Name: Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende a combinar optogenética con citometría de flujo para estudiar señalización celular en tiempo real. Este método permite caracterizar herramientas optogenéticas usando linfocitos B Ramos y análisis de fluorescencia.

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Agradecemos a J. Schmidt de la Universidad de Friburgo por construir el dispositivo. Agradecemos a P. Nielsen y D. Medgyesi por su apoyo y lectura crítica de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través de SFB746 y por la Iniciativa de Excelencia de la Fundación Alemana de Investigación (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. El diseño y la construcción del artificio <ol><li> Los experimentos piloto NOTA: La intensidad de la luz requerida para un tipo de herramienta y células optogenético específico puede variar significativamente. Los experimentos piloto con prototipos son útiles para estimar la intensidad de luz mínima necesaria. La herramienta optogenético utilizado para los siguientes experimentos es una construcción de fusión Dronpa-Enlazador Dronpa. Se obtuvo la secuencia comercialmente Dronpa (Ver Lista de Materiales). A largo enlazador se clonó en entre dos secuencias Dronpa para permitir que el constructo expresado para formar dímeros intramoleculares (e intermoleculares). Los pasos descritos a continuación se pueden adaptar a muchas otras herramientas optogenética o sustancias ópticamente controladas. <ol><li> Transducir los linfocitos B Ramos con un constructo que contiene Dronpa-Enlazador Dronpa siguiendo las instrucciones del fabricante para la transducción utilizando el sobrenadante que contiene retroviral de células de empaquetamiento. Cosecha y celdas de conteo de acuerdo con un prepublicada riormente protocolo 13. </li><li> Resuspender las células a una concentración de 1 x 10 6 / ml en medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) y transferirlos a un tubo de FACS de vidrio. </li><li> Insertar el tubo en un citómetro de flujo y medir la intensidad de fluorescencia de Dronpa (canal GFP) 14,15. </li><li> Utilice gafas de protección para todas las medidas adicionales para proteger los ojos de longitudes de onda posiblemente perjudiciales. </li><li> colocar manualmente una luz LED 500 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. </li><li> Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que la intensidad de fluorescencia Dronpa disminuye. </li><li> colocar manualmente una luz LED 400 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. </li><li> Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que el fluo Dronpacencia aumenta la intensidad. </li><li> Utilice al menos tantas luces LED para la construcción del dispositivo como se prevé que sea necesario desde el photoswitching en los pasos 1.1.5 y 1.1.7. </li></ol></li><li> La construcción del dispositivo NOTA: El dispositivo fue construido por un taller de mecanizado profesional, el Arbeitsgruppe Technik de la Universidad de Friburgo. La mayoría de las piezas son hechas a medida y no está disponible comercialmente. Las dimensiones exactas de cada parte se representan en las figuras 1 y 2. Para aclarar el montaje de este dispositivo, complementaria de vídeo 1 se proporciona y los pasos más esenciales se describe a continuación. <ol><li> Molino pieza A partir de cloruro de polivinilo (PVC) con las medidas exactas que se muestran en la Figura 1A. </li><li> Inserte las luces LED en los agujeros perforados de pieza A y cerrar cada agujero con pegamento para PVC para evitar fugas de agua. </li><li> Conectar los LED a un transformador multicanal (cada longitud de onda debe ocupar un chann separadael) con una potencia de salida ajustable de 0-29 mA. </li><li> Coloque la cubierta exterior (B) con 3 tornillos a la pieza A como se representa para proteger el LED contra daño físico. </li><li> Para poder conectar el dispositivo a una bomba de agua, pegamento en los clips de tubo (C) en los agujeros perforados de pieza A (representada en la figura 1a, la sección transversal Y: 9 mm y 61,5 mm) con pegamento de PVC. </li><li> Cortar un largo tubo de plexiglás 58,5 mm (D1). </li><li> Fabricación piezas D2 y D3 de Plexiglas como se representa en la Figura 2. </li><li> piece pegamento D3 de la parte inferior de D1 con Plexiglas pegamento. </li><li> Adjuntar una junta tórica de caucho a la pieza D2 y péguelo en la parte superior de D1 con plexiglás pegamento. NOTA: Las piezas D1, D2 y D3 juntos forman pieza D. </li><li> Insertar pieza D en la pieza A con 3 tornillos. </li><li> Pruebe el dispositivo para la salida del agua antes de suministrar energía al transformador. </li></ol></li></ol> 2. Medición de la cinética de una herramienta Optogenética <ol&gt; <li> preparar las células <ol><li> Cultura células Ramos B en RPMI-medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) a una densidad de 3- 10 x 10 6 células / ml a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Cosecha Ramos B células por centrifugación a 350 xg y 4 ° C durante 5 min. </li><li> Recuento de células utilizando una cámara de recuento Neubauer siguientes instrucciones del fabricante y resuspender 1-5 x 10 6 células en 600 l de medio. </li><li> Transferir las células a un tubo de vidrio de FACS, ponerlos en hielo y protegerlos de la luz hasta la medición. </li></ol></li><li> Preparar el citómetro de flujo y el dispositivo. <ol><li> Conectar el dispositivo a una bomba de agua caliente y ajustar la temperatura a 37 ° C. </li><li> Cuando se utilizan tubos de FACS vidrio, intercambiar el negro junta tórica del citómetro de flujo con una junta tórica de caucho y, además, aplicar gr de siliciofacilitar. </li></ol></li><li> Medición <ol><li> Introduzca con cuidado el tubo de FACS de vidrio en el dispositivo y conectarlo con el citómetro de flujo (Figura 3). </li><li> Iniciar la medición y registrar Dronpa intensidad fluorescente (GFP canal). </li><li> Iluminar la muestra de células con 400 nm o 500 nm de luz, respectivamente, y registrar la intensidad de fluorescencia Dronpa (canal GFP). </li></ol></li><li> Análisis de los datos <ol><li> Analizar los datos experimentales con flujo adecuado citómetro de software. Gráfico de dispersión hacia adelante contra la dispersión lateral y la puerta de las células vivas. Trazar la intensidad de fluorescencia Dronpa lo largo del tiempo. </li></ol></li></ol>

