Name: Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprende a estudiar la asociación de proteínas arquitectónicas como HMGB1 con daño específico de ADN en células humanas mediante inmunoprecipitación de cromatina modificada y ensayos de superenrollamiento de ADN. Este método permite identificar nuevas dianas farmacológicas para terapia contra el cáncer.

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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Vásquez útil para los debates. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer [CA097175, CA093279 a KMV]; y la Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Tejas [RP101501]. La financiación de cargo de acceso abierto: Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer [CA093279 a KMV].

1. Preparación de ICL dirigidas-TFO en el plásmido Sustratos <ol><li> Incubar cantidades equimolares de plásmido pSupFG1 10,11 ADN (plásmido ADN 5 mg es un buen punto de partida) con psoraleno conjugado TFO GA30 en 8 l de tampón de unión triplex [glicerol al 50%, Tris 10 mM (pH 7,6), MgCl 10 mM 2] y dH 2 O hasta un volumen final de 40 l en un tubo de color ámbar. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción a 37 ° C baño de agua durante 12 hr. </li><li> Calentar la lámpara de rayos UVA para garantizar la máxima potencia de salida. Coloque la reacción triplex en la película de parafina, y colocar la lámina de parafina en el hielo bajo el (365 nm) de la lámpara UVA. Colocar un filtro Mylar entre la lámpara y la reacción. </li><li> UVA irradiar para una dosis total de 1,8 J / cm 2. Almacenar las muestras a 4 ° C para su uso posterior. Precaución: Use gafas de protección adecuado y ropa con irradiación UVA. </li><li> Linealizar 200 ng del plásmido preparado anteriormente con el reenzima restricción Eco R1 en un volumen total de 20 l usando el fabricante suministra 10x tampón. Heat desnaturalizar la enzima durante 20 min a 65 ° C. Girar las muestras durante 10 minutos a 10.000 xg y almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar 50x tampón alcalino [NaOH 1,5 M, ácido etilendiaminotetraacético 50 mM (EDTA)]. Añadir 0,5 mg de agarosa a 50 ml de dH2O Hervir para disolver la agarosa y colocarlo en un baño de agua a 50 °. </li><li> Después de que la temperatura de la agarosa disuelta se ha reducido a 50 ° C, añadir 1 ml del tampón 50x alcalino, se mezcla y luego verter el gel en la bandeja de gel. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente antes de su uso. </li><li> Añadir 4 l de 0,5 M EDTA a los 20 l de muestra de ADN linealizado y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir tampón de carga de gel alcalino 6x (NaOH 300 mM, EDTA mM 6, 18% (w / v) de alto peso molecular polisacárido, 0,06% verde de bromocresol en dH 2 O) a las muestras y a una escalera de ADN de 1 kb. NOTA: Es importante usar un tampón de carga de gel 6x alcalina, por favor véase el debate. </li><li> Cargar las muestras en el gel en la cámara frigorífica y correr durante la noche en tampón alcalino 1x (12-16 h) en 3,2 voltios por cm. Una vez que las muestras han entrado en el gel, colocar una placa de vidrio en la parte superior del gel para evitar que se flotante. </li><li> Neutralizar las muestras por inmersión del gel en tampón de neutralización [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, acetato de sodio 3 M (pH 5,2)] durante 45 min a temperatura ambiente. </li><li> Tinción del gel para el ADN con 4 l de 1% de bromuro de etidio (EtBr) en 50 ml de agua durante 1 hora a temperatura ambiente. Destain con agua durante 15 minutos. Visualizar el ADN mediante el uso de un sistema de imagen. Precaución: EtBr es un potente mutágeno y puede ser absorbido por la piel. Evitar el contacto directo con EtBr. </li></ol> 2. Transfección e inmunoprecipitación de los plásmidos que contienen ICL-dirigidos-TFO en las células humanas <ol><li> Placa de 400.000 células de mamíferos (por ejemplo, U2OS océlulas steosarcoma) por placa de 60 mm en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) sin antibióticos 24 h antes de la transfección. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Antes de la transfección, el medio de crecimiento caliente y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C en un baño de agua. Calentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente. </li><li> Incubar 30 l de reactivo de transfección con 500 l de medio de crecimiento 1x (mezcla 1) y 2 g de tubos de fondo redondo-dirigidas TFO ICL que contiene plásmidos en 500 l de 1x medio de crecimiento (mezcla 2) en separadas 14 ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir la mezcla de 1 a 2 mezclar, mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo. Incubar durante 25-30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS caliente. Añadir la mezcla de transfección de una manera gota a gota distribuir uniformemente a través de la placa de células. Añadir 1 ml de medio de crecimiento a la placa y llevar el volumen final a 2 ml. mezclar nosll. Colocar las placas de cultivo en el incubador a 37ºC con 5% de CO2 durante 4 horas. </li><li> Reemplazar los medios de comunicación con los medios 3 ml de crecimiento suplementado con FBS al 10%, y se incuba durante 16 horas más. No utilice antibióticos. </li><li> Tratar las células con 80 l de 37% de formaldehído fresca por placa a una concentración final de aproximadamente 1% y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente en ausencia de luz. Precaución: El formaldehído es tóxico y debe ser manejado de acuerdo con sus instrucciones de seguridad. La exposición al formaldehído puede causar daño a la piel, los ojos y el tracto respiratorio. </li><li> Se detiene la reticulación de formaldehído mediante la adición de 300 l de glicina enfriada (suministrado en kits disponibles en el mercado) por placa y la incubación durante 5 min. Retire el medio y lavar dos veces con PBS enfriado, y luego recoger las células por raspado en 1 ml refrigerado (4 ° C) de PBS en un tubo de microcentrífuga. Mantener las muestras en hielo en todo momento. </li><li> Preparar los sedimentos celulares por centrifugación a 4 ° C durante 5 min unat 13.400 xg utilizando una centrífuga de