier material de inclusión excesivo. Para obtener imágenes de la muestra, primero sujete el bloque a un micrótomo y realice un corte fresco de la superficie de la muestra. Luego, monte un microscopio estereoscópico de zoom en posición horizontal frente a la superficie del bloque de la muestra, y encienda el microscopio y la computadora asociada.A continuación, inicie el software de adquisición de imágenes y utilice el modo de vista en vivo en el software de imagen para enfocar la óptica sobre la cara del bloque. Alinee el microscopio y el micrótomo según sea necesario, de modo que la cara del bloque quede en el centro del visor. Uno de los pasos más críticos de este procedimiento consiste en adquirir imágenes en la posición fija de origen del micrótomo.Ajuste el zoom para asegurarse de que toda la superficie del bloque esté dentro del visor. Luego seleccione el filtro de la proteína verde fluorescente. Proceda a realizar el corte previo del bloque hasta que aparezca el tejido de la muestra y vuelva a enfocar la imagen según sea necesario.Después de medir y ajustar manualmente el tiempo de exposición, adquiera y guarde imágenes de la superficie del bloque tras cada corte fresco, y registre los parámetros importantes de adquisición de imágenes. Al final de la sesión de adquisición, exporte y convierta todos los archivos de imagen al formato JPEG, y utilice el software de procesamiento de imágenes adecuado para invertir todas las imágenes originales, ajustando el brillo y el contraste de las imágenes según sea necesario. Cargue todas las imágenes procesadas en un software de visualización 3D, siguiendo las instrucciones.Alinee todas las imágenes utilizando el modo automático y muestre los resultados en 3D y 2D. En esta imagen representativa se muestra una vista de superficie de un embrión de ratón de día embrionario 15,5 preparado e imagenado tal como se acaba de demostrar. Pueden observarse las características morfológicas detalladas de la piel, incluyendo las almohadillas de los bigotes y los folículos pilosos en desarrollo.Es importante destacar que la resolución de la vista de sección virtual de una muestra de día embrionario 15,5 obtenida mediante este método es similar a la de una sección histológica estándar. Una vez dominado todo el procedimiento, tras el pretratamiento con la solución transparentante puede completarse en una semana, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es fundamental recordar mantener la solución de tinción protegida de la luz a cuatro grados durante los pasos de infiltración y embebido.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de escala, para responder preguntas adicionales sobre los patrones específicos de distribución de los tipos celulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar equipos de laboratorio para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de especímenes biológicos para su análisis morfométrico. No olvide que trabajar con soluciones de fijación, tinción e infiltración puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como operar en una campana extractora y usar guantes al realizar este procedimiento.

rapid-acquisition-3d-images-using-high-resolution-episcopic

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizada (TC).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

La información espacio-temporal sobre las proteínas dinámicas dentro de las células vivas es crucial para entender la biología. Un tipo de microscopía de superresolución llamada microscopía rápida de iluminación estructurada en 3D (f3D-SIM) revela información única sobre el anillo Z citocinético en las bacterias: tanto su apariencia en forma de perla como la rápida dinámica de FtsZ dentro del anillo.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada...

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Proporcionamos protocolos simples y robustos para procesar material de biopsia de varias especies, embriones de organismos modelo biomédicos y muestras de otros tejidos orgánicos para permitir la generación de datos de volumen digital con el método de microscopía episcopal de alta resolución.

Microscopía Episcopal de Alta Resolución (HREM) - Protocolos simples y robustos para procesar y visualizar materiales orgánicos

Recientemente nos asignan la ubicación espacial (3D) tridimensional de rutas de transporte para diversas proteínas translocación dentro de cilios primarios en células vivas. Aquí en este detalles de papel la configuración experimental, el proceso de muestras biológicas y el análisis de datos para la fluorescencia de super-resolución 3D imagen enfoque recién aplicados en viven cilios primarios.

Aplicación de la microscopía de resolución súper alta velocidad velocidad en vivo cilio primario

Este protocolo explica cómo preparar y montar muestras bacterianas para imágenes tridimensionales en vivo y cómo reconstruir la forma tridimensional de E. coli a partir de esas imágenes.

Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Este protocolo detalla las aplicaciones avanzadas de imagen y la gestión de recursos compartidos de un sistema de microscopio confocal de barrido láser integrado con un detector de matriz multiplexada para imágenes celulares y subcelulares de alta resolución. El flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multimodales desde confocal hasta superresolución (~120 nm) dentro de una sola plataforma, haciendo que la visualización a escala nanométrica sea más accesible.

Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Aprende a adquirir imágenes 3D de alta resolución de embriones de ratón mediante microscopía episcópica. Esta técnica mejora la penetración de tinte para análisis morfométrico detallado en biología del desarrollo.

Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

Explorar más videos