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<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
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<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El flujo de Thermo LED es un dispositivo innovador para estudiar herramientas optogenética en un citómetro de flujo. Hasta el momento, las muestras han sido optogenética sólo iluminada con rayos láser o dispositivos de microscopía linterna 11,12. Dependiendo del ángulo y la distancia de la linterna a la muestra, se espera que la variabilidad sustancial en la cantidad de iluminación entre los experimentos. Además, hay un límite en el número de linternas una sola persona puede opera...

Herramientas Optogenética han ido ganando popularidad, en parte debido a que se pueden utilizar para descifrar el cableado de las vías de señalización de 1-4. Se basan en la capacidad de las proteínas fotoactivables para cambiar su conformación y de unión por afinidad cuando se ilumina con la luz. La fusión de estas proteínas a los elementos de señalización permite la regulación específica de un solo jugador dentro de complejas vías de señalización intracelular 5-12. Por consiguiente, una vía de señalización puede ser estudiado con alta resolución temporal y espacial. La mayoría de los estudios optogenética basados en células utilizan métodos basados en la microscopía combinado con el cultivo en presencia de luz, seguido de análisis bioquímico 11,12. Por el contrario, un flujo singulariza citómetro de células a lo largo de un capilar y mide el tamaño celular, la granularidad y la intensidad de fluorescencia. Este método tiene ventajas importantes sobre microscopía o bioquímicos métodos, incluyendo la capacidad de analizar thousands de células a una resolución de una sola célula de vivir en un tiempo muy corto. Por lo tanto, es deseable combinar optogenética con citometría de flujo. Hasta donde sabemos, no existe un protocolo establecido para citometría de flujo optogenético. Un procedimiento ampliamente aceptado es iluminar manualmente las células desde el exterior del tubo de reacción con dispositivos de linterna. Sin embargo, la iluminación en el manual de flujo requiere citómetro de que la luz pase a través del tubo de reacción y, por imágenes de células vivas, una forma cilíndrica, cámara de agua caliente. Esto hace que la dispersión de luz y sustancial pérdida de luz. Por otra parte, la intensidad de la luz proporcionada por la iluminación manual no es reproducible entre experimentos (ángulo, distancia, etc.) y hay un límite práctico para el número de longitudes de onda en un experimento. Mediante la construcción del dispositivo de flujo Thermo LED, hemos sido capaces de superar estas limitaciones. Con este dispositivo, las células pueden ser iluminadas con longitudes de onda específicas en un tempratura controlada de forma durante las mediciones de citometría de flujo. Esto permite que las cantidades precisas y reproducibles de la luz dentro y entre los experimentos. Para demostrar la utilidad de nuestro dispositivo in vivo, se registró la señal de fluorescencia de Dronpa en las células B Ramos durante photoswitching. células Ramos B se derivan de un linfoma de Burkitt humano. Dronpa es una proteína fluorescente que existe como un monómero, dímero o tetrámero. En su forma monomérica, es no fluorescente. Iluminación con luz de 400 nm induce la dimerización y tetramerización y hace que la proteína fluorescente Dronpa. Este proceso puede ser revertido por iluminación con luz de 500 nm. La proteína Dronpa se ha utilizado para controlar la función y la ubicación de las proteínas de señalización de 4,13. Aquí, hemos expresado una proteína Dronpa engarce-Dronpa en las células B Ramos para estudiar photoswitching de Dronpa en un citómetro de flujo. El uso de nuestro dispositivo, hemos sido capaces de manera eficiente yreproducible PHOTOSWITCH Dronpa durante la grabación de su intensidad de fluorescencia en tiempo real. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre los protocolos actuales de iluminación con la iluminación manual y amplía considerablemente el repertorio experimental para herramientas optogenética y compuestos jaula. El uso de nuestro dispositivo simplificará significativamente y acelerar el descubrimiento y desarrollo de nuevas herramientas optogenética.

