Name: Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende a adquirir imágenes 3D de alta resolución de embriones de ratón mediante microscopía episcópica. Esta técnica mejora la penetración de tinte para análisis morfométrico detallado en biología del desarrollo.

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Agradecemos a los Dres. Yichen Huang, Chunming Guo y Zhenfang Zhou por su apoyo técnico. Esta investigación fue financiada por los NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) y la Asociación Americana del Corazón (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Todos los usos de animales son aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital Infantil de Boston. 1. Preparación de muestras <ol><li> apareamiento sincronizado <ol><li> Coloque una C57Bl6 tipo salvaje macho y una hembra juntos en la misma jaula. </li><li> Comprobar la formación de un tapón de apareamiento mañana siguiente temprano. La clavija de acoplamiento (aka, la vagina o el enchufe de la cópula) es una deposición gelatinosa endurecida que bloquea la vagina. </li><li> Ajuste la fecha enchufe como el día embrionario 0,5 (E0.5). </li></ol></li><li> El aislamiento de los embriones de ratón <ol><li> La eutanasia a las mujeres embarazadas por asfixia con CO2. </li><li> Ponga los ratones en posición supina sobre una almohadilla absorbente y rociar región abdominal con un 70% de etanol. </li><li> Levantar la piel y hacer una incisión de 5 mm inicial en la región abdominal caudal utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar y quitar la piel abdominal para exponer completamente los órganos internos </li><li> Cortar cerca de Vagina para extirpar todo el útero. </li><li> Cortar entre sitios de implantación a lo largo de la trompa uterina. Cada segmento o producto de la concepción deben tener un solo embrión en su interior. </li><li> Mantener los segmentos uterinos en solución salina 1x helada tamponada con fosfato (PBS). </li></ol></li><li> la disección de embriones <ol><li> Coloque cada embrión en un plato aparte con helado de PBS en un estereoscopio. </li><li> Retire los tejidos uterinos, la placenta y luego las membranas fetales utilizando secuencialmente pinza de disección finas. </li><li> Transferir el embrión diseccionado a un tubo de 50 ml con 1x PBS enfriado con hielo usando un gran pipeta de transferencia. Evitar la captación de embriones directamente con fórceps para minimizar el daño tisular. </li></ol></li><li> Fijación <ol><li> Fijar los embriones disecados en solución de formalina tamponada neutra al 10% a 4 ° C durante más de 24 horas con al menos 10 volúmenes de muestra de fijador. </li></ol></li><li> El pretratamiento <ol><li> Preparar la solución clarificadora: 4M urea, 10% de glicerol, 4% dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua bidestilada. </li><li> Vuelva a colocar el fijador con la Solución de Compensación. </li><li> gire suavemente la muestra sobre un balancín a temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Intercambiar la solución de aclarado una vez en el segundo y el tercer día. El espécimen se convierte poco a poco clara y translúcida. </li><li> Vuelva a colocar la solución de aclaramiento con formalina al 10% y dejar en un agitador durante 2 días. </li></ol></li><li> Deshidración <ol><li> Se lavan las muestras pretratadas con 1 x PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno. </li><li> Deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente en un agitador suave. Para los embriones E15.5, utilizar una serie de etanol ascendente incluyendo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100% de etanol, 2 hr cada paso. Para los embriones de más edad, el tiempo de incubación debe ser aumentado. </li></ol></li><li> tinción <ol><li> Preparar la solución de tinción: añadir 0.1375 gramos de eosina Y sal disódica y 0,0275 gramos de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) de sal a 50 ml de etanol al 100%. Se agita durante 2 hr. Filtro con un papel de filtro. Almacenar a temperatura ambiente y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio. </li><li> Transferir la muestra a la solución de tinción durante 1 hora. </li><li> Reemplazar con solución de tinción durante la noche fresca y mancha. </li></ol></li><li> Infiltración <ol><li> Preparar solución de infiltración: combinar 100 ml de solución A de JB-4 kit incrustación, 1,25 g de catalizador C, 0.275 g de eosina Y sal disódica y 0,055 g de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) sal. Revuelva para mezclar (200 rpm) en un cubo de hielo durante 2 horas, y luego filtrar con papel de filtro. </li><li> Almacenar la solución de infiltración a 4 ° C y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio. </li><li> La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones: solución de tinción (1: 1), y se incuba durante al menos 3 horas en un puente