mesa refrigerada. Pipetear a cabo el sobrenadante y coloque el sedimento de células en hielo. </li><li> Homogéneamente resuspender el precipitado en 1 ml enfriado (4 ° C) Tampón A (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba en hielo durante 10 min. Mezclar ocasionalmente invirtiendo el tubo. Precipitar las células como antes (véase el paso 2.9). </li><li> Homogéneamente resuspender el precipitado en 1 ml enfriado (4 ° C) Tampón B (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba en hielo durante 10 min con mezcla ocasional por inversión. Precipitar las células por centrifugación como antes (véase el paso 2.9). </li><li> Resuspender las células de nuevo en 200 l refrigerados Tampón B. Añadir 2 l de nucleasa microcócica (MNasa) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Mezcla de reacción de vez en cuando con un movimiento rápido del tubo. Detener la reacción MNase colocando el tubo en hielo y añadiendo EDTA 40 mM. Precipitar las células como antes (véase el paso 2.9). </li><li> Resuspender las células en 100 l 1x immunopr cromatinatampón de memoria intermedia (ChIP) ecipitation (suministrado en kits disponibles en el mercado) suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa. </li><li> Colocar las células resuspendidas en un tubo de microcentrífuga de pared delgada. Sonicar las muestras por ellos flotando en el agua baño de ultrasonido durante 20 segundos, seguido de 20 segundos de incubación en hielo. Repita los pasos del tratamiento con ultrasonidos 9 veces para generar ~ 800-1.200 pb fragmentos. <ol><li> A 20 l de las muestras sonicadas añadir 3 l 5 M NaCl y 1 l de RNasa A. Mezclar bien por agitación e incubar a 37 ° C durante 30 min. Posteriormente, añadir 2 l de proteinasa K y se incuba durante 2 horas a 65 ° C. Purificar las muestras usando un kit de purificación de PCR. Ejecutar las muestras en gel de agarosa al 1% y visualizar con EtBr. NOTA: Intensidad máxima del ADN resultante debe estar en o por debajo de 1.000 pb. </li></ol></li><li> En tres tubos separados, añadir 30 l de lisado en un tubo de silicona previamente enfriada y luego añadir 70 l de tampón 1x chip refrigerado con inhibidores de la proteasa añadido. Añadir 1 μg de anti-inmunoglobulina G (IgG), H3 anti-histona (como control positivo), o anticuerpos anti-HMGB1 a los respectivos tubos. Incubar toda la noche en una habitación fría con la rotación continua. </li><li> perlas de proteína G Resuspender homogéneamente en la habitación fría. Añadir 4 l de proteína G cuentas por tubo y se incuba durante otra 2-4 hr en la cámara fría con la rotación. </li><li> El uso de un bastidor magnético, sedimentar las perlas y eliminar el sobrenadante. Añadir 200 l de tampón 1x ChIP mezclado con cóctel inhibidor de proteasa para el sedimento y se lava durante 5 minutos en la cámara fría con la rotación. Repetir el lavado dos veces. </li><li> Realizar un lavado adicional con alto contenido de sal tampón 1x chip (que contenía NaCl 70 mM). </li><li> Resuspender los sedimentos con tampón de elución 160 l (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba a 37 ° C con rotación durante 30 min. </li><li> Sedimentar las perlas y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. Añadir 6 l de NaCl 5 M y 2 l de proteinasa K, y se incuba durante la noche a 65DO. </li><li> Se purifica el ADN utilizando un kit de purificación de productos de PCR y se eluye el ADN utilizando 50 l dH 2 O. </li><li> Realizar PCR 16 reacciones que usan conjuntos de cebadores para la región (s) de interés, y resolver los productos en un gel de agarosa al 1% teñido con EtBr. </li></ol> 3. Ensayo de superenrollamiento y 2-dimensional en gel de agarosa La electroforesis <ol><li> Preparar tampón de síntesis de reparación de ADN (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; mM KCl 70; 7,4 mM MgCl 2; TDT 0,9 mM; EDTA 0,4 mM; ATP 2 mM, 20 mM dNTPs, 3,4% de glicerol y 18 mg albúmina de suero bovino) . Almacenar a -80 ° C. Descongelar en hielo y antes de su uso añadir fosfocreatina 40 mM y 2,5 g de creatina fosfoquinasa. </li><li> Preparar tampón 10x superenrollamiento [500 mM de Tris (pH 8,0), NaCl 500 mM, 25 mM de MgCl2, EDTA 1 mM], y se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Linealizar 300 ng de ADN plásmido superenrollado pSupFG1 por completo con 1 l de vaccinia topoisomerasa I (5-15 U / l) con 1 monitortampón de superenrollamiento en una reacción de 10 microlitros. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 1 hr. </li><li> Descongelar HeLa extracto libre de células 24 en el hielo. Para los plásmidos completamente relajado, añadir 25 l HeLa extracto libre de células y el tampón de la síntesis de reparación del ADN. Mezclar bien. Añadir 1 l adicionales de la vacuna topoisomerasa I a la mezcla, y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Terminar las reacciones mediante la adición de dodecil sulfato de sodio (SDS) (1% de concentración final) y proteinasa K (0,25 mg / ml de concentración final). Incubar a 65 ° C durante 2 hr. </li><li> Reparto de un gel de agarosa al 1% con tampón 1x Tris Borato EDTA (TBE). Añadir colorante de carga de ADN y cargar las reacciones directamente sobre el gel de al menos 4 carriles separados. Ejecutar el gel de 8-10 horas a 2 V / cm en TBE 1x (dimensión 1) a temperatura ambiente para resolver los topoisomers. NOTA: Preparar una solución madre 5x TBE en 1 l de dH2O mediante la adición de 54 g de base Tris. 27,5 g de ácido bórico y 20 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Preparar 2 L de 1xTBE con 3 mg / ml de cloroquina-fosfato. Remojar el gel en 200 ml de esta solución durante 20 min. Cubra la bandeja de gel con papel de aluminio. </li><li> Para a electroforesis el gel en la segunda dimensión, gire el gel a 90 ° en un sentido horario y ejecutarlo para 4-6 horas a 2 V / cm en la cloroquina que contiene 1x TBE para resolver los supercoils positivos y negativos. </li><li> Teñir el gel con bromuro de etidio durante 1 hora en un agitador. Destain el gel con dH 2 O durante 15 min y posteriormente visualizar la distribución térmica de los topoisomers utilizando un generador de imágenes. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