<table><tbody><tr><td>Tubo de vidrio FACS</td><td>Thermo Fisher Scientific; Waltham, EE. UU.</td><td>14-961-26</td><td>Tubos de vidrio de borosilicato 12x75 mm</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Bioscienceg; Heidelberg, Alemania</td><td>Fortessa II</td><td>Orden Especial</td></tr><tr><td>Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N Addgene</td><td>; Cambridge, EE. UU.</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, EE. UU.</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Alemania</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Alemania</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plexiglás 15 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglás 3 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglás 2,5 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglás</td><td>Maertin de 1,5 mm; Friburgo, Alemania</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>baldosa de PVC 5 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>Baldosa de PVC 6 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de PVC 50 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>EMD; Alemania</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech; Aidenbach, Alemania</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Esttomicina (10.000 U/mL)</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de plexiglás Acrifix</td><td>Evonic industries, Essen, Alemania</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento Tangit PVC-U</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

thermo led flujo - combinando optogenética con citometría de flujo

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Las herramientas optogenéticas permiten investigaciones aisladas y funcionales de casi cualquier molécula de señalización dentro de vías de señalización complejas. Un obstáculo importante es la entrega controlada de luz a la muestra celular y, por lo tanto, las herramientas más populares para los estudios optogenéticos son los análisis celulares basados en microscopía y los experimentos in vitro. El citómetro de flujo tiene grandes ventajas sobre un microscopio, incluida la capacidad de medir rápidamente miles de células con una resolución de una sola célula. Sin embargo, aún no se utiliza ampliamente en optogenética. Aquí, presentamos un dispositivo que combina el poder de la optogenética y la citometría de flujo: el LED Thermo Flow. Este dispositivo ilumina las células a longitudes de onda, intensidades de luz y temperaturas específicas durante las mediciones de citometría de flujo. Se puede construir a bajo costo y se puede utilizar con los citómetros de flujo más comunes. Para demostrar su utilidad, caracterizamos la cinética de fotoconmutación de proteínas Dronpa in vivo y en tiempo real. Este protocolo se puede adaptar a casi todas las sustancias ópticamente controladas y amplía sustancialmente el conjunto de posibles experimentos. Y lo que es más importante, simplificará en gran medida el descubrimiento y el desarrollo de nuevas herramientas optogenéticas.

Utilizando el flujo de Thermo LED con un citómetro de flujo El núcleo funcional del dispositivo es una cámara cilíndrica en la que las luces LED están dispuestos en una forma circular que apunta hacia el interior. Esta cámara se puede conectar a un suministro de agua y la bomba, lo que permite controlar la temperatura de los LED, así como la muestra de células. Los LED están conectados a un transformador y, por tanto, la intensi...

Las sustancias controladas ópticamente son herramientas poderosas para estudiar las vías de señalización. Para ampliar el espectro de posibles experimentos, desarrollamos un dispositivo para estudiar sustancias controladas ópticamente en tiempo real mediante citometría de flujo: el LED Thermo Flow.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