a 4 ° C. </li><li> La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones e incubar durante 3 hr en un agitador en una habitación fría. </li><li> Reemplazar solución de infiltración una vez al día, y dejar en un cuarto frío en un agitador suave durante tres días más. </li></ol></li></ol> 2. Incorporación <ol><li> Mantenga la solución B y la solución de infiltración en el hielo. </li><li> Hacer Solución incrustación (1:25 de la solución B y la solución de infiltración) inmediatamente antes de la incrustación. </li><li> Orientar el espécimen en un molde de inclusión, a continuación, vierta la solución incrustación fría en el molde de inclusión con suavidad. Vuelva a orientar con un alfiler, si es necesario. </li><li> Use un alfiler para examinar si la solución de incrustación se solidifica. Empuje a cabo primero la muestra, y el ajuste si es necesario. </li><li> Reorientar primero la muestra usando el molde separado para obtener una orientación transversal. </li><li> Poner un soporte de bloque en la parte superior del molde de inclusión. Vierta suavemente la solución incrustación en el molde hasta que el molde y el soporte del bloque están sumergidos mediante la incorporación de soluciones. </li><li> Mantenga la muestra en un recipiente secundario y dejarloen hielo durante 3 - 4 horas en una campana de humos. </li><li> Almacenar las muestras solidificadas en un 4 ° C. </li><li> Despegar el molde de inclusión. Ponga el bloque bajo el microscopio estereoscópico con iluminación oblicua a la posición de la muestra en el bloque de inspeccionar. En la cara del bloque, las líneas de cuadrícula en Todo el espécimen. </li><li> Recortar el bloque para eliminar el acceso cantidad de material aglomerante usando las líneas de la cuadrícula marcados como referencias. </li></ol> 3. Adquisición de imágenes <ol><li> Colocar primero la muestra para el microtomo y obtener una superficie recién cortada. Establecer espesor de corte (por ejemplo, e9.5-10.5, 1,5 micras; e11.5-12.5, 2,0 micras; e13.5-15.5, 2,5 micras; E16.5-mayores, 3 M). Mantenga la muestra / de bloques en la posición inicial del microtomo. </li><li> Montar el microscopio estéreo con zoom horizontalmente hacia la superficie del bloque de la muestra. </li><li> Encienda el ordenador y el microscopio, y ejecutar el software de adquisición de imágenes. </li><li> Visualizar y enfocar la óptica al bloque carabajo la modalidad de &quot;visualización en vivo&quot; de software de imágenes. </li><li> Alinear microscopio y micrótomo si es necesario de modo que el bloque de cara está en el centro de visor. </li><li> Ajuste el zoom de modo que el bloque entero cara está dentro del visor. </li><li> Seleccione la proteína fluorescente (GFP) filtro verde (excitación 470 ± 20 nm, dicroico 495 nm, emisión 525 ± 25 nm) y reorientar, si es necesario. </li><li> Medir y ajustar el tiempo de exposición manualmente (por ejemplo, el 80 - 400 mini-seg). </li><li> Adquirir imágenes del bloque de cara después de cada corte fresco y guardar las imágenes automáticamente, si es posible. </li><li> parámetros importantes de registro incluida la resolución, el espesor de la sección y el zoom. </li><li> Después de terminar la totalidad de la muestra, la exportación y convertir todos los archivos de imagen a formato JPEG si es necesario. </li><li> Invertir todas las imágenes originales usando un software de procesamiento de imágenes y ajustar el brillo y el contraste. </li><li> Guardar todas las imágenes procesadas en una carpeta separada. </li></ol> 4. 3DVisualización <ol><li> Sube todas las imágenes procesadas a un software de visualización 3D siguiendo las instrucciones. </li><li> Resolución de entrada y espesor de corte para convertir todas las imágenes en datos volumétricos (es decir, el tamaño del voxel) y guardar el archivo 3D. </li><li> Alinear todas las imágenes utilizando el modo automático. Ajustar las imágenes individuales de forma manual si es necesario. </li><li> Guarda la imagen alineada con un nuevo nombre de archivo. </li><li> Analizar las características morfométricas de la muestra utilizando el software de visualización 3D. </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
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<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
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<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, presentamos un protocolo modificado mediante equipos de laboratorio de rutina para adquirir imágenes HREM de serie que son compatibles para la visualización 3D rápida y análisis morfométrico de las estructuras complejas. Debido a que las imágenes de alta resolución se toman directamente de la cara del bloque en lugar de secciones individuales, las características morfológicas finas se conservan y rápidamente reconstruidas digitalmente en un programa de visualización en 3D. im...