La formación eficiente de ICL dirigidas-TFO depende de dos factores cruciales: En primer lugar, los componentes del tampón adecuado (por ejemplo, MgCl 2) y el tiempo de incubación de la TFO con su sustrato de ADN diana (depende de la afinidad de unión del TFO a su diana dúplex y las concentraciones se utiliza); y segundo, la dosis apropiada de UVA (365 nm) de irradiación para formar entrecruzamientos de psoraleno de manera eficiente. la formación de triplex óptimo se puede lograr mediante el uso de H...

Triplex de formación de oligonucleótidos (TFOs) de ADN se unen dúplex de una manera específica de secuencia a través de enlaces Hoogsteen-hidrógeno para formar estructuras de triple helicoidal 1-5. Tecnología Triplex se ha utilizado para interrogar a una variedad de mecanismos biomoleculares, tales como la transcripción, daño en el DNA de reparación, y la orientación de genes (revisado en las referencias 6-8). TFOs se han utilizado ampliamente para inducir daño de sitio específico en plásmidos informadores 9,10. Nuestro laboratorio y otros han utilizado previamente un TFO, GA30, atado a una molécula de psoraleno para inducir reticulaciones entre cadenas de ADN específicas de sitio (ICL) en el gen su p F en el plásmido pSupFG1 5,10-12. ICL son altamente citotóxicos ya que estas lesiones se entrecruzan covalentemente las dos hebras de ADN, y si se deja sin reparar, puede bloquear la transcripción de genes e impedir la maquinaria de replicación del ADN 13,14. Debido a su potencial citotóxico, agentes inductores de ICL-han sido utilizados como fármacos quimioterapéuticos en el tratamientode cáncer y otras enfermedades 15. Sin embargo, el tratamiento y la reparación de ICL en las células humanas no se entiende bien. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el procesamiento de ICL en las células humanas puede ayudar a mejorar la eficacia de los regímenes quimioterapéuticos basados ​​en ICL. ICL inducidos por TFO y sus intermedios de reparación tienen el potencial de causar distorsiones estructurales importantes para la hélice de ADN. Estas distorsiones son objetivos probables para las proteínas de arquitectura, que se unen a ADN distorsionada con mayor afinidad que a forma canónica B dúplex de ADN 16-20. Aquí, se estudió la asociación de una proteína de arquitectura muy abundante, HMGB1 con ICL en las células humanas a través de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ensayos en plásmidos de psoraleno-reticulada y se identificaron un papel para la HMGB1 en la modulación de la topología del ADN plasmídico psoraleno reticulado en humanos lisados ​​celulares de cáncer. HMGB1 es un muy abundantes y de expresión ubicua no suarquitectónico de proteínas tono que se une al ADN dañado y sustratos de ADN, alternativamente, estructurados con mayor afinidad que forma canónica B ADN 17-20. HMGB1 participa en varios procesos metabólicos de ADN, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN 16,21-23. Hemos demostrado previamente que la HMGB1 se une a ICL dirigidas-TFO in vitro con alta afinidad 20. Además, hemos demostrado que la falta de HMGB1 aumenta el procesamiento mutagénico de ICL dirigidas-TFO y HMGB1 identificado como una reparación por escisión de nucleótidos (NER) co-factor 23,24. Recientemente, hemos encontrado que la HMGB1 se asocia con ICL dirigidas-TFO en las células humanas y su reclutamiento a tales lesiones depende de la proteína NER, XPA 16. Superenrollamiento negativo del ADN se ha demostrado que la promoción de la eliminación eficaz de las lesiones del ADN por NER 25, y hemos encontrado que HMGB1 induce superenrollamiento negativo preferentemente en plas ICL contienen dirigidas-TFOmediados de sustratos (en relación con los plásmidos sustratos no dañado) 16, que proporcionan una mejor comprensión de la función (s) potencial de HMGB1 como un co-factor de NER. El procesamiento de ICL no se entiende completamente en las células humanas; por lo tanto, las técnicas y ensayos desarrollados en base a las herramientas moleculares descritos en este documento podrían conducir a la identificación de nuevas proteínas implicadas en la reparación ICL, que a su vez pueden servir como dianas farmacológicas que pueden ser explotados para mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia del cáncer. Aquí, un enfoque eficaz para evaluar la eficacia de la formación dirigida ICL-TFO en el ADN plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante se ha discutido. Además, el uso de los plásmidos que contienen las ICL dirigidas-TFO, las técnicas para determinar la asociación de HMGB1 con