Preparación y

El objetivo general de este procedimiento es mostrar la síntesis de la sonda basada en la actividad, ARN 14 seis ocho seis, específica para la N-aciletanolamina ácido amidasa, o NAAA, y describir su uso para detectar la enzima catalíticamente activa en extractos celulares y secciones de tejido. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la función in viva de la NAAA, proporcionando información sobre la activación de la NAAA en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas, como enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas. Su principal ventaja es que una manipulación sencilla sigue a la reacción de la NAAA con la sonda, proporcionando así información confiable sobre el estado de activación in viva de la enzima.

Otra ventaja es que, a diferencia de los anticuerpos específicos, nuestra sonda detecta únicamente la forma activa de la enzima, lo cual es útil para evaluar el estado mediante microscopía de fluorescencia. La demostración visual de este método es fundamental, ya que combina distintas especialidades que conforman una historia completa, desde la síntesis adecuada hasta sus aplicaciones finales. En un matraz redondo de 50 mililitros, disuelva 350 miligramos de undecinenol y tres puntos cinco mililitros de diclorometano anhidro.

Luego, agregue 25 miligramos de DMAP y 530 miligramos de DPC a esta solución. Agite la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de 16 horas, agregue 20 mililitros de diclorometano a la solución.

Transfiera la mezcla a un embudo de separación. Añada 15 mililitros de agua. Agite la mezcla y deje que las dos fases se separen.

A continuación, abra la llave de paso, recoja la fase orgánica de la parte inferior, cierre la llave de paso y transfiera nuevamente la fase orgánica al embudo. Añada 15 mililitros de una solución saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. Agite el embudo de separación y deje que las dos fases se separen.

Después de secar la capa orgánica con sulfato de sodio, filtre a través de algodón en un matraz redondo de destilación escalonado. Luego evapore la capa orgánica hasta sequedad bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. Pese el matraz y obtenga 600 miligramos de aceite, que es una mezcla de dos carbonatos de piridilo undecinilo y undecinol, dos carboxilatos de oxipiridina, en una proporción de 1,7 a 1.

En un matraz redondo de 10 mililitros, disuelva 60 miligramos de acetato de oxoacetidenoilamonio en 2 mililitros de diclorometano anhidro. Enfríe la solución a cero grados centígrados en un baño de hielo y luego agregue 81 microlitros de diazapropaletilamina gota a gota. A continuación, disuelva 350 miligramos de la mezcla cruda que contiene undecinol-2-carboxilato de oxipiridina en 2 mililitros de diclorometano anhidro.

Añada la mezcla disuelta a la solución y agite a temperatura ambiente durante 15 horas. Luego, evapore el disolvente hasta sequedad bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. Purifique el compuesto mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando un aparato automatizado de cromatografía en columna.

Primero, absorba la muestra en gel de sílice. Después de equilibrar la columna con ciclohexeno, cargue la muestra en el cartucho. Eluya la muestra con acetato de etilo en ciclohexano del cero al 100, recolectando los picos en tubos de ensayo.

Evapore el disolvente de las fracciones correspondientes al compuesto hasta sequedad bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para obtener 40 miligramos de un sólido blanco. Después de pre-limpiar la muestra según se describe en el protocolo del texto, agregue 11,3 microlitros de un stock de 5 milimolar de azida de polietilenglicol biotina y vortexee. Luego, agregue 11,3 microlitros de un stock de 50 milimolar de TCEP recién preparado a la muestra y vortexee.

Después de mezclar previamente 34 microlitros de una solución de trabajo recién preparada de TBTA uno punto siete milimolar con 11 punto tres microlitros de un stock de sulfato de cobre 50 milimolar, añada 45 punto tres mililitros de esta solución a la muestra y agite en vórtex. Utilice recipientes etiquetados. Incube la reacción a 25 grados Celsius durante al menos dos horas.

Después de una incubación de una hora, observe la precipitación de proteínas y mezcle la reacción. Centrifugue la muestra durante cuatro minutos a 6.500 × g y 4 grados Celsius. Después de eliminar el sobrenadante, agregue 750 microlitros de metanol frío y resuspenda el precipitado mediante sonicación usando un sonicador de sonda durante cinco segundos.

