Name: Preparación y En Vivo El uso de una sonda basada en la actividad de N -acylethanolamine Ácido amidasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende a sintetizar y utilizar la sonda ARN14686 para detectar la forma activa de la enzima NAAA en extractos celulares y tejidos mediante microscopía de fluorescencia. Este método proporciona información fiable sobre el estado de activación de la enzima en condiciones fisiológicas y patológicas.

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Los autores agradecen al Centro de Imágenes de Nikon en el Istituto Italiano di Tecnologia, Génova, Italia (NIC@IIT).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La actividad enzimática se finamente regulada a diferentes niveles, incluyendo la transcripción de ARN, síntesis de proteínas, la translocación de proteínas, modificación después de la traducción, y la interacción proteína-proteína. A menudo, la expresión de la enzima sola no tiene en cuenta para su actividad. ABPP fue desarrollado para estudiar la actividad de las proteínas en su estado nativo. Se requieren dos características: una sonda química que se une covalentemente al sitio activo de una enzima de interés y una e...

Comúnmente utilizado métodos para investigar los patrones de expresión, interacciones y funciones de las proteínas, incluyendo las plataformas de cromatografía de espectrometría de masas para el análisis de líquidos escopeta 1,2, levadura de dos híbridos de métodos 3,4, y en ensayos in vitro, están limitadas en cuanto a que son no se puede evaluar la actividad de las proteínas en su estado nativo. basados ​​en la actividad de proteína de perfiles (ABPP) se puede utilizar para llenar este vacío. En este enfoque, las sondas de molécula pequeña capaz de unirse covalentemente al sitio activo de una enzima de interés se conjugan con un grupo indicador que permite la detección de blancos. El uso de la química clic (CC), el reportero puede ser integrado en la sonda o puede ser introducido después del acoplamiento de destino se ha producido 5,6. El último procedimiento requiere el uso de sondas que contienen grupos químicos apropiados, tales como un alquino o azida de terminal, que puede ser modificado con un número de reactivos de reportero a través de reacciones bio-ortogonal such como el Cu (I) catalizada Huisgen [3 + 2] cicloadición 7-9 o Staudinger ligadura 10,11. Recientemente, hemos revelado el ARN14686 compuesto como la primera ABP para la detección in vitro y in vivo de la hidrolasa cisteína, NAAA 12 en. NAAA cataliza la desactivación hidrolítica de FAEs saturados y monoinsaturados, incluyendo oleoiletanolamida (OEA) y palmitoiletanolamida (PEA), que son agonistas endógenos de la anti-inflamatoria receptor nuclear PPAR-alfa 13-15. NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B 14,16, lo que sugiere un papel en la regulación de la respuesta inmune innata. La enzima se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso en una forma inactiva y se activa en los compartimientos ácidos de la célula por un mecanismo autoproteolítica 17. La escisión autoproteolítica genera una nueva cisteína-terminal de N (C131 en ratones y ratas, C126 en los seres humanos), que es el nucleófilo responsable de FAE hidrólisis 18,19. La inhibición farmacológica de la actividad naaa altera el equilibrio de síntesis / degradación de la FAE en favor de un aumento de los niveles celulares de FAE 16,20,21. Varios derivados de β-lactona y β-lactámicos se ha demostrado que inhiben la actividad de NAAA con alta potencia y selectividad 16,22-26. Estos inhibidores actúan a través de S acilación de la cisteína catalítica 16,27,28. El ARN14686 compuesto fue diseñado sobre la base de la estructura química de la, inhibidor de la β-lactama NAAA serina derivados sistémicamente activo, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) 16. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal para la posterior conjugación CC con una etiqueta de reportero azida-cojinete. Hemos elegido para diseñar un SPA de dos pasos para MiniMally alterar la estructura del andamio original, manteniendo así la afinidad de la sonda para NAAA. Además, evitando la introducción de etiquetas voluminosos, una sonda de este tipo podría ser más adecuado para el tratamiento in vivo de un directo ABP. ARN14686 inhibe NAAA con alta potencia (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) mediante la formación de un aducto covalente con la cisteína catalítica de la enzima 12. Experimentos en ratas vivas mostraron que la sonda es selectiva en la captura de NAAA expresa en pulmones. Ceramidasa ácida, otra amidasa cisteína que comparte 33-34% de identidad con NAAA, también fue identificado como un objetivo de baja afinidad utilizando las altas concentraciones de sonda (10 micras de vitro, 10 mg / ml por vía intravenosa, iv) 12. También hemos utilizado ARN14686 para estudiar la presencia de NAAA activo en tejidos de rata inflamadas después de la administración de adyuvante completo de Freund (CFA) 29. A continuación, se describe un protocolo para