Name: Preparación y En Vivo El uso de una sonda basada en la actividad de N -acylethanolamine Ácido amidasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende a sintetizar y utilizar la sonda ARN14686 para detectar la forma activa de la enzima NAAA en extractos celulares y tejidos mediante microscopía de fluorescencia. Este método proporciona información fiable sobre el estado de activación de la enzima en condiciones fisiológicas y patológicas.

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Los autores agradecen al Centro de Imágenes de Nikon en el Istituto Italiano di Tecnologia, Génova, Italia (NIC@IIT).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La actividad enzimática se finamente regulada a diferentes niveles, incluyendo la transcripción de ARN, síntesis de proteínas, la translocación de proteínas, modificación después de la traducción, y la interacción proteína-proteína. A menudo, la expresión de la enzima sola no tiene en cuenta para su actividad. ABPP fue desarrollado para estudiar la actividad de las proteínas en su estado nativo. Se requieren dos características: una sonda química que se une covalentemente al sitio activo de una enzima de interés y una e...

Comúnmente utilizado métodos para investigar los patrones de expresión, interacciones y funciones de las proteínas, incluyendo las plataformas de cromatografía de espectrometría de masas para el análisis de líquidos escopeta 1,2, levadura de dos híbridos de métodos 3,4, y en ensayos in vitro, están limitadas en cuanto a que son no se puede evaluar la actividad de las proteínas en su estado nativo. basados ​​en la actividad de proteína de perfiles (ABPP) se puede utilizar para llenar este vacío. En este enfoque, las sondas de molécula pequeña capaz de unirse covalentemente al sitio activo de una enzima de interés se conjugan con un grupo indicador que permite la detección de blancos. El uso de la química clic (CC), el reportero puede ser integrado en la sonda o puede ser introducido después del acoplamiento de destino se ha producido 5,6. El último procedimiento requiere el uso de sondas que contienen grupos químicos apropiados, tales como un alquino o azida de terminal, que puede ser modificado con un número de reactivos de reportero a través de reacciones bio-ortogonal such como el Cu (I) catalizada Huisgen [3 + 2] cicloadición 7-9 o Staudinger ligadura 10,11. Recientemente, hemos revelado el ARN14686 compuesto como la primera ABP para la detección in vitro y in vivo de la hidrolasa cisteína, NAAA 12 en. NAAA cataliza la desactivación hidrolítica de FAEs saturados y monoinsaturados, incluyendo oleoiletanolamida (OEA) y palmitoiletanolamida (PEA), que son agonistas endógenos de la anti-inflamatoria receptor nuclear PPAR-alfa 13-15. NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B 14,16, lo que sugiere un papel en la regulación de la respuesta inmune innata. La enzima se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso en una forma inactiva y se activa en los compartimientos ácidos de la célula por un mecanismo autoproteolítica 17. La escisión autoproteolítica genera una nueva cisteína-terminal de N (C131 en ratones y ratas, C126 en los seres humanos), que es el nucleófilo responsable de FAE hidrólisis 18,19. La inhibición farmacológica de la actividad naaa altera el equilibrio de síntesis / degradación de la FAE en favor de un aumento de los niveles celulares de FAE 16,20,21. Varios derivados de β-lactona y β-lactámicos se ha demostrado que inhiben la actividad de NAAA con alta potencia y selectividad 16,22-26. Estos inhibidores actúan a través de S acilación de la cisteína catalítica 16,27,28. El ARN14686 compuesto fue diseñado sobre la base de la estructura química de la, inhibidor de la β-lactama NAAA serina derivados sistémicamente activo, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) 16. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal para la posterior conjugación CC con una etiqueta de reportero azida-cojinete. Hemos elegido para diseñar un SPA de dos pasos para MiniMally alterar la estructura del andamio original, manteniendo así la afinidad de la sonda para NAAA. Además, evitando la introducción de etiquetas voluminosos, una sonda de este tipo podría ser más adecuado para el tratamiento in vivo de un directo ABP. ARN14686 inhibe NAAA con alta potencia (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) mediante la formación de un aducto covalente con la cisteína catalítica de la enzima 12. Experimentos en ratas vivas mostraron que la sonda es selectiva en la captura de NAAA expresa en pulmones. Ceramidasa ácida, otra amidasa cisteína que comparte 33-34% de identidad con NAAA, también fue identificado como un objetivo de baja afinidad utilizando las altas concentraciones de sonda (10 micras de vitro, 10 mg / ml por vía intravenosa, iv) 12. También hemos utilizado ARN14686 para estudiar la presencia de NAAA activo en tejidos de rata inflamadas después de la administración de adyuvante completo de Freund (CFA) 29. A continuación, se describe un protocolo para los preparatien de ARN14686 (Figura 1) y su aplicación a la investigación de la activación NAAA ex vivo. Como ejemplo, se describe un procedimiento experimental para visualizar NAAA en patas de rata después de la administración CFA. En este experimento, las proteínas se extrajeron a partir de tejido de la pata después de la inyección iv de la sonda, y el proteoma marcado-ABP es sometido a CC con biotina-azida. muestras biotiniladas se enriquecen usando perlas de estreptavidina, y se llevan a cabo transferencias de proteínas. En otra aplicación, se describe la localización de NAAA activo por microscopía de fluorescencia en los pulmones del ratón de los ratones tratados con la sonda. En este