La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

El objetivo general del CARA es proporcionar una evaluación semicuantitativa de rendimiento medio de la actividad de los compuestos frente a micobacterias replicantes y no replicantes. La principal ventaja de esta técnica es que, como sustituto de la UFC, el CARA permite probar rápidamente la dependencia de la dosis y el tiempo de un compuesto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos para la tuberculosis, como determinar si un compuesto es bacteriostático o bactericida contra las bacterias replicantes y si es bactericida contra las bacterias no replicantes.

La demostración del método estará a cargo de Julia Roberts, asociada de nuestro laboratorio. Agregue 450 mililitros de agua a un vaso de vidrio de un litro o 900 mililitros de agua a un matraz Erlenmeyer de dos litros. Incluya una barra agitadora esterilizable en autoclave en el vaso de precipitados o matraz.

A continuación, agregue un polvo Middlebrook 7H11, carbón activado hasta una concentración final del 0,4 % y una solución de glicerol al 50 % para lograr una concentración final del 0,2 %. Cubra la abertura del matraz o vaso de precipitados con papel de aluminio y fíjelo al vidrio con cinta adhesiva para autoclave. Después de esterilizar el medio en autoclave, enfríelo a aproximadamente 55 a 65 grados centígrados en una placa de agitación magnética configurada a baja velocidad para mantener el carbón en suspensión.

Mientras trabaja asépticamente en una campana de bioseguridad que tenga una placa de agitación magnética, retire el papel de aluminio del medio y agregue 100 o 50 mililitros de suplemento OADC al matraz de dos litros o al vaso de precipitados de un litro respectivamente y continúe mezclando. Utilizando una pipeta multicanal con ocho o 12 puntas de filtro, llene una microplaca de 96 pocillos con 200 pocillos de 200 microlitros de carbón 7H11-OADC desde el depósito de reactivo o vaso de precipitados, trabajando rápidamente para evitar la solidificación del agar y la formación de burbujas. Coloque pilas de microplacas CARA en bolsas de plástico resellables para evitar que se sequen y guárdelas a cuatro grados centígrados.

Inocular tubos de centrífuga de polipropileno de fondo redondo o cónicos que contengan cuatro o 20 mililitros, respectivamente, de Middlebrook 7H9-ADN o 7H9-OADC con M. smegmatis a un OD580 de 0,01 a 0,1. Incubar los cultivos de M. smegmatis a 37 grados Celsius y 20%O2 con agitación, expandiendo los cultivos a la fase mitad del logaritmo o a una OD580 aproximada de 0.5. Para establecer un experimento de estilo de concentración inhibitoria mínima en condiciones de replicación y no replicación, distribuya 200 microlitros de células en 7H9-ADN a un OD580 de 0.01 en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido de fondo claro.

Para el ensayo no replicante, use PBS que contenga 0.02% de tyloxapol para lavar las células dos veces. Y use un medio no replicante para volver a suspender las células. Utilice un medio no replicante para diluir las células hasta una OD580 de 0,1 y añadir nitrato de sodio hasta una concentración final de 0,5 a 5 milimolares a partir de un caldo molar recién preparado.

Distribuya 200 microlitros de células a un OD580 de 0,1 en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos de fondo claro. Después de preparar los agentes de prueba de acuerdo con el protocolo de texto, agregue dos microlitros de agente de prueba uno en las filas de la A a la E y dos microlitros de agente de prueba dos en las filas E a H, y mezcle bien. Para replicar los ensayos, incube las microplacas de M. smegmatis a 37 grados Celsius, 20% de O2 y 5% de CO2 durante una a 48 horas.

En los puntos de tiempo en los que se utilizará el CARA como lectura, utilice una pipeta multicanal p200 configurada de 50 a 75 microlitros para volver a suspender cuidadosamente el contenido del pocillo de la placa de ensayo estilo MIC90 pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces. A continuación, utilice las puntas de pipeta para agitar suavemente el contenido de los pocillos con movimientos circulares. Transfiera 10 microlitros del contenido del pocillo de ensayo sin diluir a los pocillos correspondientes de la microplaca CARA evitando salpicaduras durante las transferencias, asegurándose de que la alícuota de 10 microlitros se vea en el centro de los pocillos de la microplaca CARA.