Luego, centrifugue la muestra durante cuatro minutos a 6 500 ×g a cuatro grados Celsius. Y retire el sobrenadante con una jeringa y una aguja. Después de lavar dos veces más con metanol frío, agregue 325 microlitros de SDS al 2,5 % en PBS al precipitado proteico.

Someta la muestra a sonicación tres veces durante cinco segundos. A continuación, caliente la muestra durante cinco minutos a 65 grados Celsius. Tras la sonicación, centrifugue la muestra durante cinco minutos a 6.500 ×g a temperatura ambiente.

Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 15 mililitros y agregue un punto cuatro mililitros de PBS al sobrenadante para diluir la concentración de SDS al cero punto cinco por ciento. Para el enriquecimiento con estreptavidina, primero ajuste el volumen de la muestra a cuatro punto dos mililitros con PBS. A continuación, agregue 40 microlitros de una suspensión al 50 % de agarosa de estreptavidina previamente lavada, utilizando una punta con el extremo cortado.

Incube la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente con rotación. Después de centrifugar durante dos minutos a 1.400 ×g, retire el sobrenadante sin secar el botón de perlas. Utilice el sobrenadante residual para transferir las perlas a una columna de centrifugación de un mililitro y lave la columna por gravedad con un mililitro de SDS al uno por ciento en PBS.

Continúe lavando las perlas con urea seis molar seguido de PBS según se describe en el protocolo escrito. Luego, use 500 microlitros de PBS para transferir las perlas lavadas a un tubo de un punto cinco mililitros. Después de centrifugar la muestra durante dos minutos a 1.400 ×g, aspire suavemente el sobrenadante con una jeringa y una aguja.

Para eluir las proteínas unidas a la resina, agregue 25 microlitros de tampón de elución al pellet de resina e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de 15 minutos a 95 grados Celsius. Agregue aproximadamente 400 microlitros de mezcla de química click a cortes de tejido que hayan sido preparados según el protocolo descrito en el texto. Tenga cuidado de que el volumen elegido de la mezcla de química click sea suficiente para cubrir los cortes.

Luego, incubar los fragmentos de tejido durante una hora a temperatura ambiente protegidos de la luz. Tras la incubación, lavar las muestras con PBS durante cinco minutos y luego con metanol frío durante cinco minutos. A continuación, lavar los fragmentos de tejido tres veces con una solución de Tween 20 al uno por ciento y EDTA cero punto cinco milimolar en PBS durante dos minutos.

Finalmente, lave las secciones una vez más con PBS durante cinco minutos. Después de secar al aire, agregue una gota de medio de montaje antifade con DAPI. Cierre las muestras con cubreobjetos y selle con esmalte.

Para la síntesis de la sonda, el undecinenol se activa mediante carbonato de dipyridilo en presencia de cuatro dimetilaminopiridina como catalizador, produciendo un carbonato mixto que luego reacciona con el lactam aminilo; la beta lactama o cabeza de la sonda reacciona con el sitio activo de NAAA, mientras que el alquino terminal puede funcionalizarse con una etiqueta marcadora mediante química click. ARN 14 seis ocho seis se utilizó para detectar la activación de NAAA en extractos proteicos de patas inflamadas de ratas mediante bloqueo proteico. En ratas ingenuas, no se detecta ninguna señal de NAAA.

Por el contrario, en ratas tratadas con adyuvante de Freund completo se observa una banda marcada correspondiente a NAAA activa. Otra aplicación de ARN 14 seis ocho seis es la obtención de imágenes de tejidos mediante microscopía de fluorescencia. Aquí, las células rojas representan macrófagos alveolares que son positivos para NAAA activa.

La NAAA se localiza en estructuras vesiculares difusas, como puede observarse con mayor aumento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar y utilizar ARN 14 seis ocho seis para detectar NAAA activa en tejidos, tanto mediante inmunotransferencia de proteínas como mediante microscopía de fluorescencia. Además, aunque este protocolo es específico para nuestro objetivo, las aplicaciones del sonda que describimos podrían ajustarse fácilmente para diferentes sondas basadas en actividad específicas para objetivos distintos de la NAAA.