caso, el tejido se seccionó y las secciones se someten a CC para la adición de rodamina. Un esquema de flujo de trabajo se ilustra en la Figura 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonildiimidazol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>2-dipiridiladcarbonato</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Inflamable, tóxico, peligroso para el medio ambiente acuático</td></tr><tr><td>4-(Dimetilamino)piridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Inflamable, corrosivo</td></tr><tr><td>Acetonitrilo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Inflamable, Tóxico</td></tr><tr><td>Carbón activado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Azodina-PEG3-Biotina</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de biocentrifugado</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica Bovin altamente tóxica (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Nitrato de amonio cérico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Hidrato de cloral oxidante, nocivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico Ciclohexadieno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Inflamable, Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Ciclohexano Sigma</td><td>Aldrich</td><td>34855</td><td>Inflamable, Nocivo, Peligro para la salud, Peligro para el medio ambiente</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Nocivo, Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Inflamable, Sulfóxido de</td></tr><tr><td>dimetilo nocivo (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>sulfóxido de dimetilo d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Inflamable, Nocivo</td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Inflamable, Glicerol nocivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Estreptavidina</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Estreptavidina&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Centrifugar brevemente antes de usar para precipitar complejos de proteínas</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Inflamable, Tóxico, Peligro</td></tr> <tr><td>para la saludN-(3-Dimetilaminopropil)-N&prime; -clorhidrato de etilcarbodiimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>Dañino, Corrosivo</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>Inflamable, Corrosivo, Tóxico</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Inflamable, Nocivo, Peligro</td></tr> para la salud<tr><td>N-Cbz-L-Serina</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>Microscopía confocal Nikon A1</td><td>Nikon</td><td></td><td>Leer el manual</td></tr><tr><td>de usuario NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> NP0335BOX <td></td></tr><tr><td>Paladio en carbono</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> 330108<td></td></tr><tr><td>p-anisidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Tóxico, Peligro para la salud, Peligro</td></tr> <tr><td>para el medio ambienteParaformaldehído</td><td>sigma Aldrich 441244</td><td></td><td>Tóxico, respiratorio nocivo, corrosivo, falmable</td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol)&nbsp;</td>Montaje antidecoloración <td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold con DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Evite la formación de burbujas</td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Tóxico, corrosivo, falmable</td></tr><tr><td>Hidruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td> inflamable <td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 escáner de inmage</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Leer el manual de usuario</td></tr><tr><td>Estreptavidina agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Terc-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Tóxico, inflamable</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Inflamable, Nocivo, Peligro para la salud</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Tóxico, caliente a 50 & grados; C para disolver</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 homogeneizador de tejidos básicos</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>Urea Nociva</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Tóxico, caliente a 50 &deg; C para disolver</td></tr></tbody></table>

preparación y<em&gt; en vivo</em&gt; el uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

perfiles de proteínas basado en las actividades (ABPP) es un método para la identificación de una enzima de interés en un proteoma complejo mediante el uso de una sonda química que se dirige a los sitios activos de la enzima. Una etiqueta de reportero introducido en la sonda permite la detección de la enzima marcada por el análisis en gel de fluorescencia, transferencia de proteínas, la microscopía de fluorescencia, o la espectrometría de cromatografía de masa líquida. Aquí, se describe la preparación y uso de la ARN14686 compuesto, una sonda basada en la actividad de química (CC-ABP) que reconoce selectivamente la enzima N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA). Naaa es una hidrolasa cisteína que promueve la inflamación mediante la desactivación de los agonistas alfa endógenos receptor activado por el proliferador de peroxisomas-(PPAR), tales como palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA). NAAA se sintetiza como una proenzima inactiva de longitud completa, que se activa por autoproteolisis en el pH ácido del lisosoma. Los estudios de localización have muestra que NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B. Proporcionamos ejemplos de cómo ARN14686 se puede utilizar para detectar y cuantificar NAAA activo ex vivo en los tejidos de roedores por transferencia de proteínas y microscopía de fluorescencia.