El objetivo general de este método es estimular sustancias controladas ópticamente durante las mediciones de citometría de flujo. Este novedoso dispositivo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización celular al combinar el poder de las sustancias controladas ópticamente con la citometría de flujo. Por primera vez, las herramientas optogenéticas pueden caracterizarse y analizarse mediante citometría de flujo.Hasta el día de hoy no existía un método establecido comparable. Para empezar, suspenda los linfocitos Ramos B transducidos a una concentración de un millón de células por mililitro y transfiéralos a un tubo FACS de vidrio. A continuación, cambie la junta tórica negra del citómetro de flujo por una junta tórica de goma y aplique grasa de silicona para crear un mejor sellado.Inserte el tubo de vidrio en un citómetro de flujo y coloque el prototipo de LED alrededor del tubo con las luces apagadas. Mida la intensidad de fluorescencia de Dronpa en el canal GFP. El paso más crítico del procedimiento es la manipulación de los tubos de vidrio.Los tubos FACS de vidrio son muy frágiles y, por lo tanto, se recomienda practicar la inserción de los tubos de vidrio en el citómetro antes de realizar experimentos. Luego, encienda la luz LED de 500 nanómetros en el exterior del tubo y continúe midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. Aumente la intensidad de las luces LED hasta que la intensidad de fluorescencia de Dronpa disminuya, con el fin de estimar la intensidad de luz mínima necesaria, con el fin de medir la fotoconmutación de la proteína Dronpa-Linker-Dronpa.A continuación, encienda la luz LED de 400 nanómetros del prototipo en el exterior del tubo y continúe midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. Aumente la intensidad de la luz de las luces LED de 400 nanómetros hasta que aumente la intensidad de fluorescencia de Dronpa. Comience siguiendo las instrucciones de diseño y fabricación en el protocolo de texto adjunto para fabricar las capas internas y externas del dispositivo LED de fotoconmutación.Inserte los LED de longitud de onda de 400 y 500 nanómetros en los canales del dispositivo. Péguelos en su lugar y átelos como se indica. Estas longitudes de onda específicas se utilizarán para cambiar las proteínas de fusión Dronpa-Linker-Dronpa entre sus estados oscuro y brillante.Luego, ensamble el dispositivo y asegúrese de que sea hermético para evitar fugas antes de encender el transformador. Después del ensamblaje del dispositivo, recoja los linfocitos Ramos B y suspenda en una densidad de tres a diez millones de células por mililitro. Transfiera 600 microlitros de las células a un tubo FACS de vidrio.Colócalas en hielo y protege las células de la luz hasta que se midan. Conecte el dispositivo ensamblado a una bomba de agua caliente y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Luego, inserte con cuidado el tubo FACS de vidrio en el dispositivo y conéctelo al citómetro de flujo.Registre la intensidad fluorescente de Dronpa en el canal GFP. El diseño de estos dispositivos optogenéticos incluye una cámara que se puede conectar a un suministro de agua circulante para mantener la temperatura de la muestra en un valor constante. Si bien el dispositivo emitió tres longitudes de onda diferentes, solo se observó un aumento marginal de la temperatura en la muestra de FACS, cuando fluyó agua a 37 grados centígrados a través del dispositivo.La construcción de fusión Dronpa-Linker-Dronpa fue clonada y transducida a células B de Ramos. Cuando una fuente de luz de 500 nanómetros la dirige al estado de monómero, la intensidad de la emisión disminuye. Luego, una vez que la fuente de luz se cambia a la luz de 400 nanómetros, el monómero de Dronpa cambia rápidamente al estado de dímero y la intensidad aumenta rápidamente.Con este dispositivo, la proteína de fusión citosólica Dronpa-Linker-Dronpa pudo ser fotoconmutada varias veces. El cambio al estado oscuro se produce lentamente, mientras que el cambio al estado brillante se produce casi instantáneamente. La recuperación espontánea de la fluorescencia de Dronpa en la oscuridad muestra que la fotoconmutación eficiente a la forma brillante requiere una iluminación específica y solo ocurre lentamente de forma espontánea.El análisis cinético muestra que la velocidad de fotoconmutación es en general muy reproducible y que, incluso después de una larga incubación en la oscuridad, solo se recupera alrededor del diez por ciento de la fluorescencia sin fotoconmutación. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar cualquier análisis de citometría de flujo, incluidas las mediciones de flujo de calcio, para explorar la funcionalidad de la herramienta optogenética elegida. Después de su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la optogenética exploren el cableado de las vías de señalización celular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un protocolo de fotoconmutación para su herramienta optogenética específica. No olvide que la luz ultravioleta puede ser extremadamente peligrosa y siempre se deben usar medidas de precaución, como gafas protectoras, mientras se realiza este procedimiento.

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Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Aprende a combinar optogenética con citometría de flujo para estudiar señalización celular en tiempo real. Este método permite caracterizar herramientas optogenéticas usando linfocitos B Ramos y análisis de fluorescencia.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

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