Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

El objetivo general de este método es estimular sustancias controladas ópticamente durante las mediciones de citometría de flujo. Este novedoso dispositivo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización celular al combinar el poder de las sustancias controladas ópticamente con la citometría de flujo. Por primera vez, las herramientas optogenéticas pueden caracterizarse y analizarse mediante citometría de flujo.

Hasta el día de hoy no existía un método establecido comparable. Para empezar, suspenda los linfocitos Ramos B transducidos a una concentración de un millón de células por mililitro y transfiéralos a un tubo FACS de vidrio. A continuación, cambie la junta tórica negra del citómetro de flujo por una junta tórica de goma y aplique grasa de silicona para crear un mejor sellado.

Inserte el tubo de vidrio en un citómetro de flujo y coloque el prototipo de LED alrededor del tubo con las luces apagadas. Mida la intensidad de fluorescencia de Dronpa en el canal GFP. El paso más crítico del procedimiento es la manipulación de los tubos de vidrio.

Los tubos FACS de vidrio son muy frágiles y, por lo tanto, se recomienda practicar la inserción de los tubos de vidrio en el citómetro antes de realizar experimentos. Luego, encienda la luz LED de 500 nanómetros en el exterior del tubo y continúe midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. Aumente la intensidad de las luces LED hasta que la intensidad de fluorescencia de Dronpa disminuya, con el fin de estimar la intensidad de luz mínima necesaria, con el fin de medir la fotoconmutación de la proteína Dronpa-Linker-Dronpa.

A continuación, encienda la luz LED de 400 nanómetros del prototipo en el exterior del tubo y continúe midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. Aumente la intensidad de la luz de las luces LED de 400 nanómetros hasta que aumente la intensidad de fluorescencia de Dronpa. Comience siguiendo las instrucciones de diseño y fabricación en el protocolo de texto adjunto para fabricar las capas internas y externas del dispositivo LED de fotoconmutación.

Inserte los LED de longitud de onda de 400 y 500 nanómetros en los canales del dispositivo. Péguelos en su lugar y átelos como se indica. Estas longitudes de onda específicas se utilizarán para cambiar las proteínas de fusión Dronpa-Linker-Dronpa entre sus estados oscuro y brillante.

Luego, ensamble el dispositivo y asegúrese de que sea hermético para evitar fugas antes de encender el transformador. Después del ensamblaje del dispositivo, recoja los linfocitos Ramos B y suspenda en una densidad de tres a diez millones de células por mililitro. Transfiera 600 microlitros de las células a un tubo FACS de vidrio.

Colócalas en hielo y protege las células de la luz hasta que se midan. Conecte el dispositivo ensamblado a una bomba de agua caliente y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Luego, inserte con cuidado el tubo FACS de vidrio en el dispositivo y conéctelo al citómetro de flujo.

Registre la intensidad fluorescente de Dronpa en el canal GFP. El diseño de estos dispositivos optogenéticos incluye una cámara que se puede conectar a un suministro de agua circulante para mantener la temperatura de la muestra en un valor constante. Si bien el dispositivo emitió tres longitudes de onda diferentes, solo se observó un aumento marginal de la temperatura en la muestra de FACS, cuando fluyó agua a 37 grados centígrados a través del dispositivo.

La construcción de fusión Dronpa-Linker-Dronpa fue clonada y transducida a células B de Ramos. Cuando una fuente de luz de 500 nanómetros la dirige al estado de monómero, la intensidad de la emisión disminuye. Luego, una vez que la fuente de luz se cambia a la luz de 400 nanómetros, el monómero de Dronpa cambia rápidamente al estado de dímero y la intensidad aumenta rápidamente.

Con este dispositivo, la proteína de fusión citosólica Dronpa-Linker-Dronpa pudo ser fotoconmutada varias veces. El cambio al estado oscuro se produce lentamente, mientras que el cambio al estado brillante se produce casi instantáneamente. La recuperación espontánea de la fluorescencia de Dronpa en la oscuridad muestra que la fotoconmutación eficiente a la forma brillante requiere una iluminación específica y solo ocurre lentamente de forma espontánea.

El análisis cinético muestra que la velocidad de fotoconmutación es en general muy reproducible y que, incluso después de una larga incubación en la oscuridad, solo se recupera alrededor del diez por ciento de la fluorescencia sin fotoconmutación. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar cualquier análisis de citometría de flujo, incluidas las mediciones de flujo de calcio, para explorar la funcionalidad de la herramienta optogenética elegida. Después de su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la optogenética exploren el cableado de las vías de señalización celular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un protocolo de fotoconmutación para su herramienta optogenética específica. No olvide que la luz ultravioleta puede ser extremadamente peligrosa y siempre se deben usar medidas de precaución, como gafas protectoras, mientras se realiza este procedimiento.