ARN14686 fue diseñado basado en el andamio de la ARN726 inhibidor naaa. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal (Figura 1). La etiqueta de alquino se introdujo con el fin de permitir el uso de un procedimiento de marcaje de dos pasos para añadir un fluoróforo o una molécula de biotina por medio de CC. Esta característica hace que ARN14686 una herramienta muy versátil para sondear ...

Aquí, se describe la preparación y uso de una sonda basada en la actividad (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) que permite la detección y cuantificación de la forma activa de la enzima proinflamatoria N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar la síntesis de la sonda basada en la actividad, ARN 14 seis ocho seis, específica para la N-aciletanolamina ácido amidasa, o NAAA, y describir su uso para detectar la enzima catalíticamente activa en extractos celulares y secciones de tejido. Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la función in viva de la NAAA, proporcionando información sobre la activación de la NAAA en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas, como enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas. Su principal ventaja es que una manipulación sencilla sigue a la reacción de la NAAA con la sonda, proporcionando así información confiable sobre el estado de activación in viva de la enzima.Otra ventaja es que, a diferencia de los anticuerpos específicos, nuestra sonda detecta únicamente la forma activa de la enzima, lo cual es útil para evaluar el estado mediante microscopía de fluorescencia. La demostración visual de este método es fundamental, ya que combina distintas especialidades que conforman una historia completa, desde la síntesis adecuada hasta sus aplicaciones finales. En un matraz redondo de 50 mililitros, disuelva 350 miligramos de undecinenol y tres puntos cinco mililitros de diclorometano anhidro.Luego, agregue 25 miligramos de DMAP y 530 miligramos de DPC a esta solución. Agite la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de 16 horas, agregue 20 mililitros de diclorometano a la solución.Transfiera la mezcla a un embudo de separación. Añada 15 mililitros de agua. Agite la mezcla y deje que las dos fases se separen.A continuación, abra la llave de paso, recoja la fase orgánica de la parte inferior, cierre la llave de paso y transfiera nuevamente la fase orgánica al embudo. Añada 15 mililitros de una solución saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla. Agite el embudo de separación y deje que las dos fases se separen. Después de secar la capa orgánica con sulfato de sodio, filtre a través de algodón en un matraz redondo de destilación escalonado. Luego evapore la capa orgánica hasta sequedad bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. Pese el matraz y obtenga 600 miligramos de aceite, que es una mezcla de dos carbonatos de piridilo undecinilo y undecinol, dos carboxilatos de oxipiridina, en una proporción de 1,7 a 1.En un matraz redondo de 10 mililitros, disuelva 60 miligramos de acetato de oxoacetidenoilamonio en 2 mililitros de diclorometano anhidro. Enfríe la solución a cero grados centígrados en un baño de hielo y luego agregue 81 microlitros de diazapropaletilamina gota a gota. A continuación, disuelva 350 miligramos de la mezcla cruda que contiene undecinol-2-carboxilato de oxipiridina en 2 mililitros de diclorometano anhidro.Añada la mezcla disuelta a la solución y agite a temperatura ambiente durante 15 horas. Luego, evapore el disolvente hasta sequedad bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. Purifique el compuesto mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando un aparato automatizado de cromatografía en columna.Primero, absorba la muestra en gel de sílice. Después de equilibrar la columna con ciclohexeno, cargue la muestra en el cartucho. Eluya la muestra con acetato de etilo en ciclohexano del cero al 100, recolectando los picos en tubos de ensayo.Evapore el disolvente de las fracciones correspondientes al compuesto hasta sequedad bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para obtener 40 miligramos de un sólido blanco. Después de pre-limpiar la muestra según se describe en el protocolo del texto, agregue 11,3 microlitros de un stock de 5 milimolar de azida de polietilenglicol biotina y vortexee. Luego, agregue 11,3 microlitros de un stock de 50 milimolar de TCEP recién preparado a la muestra y vortexee.Después de mezclar previamente 34 microlitros de una solución de trabajo recién preparada de TBTA uno punto siete milimolar con 11 punto tres microlitros de un stock de sulfato de cobre 50 milimolar, añada 45 punto tres mililitros de esta solución a la muestra y agite en vórtex. Utilice recipientes etiquetados. Incube la reacción