Name: Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende a combinar optogenética con citometría de flujo para estudiar señalización celular en tiempo real. Este método permite caracterizar herramientas optogenéticas usando linfocitos B Ramos y análisis de fluorescencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a J. Schmidt de la Universidad de Friburgo por construir el dispositivo. Agradecemos a P. Nielsen y D. Medgyesi por su apoyo y lectura crítica de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través de SFB746 y por la Iniciativa de Excelencia de la Fundación Alemana de Investigación (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. El diseño y la construcción del artificio <ol><li> Los experimentos piloto NOTA: La intensidad de la luz requerida para un tipo de herramienta y células optogenético específico puede variar significativamente. Los experimentos piloto con prototipos son útiles para estimar la intensidad de luz mínima necesaria. La herramienta optogenético utilizado para los siguientes experimentos es una construcción de fusión Dronpa-Enlazador Dronpa. Se obtuvo la secuencia comercialmente Dronpa (Ver Lista de Materiales). A largo enlazador se clonó en entre dos secuencias Dronpa para permitir que el constructo expresado para formar dímeros intramoleculares (e intermoleculares). Los pasos descritos a continuación se pueden adaptar a muchas otras herramientas optogenética o sustancias ópticamente controladas. <ol><li> Transducir los linfocitos B Ramos con un constructo que contiene Dronpa-Enlazador Dronpa siguiendo las instrucciones del fabricante para la transducción utilizando el sobrenadante que contiene retroviral de células de empaquetamiento. Cosecha y celdas de conteo de acuerdo con un prepublicada riormente protocolo 13. </li><li> Resuspender las células a una concentración de 1 x 10 6 / ml en medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) y transferirlos a un tubo de FACS de vidrio. </li><li> Insertar el tubo en un citómetro de flujo y medir la intensidad de fluorescencia de Dronpa (canal GFP) 14,15. </li><li> Utilice gafas de protección para todas las medidas adicionales para proteger los ojos de longitudes de onda posiblemente perjudiciales. </li><li> colocar manualmente una luz LED 500 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. </li><li> Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que la intensidad de fluorescencia Dronpa disminuye. </li><li> colocar manualmente una luz LED 400 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa. </li><li> Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que el fluo Dronpacencia aumenta la intensidad. </li><li> Utilice al menos tantas luces LED para la construcción del dispositivo como se prevé que sea necesario desde el photoswitching en los pasos 1.1.5 y 1.1.7. </li></ol></li><li> La construcción del dispositivo NOTA: El dispositivo fue construido por un taller de mecanizado profesional, el Arbeitsgruppe Technik de la Universidad de Friburgo. La mayoría de las piezas son hechas a medida y no está disponible comercialmente. Las dimensiones exactas de cada parte se representan en las figuras 1 y 2. Para aclarar el montaje de este dispositivo, complementaria de vídeo 1 se proporciona y los pasos más esenciales se describe a continuación. <ol><li> Molino pieza A partir de cloruro de polivinilo (PVC) con las medidas exactas que se muestran en la Figura 1A. </li><li> Inserte las luces LED en los agujeros perforados de pieza A y cerrar cada agujero con pegamento para PVC para evitar fugas de agua. </li><li> Conectar los LED a un transformador multicanal (cada longitud de onda debe ocupar un chann separadael) con una potencia de salida ajustable de 0-29 mA. </li><li> Coloque la cubierta exterior (B) con 3 tornillos a la pieza A como se representa para proteger el LED contra daño físico. </li><li> Para poder conectar el dispositivo a una bomba de agua, pegamento en los clips de tubo (C) en los agujeros perforados de pieza A (representada en la figura 1a, la sección transversal Y: 9 mm y 61,5 mm) con pegamento de PVC. </li><li> Cortar un largo tubo de plexiglás 58,5 mm (D1). </li><li> Fabricación piezas D2 y D3 de Plexiglas como se representa en la Figura 2. </li><li> piece pegamento D3 de la parte inferior de D1 con Plexiglas pegamento. </li><li> Adjuntar una junta tórica de caucho a la pieza D2 y péguelo en la parte superior de D1 con plexiglás pegamento. NOTA: Las piezas D1, D2 y D3 juntos forman pieza D. </li><li> Insertar pieza D en la pieza A con 3 tornillos. </li><li> Pruebe el dispositivo para la salida del agua antes de suministrar energía al transformador. </li></ol></li></ol> 2. Medición de la cinética de una herramienta Optogenética <ol&gt; <li> preparar las células <ol><li> Cultura células Ramos B en RPMI-medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) a una densidad de 3- 10 x 10 6 células / ml a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Cosecha Ramos B células por centrifugación a 350 xg y 4 ° C durante 5 min. </li><li> Recuento de células utilizando una cámara de recuento Neubauer siguientes instrucciones del fabricante y resuspender 1-5 x 10 6 células en 600 l de medio. </li><li> Transferir las células a un tubo de vidrio de FACS, ponerlos en hielo y protegerlos de la luz hasta la medición. </li></ol></li><li> Preparar el citómetro de flujo y el dispositivo. <ol><li> Conectar el dispositivo a una bomba de agua caliente y ajustar la temperatura a 37 ° C. </li><li> Cuando se utilizan tubos de FACS vidrio, intercambiar el negro junta tórica del citómetro de flujo con una junta tórica de caucho y, además, aplicar gr de siliciofacilitar. </li></ol></li><li> Medición <ol><li> Introduzca con cuidado el tubo de FACS de vidrio en el dispositivo y conectarlo con el citómetro de flujo (Figura 3). </li><li> Iniciar la medición y registrar Dronpa intensidad fluorescente (GFP canal). </li><li> Iluminar la muestra de células con 400 nm o 500 nm de luz, respectivamente, y registrar la intensidad de fluorescencia Dronpa (canal GFP). </li></ol></li><li> Análisis de los datos <ol><li> Analizar los datos experimentales con flujo adecuado citómetro de software. Gráfico de dispersión hacia adelante contra la dispersión lateral y la puerta de las células vivas. Trazar la intensidad de fluorescencia Dronpa lo largo del tiempo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of intracellular signaling pathways.</a> Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+protein+clustering+and+signaling+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells.</a> Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).</li>
<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+transmembrane+receptors+through+optogenetic+Cry2+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering.</a> Nat Commun. 6, 6898(2015).</li>
<li>Strickland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TULIPs%3A+tunable%2C+light-controlled+interacting+protein+tags+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology.</a> Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nat Commun. 5, 4925(2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+photoactivatable+antigen+system+to+examine+B-cell+probing+termination+and+the+B-cell+receptor+sorting+mechanisms+during+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).</li>
<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El flujo de Thermo LED es un dispositivo innovador para estudiar herramientas optogenética en un citómetro de flujo. Hasta el momento, las muestras han sido optogenética sólo iluminada con rayos láser o dispositivos de microscopía linterna 11,12. Dependiendo del ángulo y la distancia de la linterna a la muestra, se espera que la variabilidad sustancial en la cantidad de iluminación entre los experimentos. Además, hay un límite en el número de linternas una sola persona puede opera...