los preparatien de ARN14686 (Figura 1) y su aplicación a la investigación de la activación NAAA ex vivo. Como ejemplo, se describe un procedimiento experimental para visualizar NAAA en patas de rata después de la administración CFA. En este experimento, las proteínas se extrajeron a partir de tejido de la pata después de la inyección iv de la sonda, y el proteoma marcado-ABP es sometido a CC con biotina-azida. muestras biotiniladas se enriquecen usando perlas de estreptavidina, y se llevan a cabo transferencias de proteínas. En otra aplicación, se describe la localización de NAAA activo por microscopía de fluorescencia en los pulmones del ratón de los ratones tratados con la sonda. En este caso, el tejido se seccionó y las secciones se someten a CC para la adición de rodamina. Un esquema de flujo de trabajo se ilustra en la Figura 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonildiimidazol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>2-dipiridiladcarbonato</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Inflamable, tóxico, peligroso para el medio ambiente acuático</td></tr><tr><td>4-(Dimetilamino)piridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Inflamable, corrosivo</td></tr><tr><td>Acetonitrilo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Inflamable, Tóxico</td></tr><tr><td>Carbón activado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Azodina-PEG3-Biotina</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de biocentrifugado</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica Bovin altamente tóxica (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Nitrato de amonio cérico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Hidrato de cloral oxidante, nocivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico Ciclohexadieno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Inflamable, Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Ciclohexano Sigma</td><td>Aldrich</td><td>34855</td><td>Inflamable, Nocivo, Peligro para la salud, Peligro para el medio ambiente</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Nocivo, Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Inflamable, Sulfóxido de</td></tr><tr><td>dimetilo nocivo (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>sulfóxido de dimetilo d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Inflamable, Nocivo</td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Inflamable, Glicerol nocivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Estreptavidina</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Estreptavidina&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Centrifugar brevemente antes de usar para precipitar complejos de proteínas</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Inflamable, Tóxico, Peligro</td></tr> <tr><td>para la saludN-(3-Dimetilaminopropil)-N&prime; -clorhidrato de etilcarbodiimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>Dañino, Corrosivo</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>Inflamable, Corrosivo, Tóxico</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Inflamable, Nocivo, Peligro</td></tr> para la salud<tr><td>N-Cbz-L-Serina</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>Microscopía confocal Nikon A1</td><td>Nikon</td><td></td><td>Leer el manual</td></tr><tr><td>de usuario NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> NP0335BOX <td></td></tr><tr><td>Paladio en carbono</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> 330108<td></td></tr><tr><td>p-anisidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Tóxico, Peligro para la salud, Peligro</td></tr> <tr><td>para el medio ambienteParaformaldehído</td><td>sigma Aldrich 441244</td><td></td><td>Tóxico, respiratorio nocivo, corrosivo, falmable</td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol)&nbsp;</td>Montaje antidecoloración <td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold con DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Evite la formación de burbujas</td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Tóxico, corrosivo, falmable</td></tr><tr><td>Hidruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td> inflamable <td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 escáner de inmage</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Leer el manual de usuario</td></tr><tr><td>Estreptavidina agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Terc-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Tóxico, inflamable</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Inflamable, Nocivo, Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Tóxico, caliente a 50 & grados; C para disolver</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 homogeneizador de tejidos básicos</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>Urea Nociva</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Tóxico, caliente a 50 &deg; C para disolver</td></tr></tbody></table>

preparación y<em&gt; en vivo</em&gt; el uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