El advenimiento de las tecnologías de imagen 3D ha abierto la posibilidad de un análisis sistémico de características morfológicas detalladas durante el desarrollo fetal. En la actualidad se dispone de una variedad de modalidades de obtención de imágenes en 3D, como la resonancia magnética micromagnética (micro-RMN), la microtomografía computarizada, la ecografía de alta frecuencia, la tomografía de coherencia óptica, la tomografía óptica de proyectos y la microscopía episcópica1-4. Cada modalidad tiene sus propias características únicas en resolución, contraste, velocidad, costo, capacidad en el útero y disponibilidad.
La captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) y la microscopía episcópica de alta resolución (HREM) son métodos de obtención de imágenes de microscopía episcópica4. Aquí, las imágenes en serie de alta resolución se capturan continuamente desde la cara del bloque en lugar de secciones de tejido. Las imágenes resultantes reflejan fielmente las características morfológicas detalladas con una distorsión mínima o nula del tejido. Los datos volumétricos adquiridos se convierten fácilmente en imágenes 3D de alta resolución adecuadas para un análisis morfométrico preciso. Debido a su relativo bajo costo y alta resolución, HREM y EPIC se han convertido en las alternativas superiores para la evaluación sistémica de modelos de ratón de defectos congénitos humanos2,4-8.
Tanto los métodos EFIC como los HREM requieren que las muestras se incrusten en el medio adecuado. EFIC detecta la autofluorescencia emitida por el tejido incrustado. Debido a esto, se limita a los especímenes que emiten altos niveles de autofluorescencia, pero no a aquellos con una autofluorescencia relativamente débil, como los embriones en etapas tempranas9. Para superar la dependencia de la autofluorescencia, las muestras se tiñen con un tinte fluorescente como la eosina para la obtención de imágenes HREM. La elección de los colorantes y los métodos de tinción también hacen que la HREM sea más compatible para detectar señales moleculares en el contexto de la arquitectura y la morfología de los tejidos4,10.
En este artículo, presentamos un protocolo HREM mejorado adecuado para la evaluación de cuerpo entero de embriones de ratón en etapa tardía. Para facilitar la tinción, incluimos un paso de pretratamiento para aumentar la penetración en el tejido, lo que permite la obtención de imágenes HREM de embriones de ratón más viejos.

<table><tbody><tr><td>Ratones</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Etílico</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, Absoluto, ACS/USP/Grado Kosher</td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Solución de Limpieza</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>Solución</td></tr> <tr><td>de LimpiezaSulfato de dodecilo sódico</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Solución de limpieza</td></tr><tr><td>Eosina Y sal disódica</td><td>Fisher Solución</td> de <td>infiltración</td>de <td>BP241925</td> científico</tr><tr><td>Acridina Naranja de acridina sal de hemi (cloruro de zinc)</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Solución de infiltración</td></tr><tr><td>Papel Whatman</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Kit de incrustación - Solución A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Kit</td></tr><tr><td>de incrustación de solución de infiltración JB-4 - Solución B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Solución de incrustación</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Kit de incrustación - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Moldes</td></tr><tr><td>de incrustación</td> de soluciones de infiltración <td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>Moldes</td></tr><tr><td>de incrustación afilados Peel-A-Way de</td> 16 x 8 mm <td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1 Cuadrado de</td><td>22 mm x 22 mm, truncado a 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Soportes de bloques de plástico</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de transferencia graduados desechables</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petrl</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Pinzas de disección de embriones</td></tr><tr><td>Punta de acero inoxidable</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Disección de embriones</td></tr><tr><td>Pinza de tejido Graefep</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Disección de embriones</td></tr><tr><td>Tijera de operación delicada</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Disección de embriones</td></tr><tr><td>14 ml Tubos de polipropileno de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos cónicos de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cubitera</td> Magic <td>Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3.4 onzas) Pesaje de poliestireno antiestático</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11,2 oz.) Pesaje antiestático de poliestireno</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>Solución de PBS</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Solución de PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>Solución de PBS</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia con zoom estereoscópico</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de fibra óptica</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de micrótomo desechable</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de un solo filo</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Ordenador</td><td>Dell T7600, 2 discos duros SAS de 900 GB y 64 GB de memoria</td><td></td><td></td>DDR3 RDIMM</tr><tr><td>Vibradores de plataforma oscilante</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa caliente estándar</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

