Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía
21 de noviembre de 2016
Describimos un protocolo detallado que utiliza microscopía episcópica de alta resolución para adquirir imágenes tridimensionales (3D) de embriones de ratón. Este protocolo mejorado utiliza un método de preparación de tejido modificado para mejorar la penetración del tinte fluorescente, lo que permite el análisis morfométrico de muestras de tamaño pequeño y grande.
El objetivo general de este protocolo es adquirir rápidamente imágenes digitales 3D de alta resolución de especímenes biológicos utilizando equipos de laboratorio estándar. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo a través de la visualización y la dinámica de características morfológicas complejas. Las principales ventajas de esta técnica son que utiliza equipos de laboratorio estándar y requiere una experiencia previa mínima.
Jungang Huang, un estudiante graduado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de la disección y fijación del embrión como se describe en el protocolo de texto, reemplace el fijador con una solución de limpieza y gire suavemente la muestra sobre un balancín a temperatura ambiente durante una o dos semanas. Al final de la incubación, transfiera la muestra a un 10% de formalina y déjela en el balancín durante otros dos días.
Al tercer día, lave la muestra en PBS durante tres lavados de cinco minutos. A continuación, deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente, en un balancín suave durante dos horas para cada concentración. Después de la deshidratación al 100% de etanol, transfiera la muestra a una solución de tinción durante una hora, protegida de la luz.
Luego, reemplace la solución con una solución de tinción nueva para el etiquetado nocturno de la muestra. A la mañana siguiente, sumerja la muestra en una mezcla de volumen a volumen de soluciones de infiltración y tinción recién preparadas durante al menos tres horas en un balancín a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, transfiera el embrión a una solución de infiltración para otra incubación oscilante de tres horas.
A continuación, sustituya el sobrenadante por una solución de infiltración fresca durante tres días más de balanceo a cuatro grados centígrados. Al cuarto día, oriente el embrión en un molde de inclusión y coloque el molde en hielo. Mezcle la solución B con la solución de infiltración y luego sumerja suavemente el molde en una solución de inclusión fría a cuatro grados centígrados.
Después de aproximadamente tres horas, use una punta para confirmar que la solución se ha solidificado y empuje la muestra fuera del molde. Recorte el exceso de material de incrustación y, a continuación, reoriente el bloque de muestras en un nuevo molde en orientación cruzada. A continuación, coloque toda la configuración sobre hielo en una campana extractora.
Agregue suavemente la solución de inclusión al nuevo molde hasta que el molde esté sumergido. Luego, coloque un soporte de bloque encima del molde. Después de tres o cuatro horas, retire el molde de inclusión y coloque el bloque bajo un microscopio estereoscópico con iluminación oblicua para determinar la posición de la muestra dentro del bloque.
En la cara del bloque, marque las líneas de cuadrícula alrededor de la muestra y utilícelas como guías para recortar cualquier exceso de material de incrustación. Para obtener imágenes del espécimen, primero sujete el bloque a un micrótomo y obtenga un corte fresco de la superficie del espécimen. A continuación, monte un microscopio estereoscópico con zoom horizontalmente frente a la cara del bloque de la muestra, y encienda el microscopio y el ordenador que lo acompaña.
A continuación, inicie el software de adquisición de imágenes y utilice el modo de visualización en vivo en el software de imágenes para enfocar la óptica en la cara del bloque. Alinee el microscopio y el micrótomo según sea necesario, de modo que la cara del bloque quede en el centro del visor. Uno de los pasos más críticos de este procedimiento es adquirir imágenes en la posición fija de inicio del micrótomo.
Ajuste el zoom para asegurarse de que toda la cara del bloque esté dentro del visor. A continuación, seleccione el filtro de proteínas fluorescente verde. Proceda a precortar el bloque hasta que aparezca el tejido de la muestra y vuelva a enfocar la imagen según sea necesario.
Después de medir y ajustar el tiempo de exposición manualmente, adquiera y guarde imágenes de la cara del bloque después de cada nuevo corte y registre los parámetros importantes de adquisición de imágenes. Al final de la sesión de imágenes, exporte y convierta todos los archivos de imagen a formato JPEG, y utilice el software de procesamiento de imágenes adecuado para invertir todas las imágenes originales, ajustando el brillo y el contraste de las imágenes según sea necesario. Cargue todas las imágenes procesadas en un software de visualización 3D, siguiendo las instrucciones.
Alinee todas las imágenes usando el modo automático y muestre los resultados 3D y 2D. En esta imagen representativa de una superficie de montaje completo, vista de un embrión de ratón de 15,5 días preparado y fotografiado como se acaba de demostrar. Se pueden observar las características morfológicas detalladas de la piel, incluidas las almohadillas de los bigotes y los folículos pilosos en desarrollo.