plásmidos dañadas-ICL en un contexto celular utilizando ensayos de chip modificados se han descrito. Además, un método fácil para el estudio de modificaciones topológicas introducidas por THe proteína HMGB1 arquitectónico, específicamente en sustratos plásmido dañados-ICL en lisados ​​de células humanas se ha determinado mediante la realización de ensayos de superenrollamiento a través de electroforesis en gel de agarosa de dos dimensiones. Las técnicas descritas se pueden utilizar para favorecer la comprensión de la implicación de la reparación del ADN y las proteínas de arquitectura en el procesamiento de daño del ADN objetivo en los plásmidos en las células humanas. Describimos protocolos detallados para la formación de ICL de psoraleno específicas de sitio dirigidas-TFO en el ADN plásmido, y la posterior ChIP plásmido y superenrollamiento ensayos para identificar proteínas que se asocian con las lesiones, y proteínas que alteran la topología del ADN, respectivamente. Estos ensayos pueden ser modificados para llevar a cabo con otros agentes que daña el ADN, TFOs, sustratos de plásmidos, y las líneas de células de mamíferos de interés. De hecho, hemos demostrado que hay al menos un potencial afinidad único y de alta sitio TFO vinculante dentro de cada gen anotado en el genoma humano 26. Cómonunca, para mayor claridad, describimos estas técnicas para el uso de un conjugado TFO-psoraleno específico (pAG30) en un plásmido reportero mutación específica (pSupFG1) en células U2OS humanas como hemos utilizado en Mukherjee y Vasquez, 2016 16.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Reactivo Certificado Co., Midland, TX</td><td>Pedido personalizado</td><td>HPLC (o gel) purificado</td></tr><tr><td>ChIP Kit de cromatina enzimática simple Cell</td><td>signaling Inc.</td><td>9003</td><td>El protocolo sugerido por el fabricante está optimizado para la cromatina IP y no para el plásmido IP. El fabricante suministra los anticuerpos IgG y H3 de control, así como las perlas de proteína G y la nucleasa microcócica.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>Mezcla maestra de PCR</td></tr><tr><td>Anticuerpo HMGB1</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel y kit de limpieza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Sal de cloroquina-difosfato</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>Para electroforesis bidimensional en gel de agarosa</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección GenePORTER</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerasa I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray lámpara ultravioleta de onda larga</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>Lámpara UVA</td></tr><tr><td>Bioprocesador multifuncional EpiSonic 1100 Epigentek</td><td></td><td>EQC-1100</td><td>Sonicador de baño de agua</td></tr><tr><td>Filtro Mylar</td><td>GE Healthcare Ciencias de la</td> <td>vida</td><td></td>80112939</tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>Sistema BIO-RAD</td><td>XRS+</td><td>Sistema de imágenes de ADN</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Utilizado para reticulación&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Verde de bromocresol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>Colorante de carga de ADN</td></tr><tr><td>Tubos siliconados</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-320 Tubo de</td><td>microfuga de baja retención</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fotómetro</td> de <td>BP24731</td><td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td></td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A Medición de</td><td>dosis de</td></tr> <tr><td>UVA<fuerte>Líneas celulares</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osteosarcoma humano U2OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Cultivado según el proveedor' s recomendación</td></tr><tr><td>Adenocarcinoma de cuello uterino humano HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Cultivado según el proveedor' s recomendación Imprimación</td></tr><tr><td>proximal hacia adelante</td><td>5&prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imprimación inversa proximal</td><td>5&prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cebador distal hacia adelante</td><td>5&prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cebador inverso distal</td><td>5&prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herramientas para estudiar el papel de la proteína hmgb1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de adn específica de sitio enlaces cruzados