adquisición rápida de imágenes en 3d de alta resolución usando episcópico microscopía

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

La tecnología de microscopía episcópica de alta resolución (HREM) permite la adquisición rápida de datos morfométricos digitales volumétricos y tridimensionales (3D) de alta resolución. Aquí, describimos el protocolo detallado para obtener imágenes de todo el embrión de ratón. El protocolo consta de cuatro secciones principales: preparación de muestras, incrustación, adquisición de imágenes y, por último, visualización en 3D. La tecnología requiere que las muestras se tiñan con un tinte fluorescente, lo que puede ser problemático para muestras grandes o densas. Para superar esta limitación, hemos mejorado el protocolo existente para mejorar la penetración del colorante en los tejidos mediante el tratamiento previo de la muestra con una solución que contiene urea y dodecil sulfato de sodio. El protocolo utiliza solo equipos y reactivos de laboratorio de rutina para una fácil adaptación en entornos de laboratorio estándar. Demostramos que las imágenes 3D de alta resolución resultantes recapitulan fielmente las características morfológicas detalladas de los órganos internos de los embriones de ratón, lo que permite realizar análisis morfométricos. Juntos, presentamos un protocolo detallado y mejorado que utiliza equipos de laboratorio estándar para adquirir imágenes 3D de alta resolución de muestras de tamaño pequeño y grande.

Hemos informado imágenes HREM de alta calidad de los embriones de ratón entre E9.5 y E13.5 8. La calidad de imagen de los embriones por etapas finales de los años, sin embargo, se ve comprometida de manera significativa debido a la limitada penetración en el tejido de la eosina colorante fluorescente. Para aumentar la eficiencia de la tinción, hemos probado varios métodos de tratamiento previo que son compatibles con imágenes fluorescentes 11. En concreto, los embri...

Describimos un protocolo detallado que utiliza microscopía episcópica de alta resolución para adquirir imágenes tridimensionales (3D) de embriones de ratón. Este protocolo mejorado utiliza un método de preparación de tejido modificado para mejorar la penetración del tinte fluorescente, lo que permite el análisis morfométrico de muestras de tamaño pequeño y grande.

Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

El objetivo general de este protocolo es obtener rápidamente imágenes digitales 3D de alta resolución de especímenes biológicos utilizando equipos de laboratorio estándar. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo mediante la visualización y dinámica de características morfológicas complejas. Las principales ventajas de esta técnica son que utiliza equipos de laboratorio convencionales y requiere mínima experiencia previa.El procedimiento será demostrado por Jungang Huang, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de la disección y fijación del embrión según se describe en el protocolo escrito, sustituya el fijador por la solución de clarificación y agite suavemente la muestra en un agitador rotatorio a temperatura ambiente durante una a dos semanas. Al final de la incubación, transfiera la muestra a formalina al 10% y déjela en el agitador durante otros dos días.El tercer día, lave la muestra con PBS mediante tres lavados de cinco minutos cada uno. A continuación, deshidrate las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente, en un agitador suave durante dos horas por cada concentración. Tras la deshidrataci

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Este protocolo detalla las aplicaciones avanzadas de imagen y la gestión de recursos compartidos de un sistema de microscopio confocal de barrido láser integrado con un detector de matriz multiplexada para imágenes celulares y subcelulares de alta resolución. El flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multimodales desde confocal hasta superresolución (~120 nm) dentro de una sola plataforma, haciendo que la visualización a escala nanométrica sea más accesible.

Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Aprende a adquirir imágenes 3D de alta resolución de embriones de ratón mediante microscopía episcópica. Esta técnica mejora la penetración de tinte para análisis morfométrico detallado en biología del desarrollo.

Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

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