perfiles de proteínas basado en las actividades (ABPP) es un método para la identificación de una enzima de interés en un proteoma complejo mediante el uso de una sonda química que se dirige a los sitios activos de la enzima. Una etiqueta de reportero introducido en la sonda permite la detección de la enzima marcada por el análisis en gel de fluorescencia, transferencia de proteínas, la microscopía de fluorescencia, o la espectrometría de cromatografía de masa líquida. Aquí, se describe la preparación y uso de la ARN14686 compuesto, una sonda basada en la actividad de química (CC-ABP) que reconoce selectivamente la enzima N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA). Naaa es una hidrolasa cisteína que promueve la inflamación mediante la desactivación de los agonistas alfa endógenos receptor activado por el proliferador de peroxisomas-(PPAR), tales como palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA). NAAA se sintetiza como una proenzima inactiva de longitud completa, que se activa por autoproteolisis en el pH ácido del lisosoma. Los estudios de localización have muestra que NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B. Proporcionamos ejemplos de cómo ARN14686 se puede utilizar para detectar y cuantificar NAAA activo ex vivo en los tejidos de roedores por transferencia de proteínas y microscopía de fluorescencia.

ARN14686 fue diseñado basado en el andamio de la ARN726 inhibidor naaa. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal (Figura 1). La etiqueta de alquino se introdujo con el fin de permitir el uso de un procedimiento de marcaje de dos pasos para añadir un fluoróforo o una molécula de biotina por medio de CC. Esta característica hace que ARN14686 una herramienta muy versátil para sondear ...

Aquí, se describe la preparación y uso de una sonda basada en la actividad (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) que permite la detección y cuantificación de la forma activa de la enzima proinflamatoria N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar la síntesis de la sonda basada en la actividad, ARN 14 seis ocho seis, específica para la N-aciletanolamina ácido amidasa, o NAAA, y describir su uso para detectar la enzima catalíticamente activa en extractos celulares y secciones de tejido. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la función in viva de la NAAA, proporcionando información sobre la activación de la NAAA en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas, como enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas. Su principal ventaja es que una manipulación sencilla sigue a la reacción de la NAAA con la sonda, proporcionando así información confiable sobre el estado de activación in viva de la enzima.Otra ventaja es que, a diferencia de los anticuerpos específicos, nuestra sonda detecta únicamente la forma activa de la enzima, lo cual es útil para evaluar el estado mediante microscopía de fluorescencia. La demostración visual de este método es fundamental, ya que combina distintas especialidades que conforman una historia completa, desde la síntesis adecuada hasta sus aplicaciones finales. En un matraz redondo de 50 mililitros, disuelva 350 miligramos de

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Este protocolo describe la preparación de un sustrato sintético para el...

Ensayo in vitro de metilación del ADN tRNA con Entamoeba histolytica y Dnmt2 tRNA metiltransferasa (Ehmeth) Enzima

Un método para la determinación de la actividad quinasa de acetato se describe. Este ensayo utiliza una reacción directa para determinar la actividad enzimática y la cinética de la cinasa de acetato en la dirección de acetato de formación con diferentes aceptores fosforilo. Además, este método puede ser utilizado para el ensayo de fosfato de otros o acetil de acetil-CoA utilizando enzimas.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Este video muestra la medición in vitro de la actividad enzimática para la α-galactosidasa A y la α-glucosidasa ácida en muestras utilizando sustratos sintéticos de 4-Methylumbelliferilo.

Medición in vitro de la actividad de la enzima α-galactosidasa A y α-glucosidasa ácida

La adición de palmitato reversible a las proteínas es un importante regulador de tráfico intracelular de proteínas. Esto es de particular interés en las neuronas donde muchas proteínas sinápticas se palmitoilada. Nosotros utilizamos un método simple bioquímico para detectar proteínas palmitoiladas en las neuronas cultivadas, que pueden ser adaptados para múltiples tipos de células y tejidos.

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.

La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo

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Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.

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Aprende a sintetizar y utilizar la sonda ARN14686 para detectar la forma activa de la enzima NAAA en extractos celulares y tejidos mediante microscopía de fluorescencia. Este método proporciona información fiable sobre el estado de activación de la enzima en condiciones fisiológicas y patológicas.

Preparación y

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