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

cuadro de grupo de alta movilidad 1 proteína (HMGB1) es una proteína de arquitectura no histonas que está implicado en la regulación de muchas funciones importantes en el genoma, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN. HMGB1 se une al ADN estructuralmente distorsionado con mayor afinidad que a B-DNA canónica. Por ejemplo, se encontró que la HMGB1 se une al ADN enlaces cruzados (ICL), que enlazan covalentemente las dos hebras del ADN, provocar una distorsión de la hélice, y si se deja sin reparar puede causar la muerte celular. Debido a su potencial citotóxico, varios agentes inductores de ICL se utilizan actualmente como agentes quimioterapéuticos en la clínica. Mientras que los agentes formadores de ICL muestran preferencias por determinadas secuencias de bases (por ejemplo, 5&#39;-TA-3 &#39;es el sitio preferido para la reticulación de psoraleno), inducen daños en el ADN en gran medida de forma indiscriminada. Sin embargo, acoplando covalentemente el agente ICL-inducir a un oligonucleótido formador de triplex-(TFO), que se une al ADN en una secuencia específicamanera, el daño del ADN objetivo se puede lograr. Aquí, nosotros usamos una TFO conjugado covalentemente en &#39;extremo a un 4&#39;-hidroximetil-4,5 &#39;5 el psoraleno trimetilpsoraleno-8, (HMT) para generar una ICL específica de sitio en un plásmido reportero mutación para su uso como una herramienta de para estudiar la modificación de arquitectura, el procesamiento, y la reparación de las lesiones del ADN complejos por HMGB1 en las células humanas. Se describen las técnicas experimentales para preparar ICL dirigidas-TFO en plásmidos informadores, y para interrogar a la asociación de HMGB1 con los dirigidos ICL-TFO en un contexto celular utilizando ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Además, se describen ensayos de superenrollamiento del ADN para evaluar la modificación de arquitectura específica del ADN dañado mediante la medición de la cantidad de vueltas superhelical introducidas en el plásmido psoraleno reticulado por HMGB1. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar los papeles de otras proteínas implicadas en el procesamiento y la reparación de ICL dirigidas-TFO u otros daños en el ADN objetivo en cualquier línea celular de interés.

La formación de la ICL dirigida TFO es crítico para los ensayos basados ​​en plásmidos, que se utilizan para interrogar a las funciones de las proteínas de arquitectura en el procesamiento de ICL en células humanas. Electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa es una manera fácil de determinar la eficacia de la formación ICL dirigida TFO. Los plásmidos que albergan ICL dirigidas-TFO migran con una movilidad más lenta a través de la matriz de gel de agarosa (Figura 1A,</stron...

El daño dirigido al ADN se puede lograr atando un agente dañino para el ADN a un oligonucleótido formador de triplex (TFO). Mediante el uso de TFO modificados, la asociación de proteínas específicas del daño del ADN y la modificación de la topología del ADN se pueden estudiar en células humanas mediante la utilización de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina modificada y ensayos de superenrollamiento del ADN descritos en este documento.

Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

El objetivo general de los experimentos modificados de inmunoprecipitación de cromatina y superenrollamiento de ADN es estudiar la asociación y las modificaciones topológicas posteriores inducidas por proteínas arquitectónicas sobre daños específicos en el ADN inducidos por agentes quimioterapéuticos o carcinogénicos en células humanas. Esta metodología nos permitirá abordar preguntas clave sobre el daño y la reparación del ADN, lo que debería facilitar el descubrimiento de nuevos blancos farmacológicos para el tratamiento del cáncer. Nuestra tecnología nos permite dirigir daños específicos en el ADN y facilita la evaluación de procesos críticos de reparación del ADN relacionados con el cáncer humano.Para comenzar, 24 horas antes de la transfección, siembre 400 000 células de mamífero por placa de 60 milímetros en DMEM suplementado con 10% de FBS sin antibióticos. Incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante la noche. En un tubo cónico de 14 mililitros con fondo redondo, mezcle 30 microlitros de agente transfectante a temperatura ambiente con 500 microlitros de medio de crecimiento 1X previamente calentado a 37 grados Celsius.En un segundo tubo, combine dos microgramos de plásmidos que contienen ICL dirigidos por OLT en 500 microlitros de medio de crecimiento 1X. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Combine la mezcla uno con la mezcla dos, y aspire y expulse con una pipeta para mezclar completamente.Luego, incube la solución a temperatura ambiente durante 25 a 30 minutos. A continuación, use PBS tibio para lavar las células dos veces. Después, agregue la mezcla de transfección gota a gota, distribuyendo la solución uniformemente por toda la placa de células.Añada un mililitro de medio de crecimiento a la placa y complete un volumen final de dos mililitros. Mezcle bien y coloque las placas de cultivo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cuatro horas después, sustituya el medio por tres mililitros de medio de crecimiento con 10% de suero bovino fetal, e incube 16 horas adicionales.Después de la incubación, agregue 80 microlitros de formaldehído fresco al 37% por placa a las células e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. Detenga la reticulación con formaldehído agregando 300 microlitros de glicina fría por placa e incube durante cinco minutos. Luego, retire el medio y use PBS frío para lavar las placas dos veces.A continuación, después de agregar un milímetro de PBS frío, recolecte las células raspando en un tubo de microcentrifugado sobre hielo, manteniendo las muestras en hielo en todo momento. Prepare los pellet celulares centrifugando a 13.400 × g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Luego, retire el sobrenadante y coloque los pellet sobre hielo.Utilice un mililitro de tampón A frío para resuspender homogéneamente los pellet y luego incube en hielo durante 10 minutos. A continuación, pelletice las células como antes. Ahora, con un mililitro de tampón B frío, resuspenda homogéneamente los pellet e incube en hielo durante 10 minutos con mezclas ocasionales mediante inversión.Luego, centrifugue las células como antes. Después de resuspender las células nuevamente en 200 microlitros de tampón B frío, agregue dos microlitros de micrococca nuclease, o MNase, e incube la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, detenga la reacción de MNase colocando los tubos en hielo y agregando 40 milimolar de EDTA.El grado de digestión mediante la nucleasa micrococálica es muy crítico, ya que una sobredigestión puede provocar pérdida de señal, mientras que una digestión insuficiente puede generar un fondo inespecífico considerable. Después de centrifugar las células, re-suspenda los pellet en 100 microlitros de tampón de inmunoprecipitación de cromatina, o ChIP, suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrifugado de pared delgada.Sonicar las muestras flotándolas en un baño ultrasónico durante 20 segundos, seguido de 20 segundos en hielo. Repetir los pasos de sonicación nueve veces para generar fragmentos de aproximadamente 800 a 1.200 pares de bases. A 20 microlitros de las muestras sonicadas, agregar tres microlitros de cloruro de sodio cinco molar y un microlitro de RNasa A. Vortexar los tubos e incubarlos a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Luego, agregue dos microlitros de proteinasa K e incube a 65 grados Celsius durante dos horas. Después de purificar las muestras según el protocolo descrito en el texto, sepárelas en un gel de agarosa al 1% y visualícelas con bromuro de etidio. En tres tubos de silicona separados y previamente enfriados, agregue 30 microlitros de lisado y 70 microlitros de tampón ChIP 1X frío con inhibidores de proteasas añadidos.Añada un microgramo de anticuerpos anti-IgG, anti-histona H3 o anti-HMGB1 a los tubos respectivos. Incube durante la noche en una cámara fría con rotación continua. En la cámara fría, después de resuspender las perlas de Proteína G, agregue cuatro microlitros de las perlas a cada tubo de reacción e incube en la cámara fría con rotación durante otras dos a cuatro horas.Coloque