Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

El objetivo general de los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina modificada y superenrollamiento del ADN es estudiar la asociación y las modificaciones topológicas posteriores inducidas por las proteínas arquitectónicas en el daño del ADN específico del sitio inducido por agentes quimioterapéuticos o cancerígenos en células humanas. Esta metodología nos permitirá abordar cuestiones clave sobre el daño y la reparación del ADN, lo que debería facilitar el descubrimiento de nuevas dianas farmacológicas para la terapia del cáncer. Nuestra tecnología nos permite dirigir el daño del ADN en un sitio específico y facilita la evaluación de los procesos críticos de reparación del ADN relevantes para el cáncer humano.

Para empezar, 24 horas antes de la transfección, colocar 400.000 células de mamíferos por placa de 60 milímetros en DMEM suplementado con un 10% de FBS sin antibióticos. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante la noche. En un tubo de fondo redondo de 14 mililitros, combine 30 microlitros de agente transfectivo a temperatura ambiente con 500 microlitros de medio de crecimiento 1X que se haya calentado a 37 grados Celsius.

En un segundo tubo, combine dos microgramos de plásmidos que contienen ICL dirigidos por TFO en 500 microlitros de medio de crecimiento 1X. Incuba los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Combine la mezcla uno con la mezcla dos y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.

Luego incube la solución a temperatura ambiente durante 25 a 30 minutos. A continuación, use PBS tibio para lavar las celdas dos veces. A continuación, añada la mezcla de transfección gota a gota, distribuyendo la solución de manera uniforme por toda la placa de células.

Agregue un mililitro de medio de crecimiento al plato y lleve el volumen final a dos mililitros. Mezcle bien y coloque las placas de cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cuatro horas más tarde, reemplace el medio con tres mililitros de medio de crecimiento con 10% de FBS e incube 16 horas adicionales.

Después de la incubación, agregue 80 microlitros de formaldehído fresco al 37% por placa a las células e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. Apague la reticulación de formaldehído agregando 300 microlitros de glicina fría por placa e incube durante cinco minutos. Luego retire el medio y use PBS frío para lavar las placas dos veces.

A continuación, después de agregar un milímetro de PBS refrigerado, recoja las células raspándolas en un tubo de microcentrífuga sobre hielo, manteniendo las muestras en hielo en todo momento. Prepare los gránulos de celda centrifugando a 13, 400 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Luego, retire el sobrenadante y coloque los gránulos en hielo.

Utilice un mililitro de tampón A refrigerado para volver a suspender los pellets de forma homogénea e incubar en hielo durante 10 minutos. Luego, granule las células como antes. Ahora, con un mililitro de tampón B refrigerado, vuelva a suspender homogéneamente los pellets e incube en hielo durante 10 minutos con una mezcla ocasional por inversión.

A continuación, granule las células como antes. Después de volver a suspender las células, en 200 microlitros de tampón B refrigerado, agregue dos microlitros de nucleasa microcócica, o MNasa, e incube la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, detenga la reacción de MNasa colocando los tubos en hielo y agregando 40 milimolares de EDTA.

El nivel de digestión por la nucleasa microcócica es muy crítico, ya que la sobredigestión puede causar pérdida de señal, mientras que la infradigestión puede causar una gran cantidad de antecedentes inespecíficos. Después de peletizar las células, vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de inmunoprecipitación de cromatina, o tampón ChIP, suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasa. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de pared delgada.

Sonicar las muestras haciéndolas flotar en un sonicador de baño de agua durante 20 segundos, seguidos de 20 segundos en hielo. Repita los pasos de sonicación nueve veces para generar aproximadamente entre 800 y 1.200 fragmentos de pares de bases. A los 20 microlitros de las muestras sonicadas, se añadan tres microlitros de cloruro sódico cinco molares y un microlitro de RNasa A.Vortex los tubos, e incubarlos a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, se añaden dos microlitros de proteinasa K, y se incuba a 65 grados centígrados durante dos horas. Después de purificar las muestras, de acuerdo con el protocolo de texto, ejecútelas en gel de agarosa al 1% y visualícelas con bromuro de etidio. En tres tubos siliconados preenfriados separados, agregue 30 microlitros de lisado y 70 microlitros de tampón ChIP 1X refrigerado con inhibidores de proteasa agregados.

Añada un microgramo de anticuerpos anti-IgG, antihistona H3 o anti-HMGB1 a los tubos respectivos. Incubar durante la noche en una cámara frigorífica con rotación continua. En la cámara frigorífica, después de volver a suspender las perlas de proteína G, agregue cuatro microlitros de las perlas a cada tubo de reacción e incube en una cámara frigorífica con rotación durante otras dos a cuatro horas.

