Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

El objetivo general de este método es investigar los cambios en la composición lipídica de los neutrófilos durante la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos mediante cromatografía en capa fina y HPLC. Este método se puede utilizar para obtener información más detallada sobre los mecanismos que están involucrados en la formación de trampas extracelulares de neutrófilos, o brevemente denominada formación de NET. La principal ventaja de este procedimiento es que proporciona información sobre el papel de los lípidos en la función general de los neutrófilos mediante la utilización de un protocolo fácil de seguir.

El aislamiento de células derivadas de la sangre humana será demostrado por una antigua estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, Ariane Neumann. Y contará con la asistencia de Friederike Reuner. La preparación de las células para el análisis de lípidos será demostrada por Graham Brogden, un postdoctorado en mi laboratorio, y Diab Husein, un estudiante de maestría en el programa de bioquímica.

Para aislar los neutrófilos derivados de la sangre humana, colocan una capa de aproximadamente 20 mL de sangre sobre 20 mL de solución de diatrizoato de sodio/dextrano cerca de una llama, sin mezclar. Centrifugar durante 30 minutos a 470 veces g sin frenar. Es fundamental no mezclar la fase sanguínea con el grado de densidad en solución.

Después de la etapa de centrifugación, las células mononucleares deben retirarse con cuidado para evitar la contaminación o la activación inespecífica de las células. Retire las células mononucleares y la capa de plasma amarillenta. Transfiera la célula polimorfonuclear, o fase PMN, a un nuevo tubo de 50 mL y llénelo hasta 50 mL con solución salina tamponada con fosfato 1X.

Centrifugar la muestra durante 10 minutos a 470 veces g con frenado. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 mL de agua estéril durante cinco segundos para lisar los eritrocitos. Llene inmediatamente el tubo hasta 50 ml con 1X PBS y centrifugue la muestra.

Al retirar el sobrenadante, el pellet debe ser blanco. Si todavía está rojo, repita estos pasos. Luego vuelva a suspender el pellet en 1000 microlitros de Roswell Park Memorial Institute, o medio RPMI.

Cuente el número de células con tinción con azul de tripán y un hemocitómetro bajo un microscopio óptico. Prepare una suspensión celular en RPMI a una concentración de dos millones de células por mL. Se pueden recolectar aproximadamente 25 millones de neutrófilos de 20 ml de sangre.

Para tratar farmacológicamente los neutrófilos para el análisis de lípidos, utilice 15 millones de las células preparadas. Incubar las muestras en los tubos de reacción durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la centrifugación de las muestras, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en 300 microlitros de HBSS.

Después de volver a centrifugar la muestra utilizando los mismos parámetros, vuelva a suspender el pellet de celda en 1 ml de una solución 1:1 de cloroformo:metanol. A continuación, homogeneice el gránulo resuspendido con una cánula de calibre 26 empujando la muestra hacia adentro y hacia afuera de una jeringa de 1 ml 10 veces. Para aislar los lípidos de los neutrófilos derivados de la sangre periférica humana, tome los neutrófilos preparados y colóquelos en hielo.

Pipetear los neutrófilos en un tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mL con un sello de PTFE y homogeneizarlos agitándolos durante un minuto. A continuación, añada 2 mL de metanol seguido, un minuto después por 1 mL de cloroformo. Después de agitar durante otro minuto, gire los tubos de vidrio a temperatura ambiente y 50 rpm durante 30 minutos.

A continuación, granule la fracción de proteína centrifugando la solución a 7 grados centígrados y 1.952 veces g durante 10 minutos. Decanta cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mL, dejando atrás la pastilla que contiene proteínas. Almacene el pellet a 20 grados centígrados para su posterior cuantificación.

Agregue 1 mL de cloroformo y espere un minuto. A continuación, añada 1 ml de agua bidestilada e invierta el tubo de vidrio con tapón de rosca con la muestra durante 30 segundos. Después de centrifugar la muestra como antes, retire y deseche la fase superior hasta la capa turbia, pero sin incluirla.

Seque las muestras en un concentrador de vacío a 60 grados centígrados y guárdelas a 20 grados centígrados hasta que sea necesario. Para comenzar, llene hasta 5 mL de cada solución en la cámara de vidrio correspondiente. Agregue cualquier tipo de papel de filtro para aumentar la velocidad de funcionamiento en cada cámara.