Herramientas Optogenética han ido ganando popularidad, en parte debido a que se pueden utilizar para descifrar el cableado de las vías de señalización de 1-4. Se basan en la capacidad de las proteínas fotoactivables para cambiar su conformación y de unión por afinidad cuando se ilumina con la luz. La fusión de estas proteínas a los elementos de señalización permite la regulación específica de un solo jugador dentro de complejas vías de señalización intracelular 5-12. Por consiguiente, una vía de señalización puede ser estudiado con alta resolución temporal y espacial. La mayoría de los estudios optogenética basados en células utilizan métodos basados en la microscopía combinado con el cultivo en presencia de luz, seguido de análisis bioquímico 11,12. Por el contrario, un flujo singulariza citómetro de células a lo largo de un capilar y mide el tamaño celular, la granularidad y la intensidad de fluorescencia. Este método tiene ventajas importantes sobre microscopía o bioquímicos métodos, incluyendo la capacidad de analizar thousands de células a una resolución de una sola célula de vivir en un tiempo muy corto. Por lo tanto, es deseable combinar optogenética con citometría de flujo. Hasta donde sabemos, no existe un protocolo establecido para citometría de flujo optogenético. Un procedimiento ampliamente aceptado es iluminar manualmente las células desde el exterior del tubo de reacción con dispositivos de linterna. Sin embargo, la iluminación en el manual de flujo requiere citómetro de que la luz pase a través del tubo de reacción y, por imágenes de células vivas, una forma cilíndrica, cámara de agua caliente. Esto hace que la dispersión de luz y sustancial pérdida de luz. Por otra parte, la intensidad de la luz proporcionada por la iluminación manual no es reproducible entre experimentos (ángulo, distancia, etc.) y hay un límite práctico para el número de longitudes de onda en un experimento. Mediante la construcción del dispositivo de flujo Thermo LED, hemos sido capaces de superar estas limitaciones. Con este dispositivo, las células pueden ser iluminadas con longitudes de onda específicas en un tempratura controlada de forma durante las mediciones de citometría de flujo. Esto permite que las cantidades precisas y reproducibles de la luz dentro y entre los experimentos. Para demostrar la utilidad de nuestro dispositivo in vivo, se registró la señal de fluorescencia de Dronpa en las células B Ramos durante photoswitching. células Ramos B se derivan de un linfoma de Burkitt humano. Dronpa es una proteína fluorescente que existe como un monómero, dímero o tetrámero. En su forma monomérica, es no fluorescente. Iluminación con luz de 400 nm induce la dimerización y tetramerización y hace que la proteína fluorescente Dronpa. Este proceso puede ser revertido por iluminación con luz de 500 nm. La proteína Dronpa se ha utilizado para controlar la función y la ubicación de las proteínas de señalización de 4,13. Aquí, hemos expresado una proteína Dronpa engarce-Dronpa en las células B Ramos para estudiar photoswitching de Dronpa en un citómetro de flujo. El uso de nuestro dispositivo, hemos sido capaces de manera eficiente yreproducible PHOTOSWITCH Dronpa durante la grabación de su intensidad de fluorescencia en tiempo real. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre los protocolos actuales de iluminación con la iluminación manual y amplía considerablemente el repertorio experimental para herramientas optogenética y compuestos jaula. El uso de nuestro dispositivo simplificará significativamente y acelerar el descubrimiento y desarrollo de nuevas herramientas optogenética.