Es importante destacar que la resolución de la vista de sección virtual de un espécimen embrionario de día 15,5 fotografiado por este método es similar a la de una sección histológica estándar. Una vez dominado todo el procedimiento después del pretratamiento con la solución de limpieza se puede completar en una semana, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la solución de tinción protegida de la luz a cuatro grados durante el paso de infiltración e inclusión.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de incrustaciones, para responder a preguntas adicionales sobre los patrones de distribución específicos de los tipos de células. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar el equipo de laboratorio para adquirir imágenes 3D de alta resolución de especímenes biológicos para su análisis morfométrico. No olvide que trabajar con soluciones de fijación, tinción e infiltración puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como operar con una campana extractora y usar guantes mientras se realiza este procedimiento.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de embriones de ratón mediante microscopía episcópica. La técnica mejora la penetración del colorante para realizar un análisis morfométrico detallado de las muestras.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del desarrollo
- Técnicas de imagen
- Morfología embrionaria
Antecedentes
- La imagen de alta resolución es fundamental para estudiar estructuras biológicas complejas.
- Se puede utilizar equipo de laboratorio estándar para esta técnica de imagen.
- Se requiere una experiencia previa mínima para realizar el protocolo.
- Este método permite la visualización de características morfológicas intrincadas.
Objetivo del estudio
- Adquirir rápidamente imágenes tridimensionales detalladas de especímenes biológicos.
- Facilitar el análisis morfométrico en biología del desarrollo.
- Mejorar la visualización de estructuras embrionarias.
Métodos Utilizados
- Diseción y fijación del embrión seguida de un tratamiento con solución transparentante.
- Procedimientos de tinción e infiltración para mejorar la calidad de la imagen.
- Adquisición de imágenes mediante microscopio estereoscópico de aumento y microtomo.
- Procesamiento de imágenes y software de visualización 3D para el análisis.
Resultados principales
- Adquisición exitosa de imágenes de alta resolución de embriones de ratón.
- Visualización detallada de características de la piel, como almohadillas de bigotes y folículos pilosos.
- Resolución comparable a la de cortes histológicos estándar.
- El procedimiento puede completarse en una semana con una ejecución adecuada.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para la obtención de imágenes 3D de especímenes biológicos.
- Permite realizar un análisis morfométrico detallado del desarrollo embrionario.
- Las precauciones de seguridad son esenciales al manipular materiales peligrosos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La obtención de imágenes 3D de alta resolución de especímenes biológicos apoya la validación temprana de objetivos al permitir la fenotipificación morfológica detallada en modelos preclínicos. Esta capacidad aumenta la confianza predictiva en la investigación de biología del desarrollo y facilita la reducción mecanicista de riesgos en las hipótesis terapéuticas. La dependencia del método en equipos de laboratorio estándar promueve su accesibilidad y escalabilidad en diversos flujos de trabajo de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de alta resolución de características morfológicas complejas en modelos embrionarios.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al proporcionar datos morfométricos cuantitativos en 3D para la evaluación funcional de objetivos.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al generar resultados de imagen reproducibles que aclaran las relaciones entre estructura y función.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para análisis posteriores mediante la generación de conjuntos de datos de imágenes 3D estandarizados y de alta fidelidad.
- Valor operativo: Mejora la preparación del ensayo mediante protocolos reproducibles de aclarado, tinción e inclusión de tejidos, compatibles con equipos de laboratorio de uso rutinario.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en especímenes de diferentes tamaños gracias a una mejor penetración del colorante mediante la pretratamiento con urea y SDS.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Apoya el análisis de sistemas relevantes para la enfermedad al recapitular fielmente las características morfológicas detalladas de los órganos internos.
- Alineación Preclínica: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante el análisis morfométrico que conecta el descubrimiento con la validación preclínica.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Mejora la confianza predictiva al permitir la visualización de cambios fenotípicos cruciales para la validación del blanco.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la biología inicial hasta la identificación de candidatos, al proporcionar lecturas morfológicas cuantitativas que orientan la selección y validación del blanco.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la visualización tridimensional de la dinámica estructural embrionaria.
- Selección: Proporciona especímenes listos para ensayos con resultados de imagen estandarizados, adecuados para la evaluación de efectos de compuestos.
- Análisis: Permite mediciones morfométricas y comparaciones estadísticas entre condiciones mediante datos volumétricos digitales.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al proporcionar datos estructurales relevantes para enfermedades que apoyan el alineamiento de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad de imagen reutilizable debido a su dependencia de sistemas de microtomo y microscopio estereoscópico ampliamente disponibles.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante una fenotipificación 3D detallada.
- Valor operativo: Fomenta la estandarización y la reproducibilidad mediante un protocolo optimizado que utiliza reactivos y equipos de uso rutinario.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al permitir la detección temprana de fenotipos morfológicos que informan sobre riesgos biológicos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante datos cuantificables de imágenes que aumentan la confianza en la identificación de compuestos líderes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, microscopía de fluorescencia y procesamiento de imágenes 3D.
- Depende del acceso a un micrótomo, microscopio estereoscópico con zoom y reactivos histológicos estándar.
- Necesita una estandarización entre equipos de los tiempos de tinción, aclarado e inclusión para obtener resultados reproducibles.
- Incluye consideraciones de adaptación para tamaños y densidades variables de las muestras, abordadas mediante un pretratamiento con urea-SDS.
- Comprende limitaciones prácticas, como la sensibilidad a la luz de las soluciones de tinción, que requieren protección durante la infiltración y la inclusión.