Coloque los tubos en una rejilla magnética para pellets las cuentas y retire el sobrenadante. Añadir 200 microlitros de tampón ChIP 1X con cóctel de inhibidores de proteasa a los pellets y lavar en frío con rotación durante cinco minutos. A continuación, con tampón ChIP 1X con alto contenido de sal, realice un lavado adicional.

A continuación, utilice 160 microlitros de tampón de elución para volver a suspender los pellets e incube a 37 grados centígrados con rotación durante 30 minutos. Granule las cuentas y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Agregue seis microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y dos microlitros de proteinasa K, e incube durante la noche a 65 grados centígrados.

Después de purificar el ADN, de acuerdo con el protocolo de texto, realice reacciones de PCR utilizando conjuntos de cebadores a la región o regiones de interés, y resuelva los productos en un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio. Antes de usar, descongele el tampón de síntesis de reparación del ADN previamente preparado en hielo y agregue 40 milimolares de fosfocreatina y 2,5 microgramos de creatina fosfoquinasa. Después de preparar el tampón de superenrollado 10X, de acuerdo con el protocolo de texto, use un microlitro de vaccinia topoisomerasa 1 con tampón de superenrollado 1X en una reacción de 10 microlitros para linealizar 300 nanogramos de plásmido superenrollado, PCA FG1.

A los plásmidos relajados, agregue 25 microlitros de extracto de células HeLa recién descongeladas y tampón de síntesis de ADN. Mezclar bien, luego agregar un microlitro de vaccinia topoisomerasa 1 a la reacción e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. Finalice las reacciones añadiendo 1% de SDS y 0,25 miligramos por mililitro de proteinasa K, e incube a 65 grados centígrados durante dos horas.

Después de fundir un gel de agarosa al 1% con tampón TPE 1X, agregue un tinte de carga de ADN a las reacciones y cargue las muestras directamente en el gel al menos a cuatro carriles de distancia. Haga funcionar el gel durante ocho a 10 horas a dos voltios por centímetro en 1X TBE para la primera dimensión a temperatura ambiente para resolver los topoisómeros. Prepare dos litros de 1X TBE con tres microgramos por mililitro de fosfato de cloroquina.

Remoja el gel en 200 mililitros de la solución, cubierto con papel de aluminio durante 20 minutos. Para electroforezar el gel en la segunda dimensión, gire el gel 90 grados en el sentido de las agujas del reloj y hágalo funcionar durante cuatro a seis horas a dos voltios por centímetro en cloroquina que contiene 1X TBE para resolver las superbobinas positivas y negativas. La cantidad de cloroquina en el tampón de electroforesis, y en el gel, es muy crítica, así como hacer funcionar el gel a un voltaje muy bajo para la segunda dimensión es muy crítico para separar las superbobinas positivas y negativas.

Después de teñir y decolorar el gel, de acuerdo con el protocolo de texto, use un generador de imágenes para visualizar la termodistribución de los topoisómeros. Como se observa en este gel, aproximadamente el 79% de los plásmidos que albergan ICL dirigidas por TFO migran con una movilidad más lenta a través de la matriz de gel de agarosa en comparación con los plásmidos de control no reticulados. Los ensayos ChIP realizados en lisados de células U2OS humanas transfectadas con plásmido de control o plásmidos que contienen ICL dirigidas por TFO muestran un enriquecimiento de HMGB1 en la región P-ICL en comparación con la región de control cuando se inmunoprecipitan con anticuerpos anti-HMGB1.

Cuando HMGB1 se agotó de las células a través del tratamiento con siRNA, el enriquecimiento específico de P-ICL disminuyó. Cuando las mismas muestras se inmunoprecipitaron utilizando un anticuerpo anti-IgG, se detectó una amplificación mínima por PCR. Finalmente, en esta figura, la electroforesis bidimensional en gel de agarosa demuestra la modificación arquitectónica de los plásmidos que contienen ICL dirigidos por TFO como superenrollamiento negativo por HMGB1 en extractos de células HeLa.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cinco días, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar que todos los lavados deben realizarse en la habitación fría, ya que los lavados a temperatura ambiente pueden aumentar la señal de fondo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la depleción de proteínas mediada por siRNA, seguida de ensayos de detección de mutaciones, para responder preguntas como: ¿la proteína de interés está involucrada en la reparación del ADN?

¿O altera significativamente los espectros de mutación durante el proceso? Esta técnica allanó el camino para estudiar la asociación entre las proteínas y el daño en el ADN específico del sitio. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo estudiar la asociación de proteínas arquitectónicas para dirigirse a enlaces cruzados de ADN y, posteriormente, determinar el efecto de dicha asociación en la topología del ADN.

No olvide que trabajar con bromuro de etidio puede ser extremadamente peligroso y, por lo tanto, siempre se debe usar el equipo de protección adecuado durante la realización de este experimento.