<table><tbody><tr><td>Tubo de vidrio FACS</td><td>Thermo Fisher Scientific; Waltham, EE. UU.</td><td>14-961-26</td><td>Tubos de vidrio de borosilicato 12x75 mm</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Bioscienceg; Heidelberg, Alemania</td><td>Fortessa II</td><td>Orden Especial</td></tr><tr><td>Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N Addgene</td><td>; Cambridge, EE. UU.</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, EE. UU.</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Alemania</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Alemania</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plexiglás 15 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglás 3 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglás 2,5 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglás</td><td>Maertin de 1,5 mm; Friburgo, Alemania</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>baldosa de PVC 5 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>Baldosa de PVC 6 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de PVC 50 mm</td><td>Maertin; Friburgo, Alemania</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>EMD; Alemania</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech; Aidenbach, Alemania</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Esttomicina (10.000 U/mL)</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de plexiglás Acrifix</td><td>Evonic industries, Essen, Alemania</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento Tangit PVC-U</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

thermo led flujo - combinando optogenética con citometría de flujo

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Las herramientas optogenéticas permiten investigaciones aisladas y funcionales de casi cualquier molécula de señalización dentro de vías de señalización complejas. Un obstáculo importante es la entrega controlada de luz a la muestra celular y, por lo tanto, las herramientas más populares para los estudios optogenéticos son los análisis celulares basados en microscopía y los experimentos in vitro. El citómetro de flujo tiene grandes ventajas sobre un microscopio, incluida la capacidad de medir rápidamente miles de células con una resolución de una sola célula. Sin embargo, aún no se utiliza ampliamente en optogenética. Aquí, presentamos un dispositivo que combina el poder de la optogenética y la citometría de flujo: el LED Thermo Flow. Este dispositivo ilumina las células a longitudes de onda, intensidades de luz y temperaturas específicas durante las mediciones de citometría de flujo. Se puede construir a bajo costo y se puede utilizar con los citómetros de flujo más comunes. Para demostrar su utilidad, caracterizamos la cinética de fotoconmutación de proteínas Dronpa in vivo y en tiempo real. Este protocolo se puede adaptar a casi todas las sustancias ópticamente controladas y amplía sustancialmente el conjunto de posibles experimentos. Y lo que es más importante, simplificará en gran medida el descubrimiento y el desarrollo de nuevas herramientas optogenéticas.