los tubos en un soporte magnético para sedimentar las perlas y retire el sobrenadante. Añada 200 microlitros de tampón ChIP 1X con una mezcla de inhibidores de proteasas a los sedimentos y lave en frío con rotación durante cinco minutos. A continuación, realice un lavado adicional con tampón ChIP 1X de alta salinidad.Luego, utilice 160 microlitros de tampón de elución para resuspender los pellet e incube a 37 grados Celsius con rotación durante 30 minutos. Pelote las perlas y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Añada seis microlitros de cloruro de sodio 5 molar y dos microlitros de proteinasa K, e incube durante la noche a 65 grados Celsius.Después de purificar el ADN, según el protocolo descrito en el texto, realice reacciones de PCR utilizando juegos de cebadores para la región o regiones de interés, y resuelva los productos en un gel de agarosa al 1 %, teñido con bromuro de etidio. Antes de usarlo, descongele en hielo el tampón de síntesis de reparación de ADN previamente preparado y añádale fosfocreatina a una concentración final de 40 milimolares y 2,5 microgramos de creatina fosfocinasa. Después de preparar el tampón de superenrollamiento 10X según el protocolo descrito en el texto, utilice una microlitro de topoisomerasa 1 de vaccinia junto con tampón de superenrollamiento 1X en una reacción de 10 microlitros para linearizar 300 nanogramos de plásmido superenrollado, PCA FG1.A los plásmidos relajados, agregue 25 microlitros de extracto de células HeLa recién descongelado y tampón para síntesis de ADN. Mezcle bien, luego agregue un microlitro de topoisomerasa 1 de vaccinia a la reacción e incube a 37 grados Celsius durante una hora. Detenga las reacciones añadiendo SDS al 1% y proteinasa K a 0,25 miligramos por mililitro, e incube a 65 grados Celsius durante dos horas.Después de verter un gel de agarosa al 1 % con tampón TPE 1X, añada colorante de carga de ADN a las reacciones y cargue las muestras directamente en el gel dejando al menos cuatro carriles de separación. Corra el gel durante ocho a diez horas a dos voltios por centímetro en TBE 1X durante la primera dimensión a temperatura ambiente para separar los topoisómeros. Prepare dos litros de TBE 1X con tres microgramos por mililitro de fosfato de cloroquina.Sumerja el gel en 200 mililitros de la solución, cubierto con papel de aluminio durante 20 minutos. Para realizar la electroforesis del gel en la segunda dimensión, gire el gel 90 grados en sentido horario y corra durante cuatro a seis horas a dos voltios por centímetro en cloroquina que contiene TBE 1X para separar las superespirales positivas y negativas. La cantidad de cloroquina en el tampón de electroforesis y en el gel es muy crítica, así como también es fundamental ejecutar el gel a un voltaje muy bajo en la segunda dimensión para separar las superespirales positivas y negativas.Después de teñir y desteñir el gel, según el protocolo descrito, utilice un sistema de imagen para visualizar la distribución térmica de los topoisómeros. Como se observa en este gel, aproximadamente el 79 % de los plásmidos que portan ICL dirigidas por TFO migran con una movilidad más lenta a través de la matriz de agarosa en comparación con los plásmidos de control sin entrecruzamiento. Los ensayos de ChIP realizados en lisados de células humanas U2OS transfectadas con plásmidos de control o con plásmidos que contienen ICL dirigidas por TFO muestran un enriquecimiento de HMGB1 en la región P-ICL en comparación con la región de control, cuando se inmunoprecipitan con anticuerpo anti-HMGB1.Cuando se agotó HMGB1 en las células mediante tratamiento con siRNA, se redujo el enriquecimiento específico de P-ICL. Cuando se realizó inmunoprecipitación de las mismas muestras utilizando un anticuerpo anti-IgG, se detectó una amplificación por PCR mínima. Finalmente, en esta figura, la electroforesis en gel de agarosa bidimensional demuestra la modificación arquitectónica de los plásmidos que contienen ICL dirigidos por TFO mediante superenrollamiento negativo por HMGB1 en extractos de células HeLa.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cinco días, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar que todos los lavados deben hacerse en cámara fría, ya que los lavados a temperatura ambiente pueden aumentar la señal de fondo. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el agotamiento de proteínas mediado por siRNA, seguido de ensayos de cribado de mutaciones, con el fin de responder preguntas como: ¿está la proteína de interés implicada en la reparación del ADN?O, ¿altera significativamente los espectros de mutación durante el proceso? Esta técnica allanó el camino para estudiar la asociación entre proteínas y daños específicos en el ADN. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo estudiar la asociación de proteínas estructurales con enlaces cruzados específicos en el ADN y, posteriormente, determinar el efecto de dicha asociación sobre la topología del ADN.No olvide que trabajar con bromuro de etidio puede ser extremadamente peligroso, y por lo tanto, siempre se debe usar equipo de protección adecuado al realizar este experimento.