a 25 grados Celsius durante al menos dos horas.Después de una incubación de una hora, observe la precipitación de proteínas y mezcle la reacción. Centrifugue la muestra durante cuatro minutos a 6.500 × g y 4 grados Celsius. Después de eliminar el sobrenadante, agregue 750 microlitros de metanol frío y resuspenda el precipitado mediante sonicación usando un sonicador de sonda durante cinco segundos.Luego, centrifugue la muestra durante cuatro minutos a 6 500 ×g a cuatro grados Celsius. Y retire el sobrenadante con una jeringa y una aguja. Después de lavar dos veces más con metanol frío, agregue 325 microlitros de SDS al 2,5 % en PBS al precipitado proteico.Someta la muestra a sonicación tres veces durante cinco segundos. A continuación, caliente la muestra durante cinco minutos a 65 grados Celsius. Tras la sonicación, centrifugue la muestra durante cinco minutos a 6.500 ×g a temperatura ambiente.Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 15 mililitros y agregue un punto cuatro mililitros de PBS al sobrenadante para diluir la concentración de SDS al cero punto cinco por ciento. Para el enriquecimiento con estreptavidina, primero ajuste el volumen de la muestra a cuatro punto dos mililitros con PBS. A continuación, agregue 40 microlitros de una suspensión al 50 % de agarosa de estreptavidina previamente lavada, utilizando una punta con el extremo cortado.Incube la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente con rotación. Después de centrifugar durante dos minutos a 1.400 ×g, retire el sobrenadante sin secar el botón de perlas. Utilice el sobrenadante residual para transferir las perlas a una columna de centrifugación de un mililitro y lave la columna por gravedad con un mililitro de SDS al uno por ciento en PBS.Continúe lavando las perlas con urea seis molar seguido de PBS según se describe en el protocolo escrito. Luego, use 500 microlitros de PBS para transferir las perlas lavadas a un tubo de un punto cinco mililitros. Después de centrifugar la muestra durante dos minutos a 1.400 ×g, aspire suavemente el sobrenadante con una jeringa y una aguja.Para eluir las proteínas unidas a la resina, agregue 25 microlitros de tampón de elución al pellet de resina e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de 15 minutos a 95 grados Celsius. Agregue aproximadamente 400 microlitros de mezcla de química click a cortes de tejido que hayan sido preparados según el protocolo descrito en el texto. Tenga cuidado de que el volumen elegido de la mezcla de química click sea suficiente para cubrir los cortes.Luego, incubar los fragmentos de tejido durante una hora a temperatura ambiente protegidos de la luz. Tras la incubación, lavar las muestras con PBS durante cinco minutos y luego con metanol frío durante cinco minutos. A continuación, lavar los fragmentos de tejido tres veces con una solución de Tween 20 al uno por ciento y EDTA cero punto cinco milimolar en PBS durante dos minutos.Finalmente, lave las secciones una vez más con PBS durante cinco minutos. Después de secar al aire, agregue una gota de medio de montaje antifade con DAPI. Cierre las muestras con cubreobjetos y selle con esmalte.Para la síntesis de la sonda, el undecinenol se activa mediante carbonato de dipyridilo en presencia de cuatro dimetilaminopiridina como catalizador, produciendo un carbonato mixto que luego reacciona con el lactam aminilo; la beta lactama o cabeza de la sonda reacciona con el sitio activo de NAAA, mientras que el alquino terminal puede funcionalizarse con una etiqueta marcadora mediante química click. ARN 14 seis ocho seis se utilizó para detectar la activación de NAAA en extractos proteicos de patas inflamadas de ratas mediante bloqueo proteico. En ratas ingenuas, no se detecta ninguna señal de NAAA.Por el contrario, en ratas tratadas con adyuvante de Freund completo se observa una banda marcada correspondiente a NAAA activa. Otra aplicación de ARN 14 seis ocho seis es la obtención de imágenes de tejidos mediante microscopía de fluorescencia. Aquí, las células rojas representan macrófagos alveolares que son positivos para NAAA activa.La NAAA se localiza en estructuras vesiculares difusas, como puede observarse con mayor aumento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar y utilizar ARN 14 seis ocho seis para detectar NAAA activa en tejidos, tanto mediante inmunotransferencia de proteínas como mediante microscopía de fluorescencia. Además, aunque este protocolo es específico para nuestro objetivo, las aplicaciones del sonda que describimos podrían ajustarse fácilmente para diferentes sondas basadas en actividad específicas para objetivos distintos de la NAAA.

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Investigación

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