Utilizando el flujo de Thermo LED con un citómetro de flujo El núcleo funcional del dispositivo es una cámara cilíndrica en la que las luces LED están dispuestos en una forma circular que apunta hacia el interior. Esta cámara se puede conectar a un suministro de agua y la bomba, lo que permite controlar la temperatura de los LED, así como la muestra de células. Los LED están conectados a un transformador y, por tanto, la intensi...

Las sustancias controladas ópticamente son herramientas poderosas para estudiar las vías de señalización. Para ampliar el espectro de posibles experimentos, desarrollamos un dispositivo para estudiar sustancias controladas ópticamente en tiempo real mediante citometría de flujo: el LED Thermo Flow.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

El objetivo general de este método es estimular sustancias controladas ópticamente durante las mediciones de citometría de flujo. Este novedoso dispositivo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización celular al combinar el poder de las sustancias controladas ópticamente con la citometría de flujo. Por primera vez, las herramientas optogenéticas pueden caracterizarse y analizarse mediante citometría de flujo.Hasta el día de hoy no existía un método establecido comparable. Para empezar, suspenda los linfocitos Ramos B transducidos a una concentración de un millón de células por mililitro y transfiéralos a un tubo FACS de vidrio. A continuación, cambie la junta tórica negra del citómetro de flujo por una junta tórica de goma y aplique grasa de silicona para crear un mejor sellado.Inserte el tubo de vidrio en un citómetro de flujo y coloque el prototipo de LED alrededor del tubo con las luces apagadas. Mida la intensidad de fluorescencia de Dronpa en el canal GFP. El paso más crítico del procedimiento es la manipulación de los tubos de vidrio.Los tubos FACS de vidrio son muy frágiles y, por lo tanto, se recomienda practicar la inserción de los tubos de vidri

led-thermo-flow-combining-optogenetics-with-flow-cytometry

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un ensayo de citometría de flujo para cuantificar los niveles de ROS en organoides intestinales 3D obtenidos de ratones transgénicos que expresan GFP. Este método proporciona un modelo experimental in vitro para investigar la eficacia de los compuestos de prueba en la producción de ROS.

Ensayo de citometría de flujo para cuantificar el estrés oxidativo: un ensayo para cuantificar especies reactivas de oxígeno en organoides intestinales utilizando sondas fluorogénicas

Este video muestra la citometría de flujo para medir la absorción microglial de biopartículas fluorescentes después de la administración intravítrea en un ojo de ratón. La citometría de flujo detecta células vivas que expresan CD11b y distingue las células de microglía fagocítica que exhiben fluorescencia verde de otras células mieloides, incluidos los monocitos que expresan Ly6C y los neutrófilos que expresan Ly6G.

Medición de la absorción microglial de partículas fluorescentes administradas intravítreamente mediante citometría de flujo

El video muestra un ensayo de citometría de flujo de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para detectar la actividad de siembra de agregados de proteínas aislados de muestras biológicas. Las células de mamíferos que expresan proteínas reporteras tau se incuban con complejos de transducción de liposomas que contienen semillas de tau. Estas semillas median la agregación de las proteínas reporteras, lo que lleva a generar una señal positiva FRET en el citómetro de flujo.

Una técnica de citometría de flujo FRET para detectar la agregación de proteínas reporteras inducida por semillas de tau

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Se presentan métodos para estudiar el efecto de las MEP y otras toxinas secretadas...

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Este protocolo describe la implementación de un sistema de microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica para la obtención de imágenes de una sola célula en el flujo microfluídico ultrarrápido y sus aplicaciones en citometría de flujo por imágenes.

Microfluidic Imaging Cytometría de flujo por Asimétrica de detección de tiempo de estiramiento Microscopía óptica (ATOM)

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Aprende a combinar optogenética con citometría de flujo para estudiar señalización celular en tiempo real. Este método permite caracterizar herramientas optogenéticas usando linfocitos B Ramos y análisis de fluorescencia.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Explorar más videos