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

Aquí, presentamos un protocolo simple y rápido para la detección de la interacción de proteínas en sitios de daño en el ADN.

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

Este protocolo demuestra la realización de un ensayo de una sola molécula para la visualización en vivo del desenrollado del ADN por helicasa CMG. Describe (1) la preparación de un sustrato de ADN, (2) la purificación de la helicasa CMG de Drosophila melanogaster marcada con fluorescencia, (3) la preparación de una celda de flujo microfluídica para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y (4) el ensayo de desenrollado de ADN de una sola molécula.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Presentamos un método rápido y eficiente para detectar roturas comunes de sitios frágiles a través de la inmunoprecipitación de cromatina nativa γH2A.X (ChIP). Este enfoque reduce significativamente tanto el tiempo como la mano de obra asociados con los ensayos ChIP γH2A.X tradicionales, al tiempo que mantiene una alta reproducibilidad y confiabilidad de los resultados.

Captura de roturas de sitios frágiles comunes mediante γH2A nativo. X ChIP

Aprende a estudiar la asociación de proteínas arquitectónicas como HMGB1 con daño específico de ADN en células humanas mediante inmunoprecipitación de cromatina modificada y ensayos de superenrollamiento de ADN. Este método permite identificar nuevas dianas farmacológicas para terapia contra el cáncer.

Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados (Video) | JoVE Journal

Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

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