Con cinta adhesiva para placas, ate pilas de microplacas CARA y luego colóquelas en una bolsa de plástico con cierre. Incubar las microplacas CARA de M. smegmatis a 37 grados Celsius con 20%O2 durante uno o dos días para placas replicantes y durante dos o tres días para placas no replicantes. Cuando se vea una película de crecimiento bacteriano o colonias macroscópicas más grandes en los pocillos de control negativo, utilice un solo juego de 12 puntas p200 con una pipeta multicanal para dispensar 40 microlitros de PBS estéril a lo largo del costado de los pocillos y permitir que el PBS se distribuya por la parte superior de las microcolonias de agar/bacterias.

Prepare el reactivo revelador CARA mezclando cinco miligramos de resazurina y 50 mililitros de 5%Tween80 en PBS. Agregue 50 microlitros de reactivo revelador CARA recién preparado a cada pocillo de la microplaca CARA. A continuación, mueva las placas hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces para ayudar a distribuir el reactivo por el agar y la estera bacteriana de cada pocillo.

Coloque las placas en una bolsa de plástico con cierre hermético e incube a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos para M. smegmatis. Antes de leer la fluorescencia, coloque las microplacas CARA en una campana de bioseguridad durante 15 minutos a temperatura ambiente con las tapas quitadas. Cuando utilice espectrofotómetros BSL3 fuera de una cabina de bioseguridad, adhiera una pegatina de PCR de calidad óptica sobre la placa y utilice una toalla de papel suave para sellar herméticamente presionando suavemente la superficie de la pegatina.

Determine la fluorescencia a través de la lectura superior con excitación a 530 nanómetros y emisión a 590 nanómetros. No es necesario dejar la placa en blanco. Para analizar los datos, trace la concentración del inhibidor en el eje X como una escala log10 y la fluorescencia en el eje Y en una escala lineal.

Consulte el protocolo de texto para obtener detalles adicionales. La concentración del agente de prueba que da lugar a que la fluorescencia de CARA no se eleve por encima de los niveles de fondo es el CARA-MBC mayor que igual a 99, que se muestra aquí. El subíndice mayor que igual a 99 indica que el CARA-MBC proporciona una concentración estimada del agente de prueba, lo que da lugar a una muerte bacteriana mayor que igual a dos log10.

Se sospecha que los compuestos ejercen un efecto post-antibiótico si muestran una ventana estática, definida como un desplazamiento de más de cuatro veces a la derecha entre las curvas MIC y CARA. La ventana estática indica que una molécula activa contra la replicación de M. tuberculosis puede ser bacteriostática en lugar de bactericida. En el caso de las moléculas con un potente efecto postantibiótico, las ventanas estáticas pueden ser difíciles de observar y sólo son evidentes después de la inspección de un eje Y expandido para la fluorescencia de CARA, como se ve aquí.

Aquí se muestran las moléculas activas replicantes y no replicantes probadas por MIC90 y CARA. Mientras que la isoniazida y el linezolid parecen tener actividad contra bacterias no replicantes según el ensayo MIC90, el CARA sugiere que están inactivos en las condiciones no replicantes probadas. En este experimento CARA, la exposición de M. smegmatis a concentraciones crecientes de rifampicina reveló un impacto en tan solo una hora y mostró un aumento de la actividad bactericida entre tres y 24 horas, matando más de dos a tres log10 a aproximadamente 10 microgramos por mililitro en 24 horas.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos horas para preparar placas, menos de una hora para transferir células a placas CARA y aproximadamente una o dos horas para desarrollar y medir la fluorescencia de las placas CARA si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar el CARA como un ensayo predictivo para determinar si un compuesto tiene actividad bactericida o bacteriostática contra micobacterias que se replican o no se replican. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar un CARA y analizar datos de una manera que ayude a predecir el tipo de actividad de un compuesto.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.