Preincube una placa de vidrio de gel de sílice HPTLC 60 de 20x10 cm en la primera solución de funcionamiento. Una vez que la solución corriente llegue a la parte superior de la placa, séquela durante 10 minutos a 110 grados centígrados. Disolver la pastilla lipídica, previamente obtenida después del secado con un concentrador de vacío, en el volumen deseado de solución 1:1 de cloroformo:metanol, e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados para disolver.

A continuación, utilice una regla y un lápiz suave para marcar los puntos de carga para el número deseado de muestras más al menos un estándar. Marque la distancia de carrera en aproximadamente 4 cm para la primera solución de carrera y en aproximadamente 6 cm para la segunda solución de carrera. Para cargar las muestras, lave la jeringa de 10 microlitros tres veces en cloroformo:metanol 1:1 antes de cargar cada nueva muestra.

Cargue 10 microlitros de cada muestra gota a gota, tratando de concentrar la muestra en un área lo más pequeña posible. Coloque la placa verticalmente en la primera cámara con solución móvil uno. Asegúrese de que la placa esté paralela a la pared de la cámara de vidrio para lograr una velocidad de migración uniforme.

Tenga cuidado de que las placas estén colocadas paralelas a la pared posterior de las cámaras de vidrio y que los frentes de solvente no se extiendan demasiado para garantizar que los lípidos se separen de manera eficiente. Una vez que la línea de solvente haya alcanzado la primera marca, retire la placa, séquela y colóquela en la segunda solución. Repita pasos similares para la segunda y para la tercera solución en ejecución.

Deje la placa en la solución hasta que el frente del solvente llegue a la parte superior de la placa. Luego, retire el plato y séquelo a temperatura ambiente durante un minuto. Coloque la placa en la solución de sulfato de cobre durante siete segundos.

Después de secar bien el plato, hornee en un horno durante siete minutos a 170 grados centígrados. Retira la placa del horno y deja que se enfríe. Para realizar HPLC, conecte la columna a un cartucho protector en el instrumento y caliéntelo a 32 grados centígrados.

Utilice metanol como fase móvil a un caudal de 1 mL por minuto y 65 bar. Configure el detector UV para medir a 202 nanómetros para cuantificar la cantidad de colesterol en cada muestra. Lave bien la máquina de HPLC antes de analizar las muestras y establezca una curva estándar de colesterol como se describe en el protocolo de texto.

Por último, vuelva a suspender las muestras en 500 microlitros de cloroformo:metanol 1:1 en botellas de vidrio de 1,5 ml de color ámbar con tapas de rosca de PTFE rojo/silicona blanca antes de cargarlas en el instrumento de HPLC. Aquí se muestra el perfil lipídico de los neutrófilos en una placa HPTLC. Los lípidos se pueden identificar comparando las distancias de migración con el estándar.

También se muestra un cromatograma de HPLC que muestra dos picos grandes. El primer pico, justo antes de los dos minutos, es el cloroformo. El segundo gran pico a los cinco minutos es el colesterol.

Aquí se muestran las curvas estándar de colesterol determinadas por HPLC y por HPTLC. La curva estándar obtenida por HPLC es lineal en un rango de concentración más amplio en comparación con la curva estándar HPTLC. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neutrófilos derivados de la sangre humana y, posteriormente, analizar su composición lipídica.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar guantes de nitrilo para proteger sus manos contra la exposición peligrosa al cloroformo: metanol y también para trabajar debajo de una campana extractora. Los experimentos futuros proporcionarán más información sobre los mecanismos implicados en la formación de NET y las funciones generales de los neutrófilos, que aún no se comprenden completamente. No olvide que trabajar con células primarias derivadas de la sangre humana requiere un permiso ético, así como precauciones de seguridad adecuadas, como trabajar en un laboratorio de bioseguridad respectivo para evitar el riesgo de exposición a patógenos humanos.

Por último, el objetivo de nuestro estudio es encontrar nuevas dianas terapéuticas frente a una infección basadas en el sistema inmune innato, y en especial la composición lipídica es muy interesante para nosotros ya que nos ayudará a entender por qué el neutrófilo está actuando antimicrobiano frente a una infección.