La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

El objetivo general de este procedimiento de modificación genética en ratones es identificar, purificar y caracterizar las células inmunitarias productoras de IL-22. Las células del sistema inmunitario liberan mediadores llamados citoquinas, que se encargan de defendernos contra agentes extraños como las bacterias y restaurar los tejidos dañados. La IL-22 es una de esas citocinas y se le han atribuido muchas actividades que van desde la reparación de tejidos hasta la patología.

Y se ha informado que varios tipos diferentes de células en el sistema inmunológico son capaces de producirlo. Entonces, para aclarar qué células realmente producen IL-22, desarrollamos un nuevo ratón reportero de IL-22. Esto nos permitió identificar productores relevantes de IL-22 in vivo en ratones en condiciones normales y en un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal.

También utilizamos células reporteras para purificar los expresores de IL-22 y determinar sus otras propiedades. Se describe brevemente el método de generación de ratones reporteros y los métodos de análisis. Los métodos descritos se pueden aplicar a otros genes con el fin de identificar los expresores y purificar las células expresantes viables para su posterior caracterización.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre las actividades biológicas de la IL-22 y las propiedades de las células que la producen. Julie Hixon, bióloga, Caroline Andrews, postdoctorada, y Wenqing Li, científica del laboratorio, harán una demostración del procedimiento, todas del laboratorio del Dr. Durham. Después de insertar el gen reportero tdTomato en un vector lanzadera, reemplazando el gen GFP dentro del mismo sitio, use el cromosoma artificial bacteriano apropiado, o plantilla BAC para amplificar las cajas de homología A y B al primer exón traducido de IL-22 en un sistema de reacción de PCR de 50 microlitros.

A continuación, transforme los vectores purificados en células bacterianas competentes para el alcoholemia en placas de agar Luria-Bertani o LB que contengan cloranfenicol y ampicilina a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, inocular dos o tres colonias en un mililitro de caldo LB, suplementado con cloranfenicol a 37 grados centígrados y 225 rpm. Después de una hora, esparce 100 microlitros de cada mezcla en una placa de agar LB suplementada con cloranfenicol y sacarosa para un cultivo nocturno a 37 grados centígrados.

A la mañana siguiente, vuelva a colocar las colonias grandes en una nueva placa de agar LB con cloranfenicol y las colonias pequeñas en otra placa de agar LB y exponga las placas a la luz ultravioleta durante 30 segundos. A continuación, seleccione una colonia sensible a los rayos UV y utilice un cebador heterocigoto tdTomato IL-22 para confirmar la presencia del ADN BAC modificado por PCR. Después de extirpar el bazo y el timo, use pinzas de disección dentadas de punta fina para extraer los ganglios linfáticos mesentéricos de color blanco nacarado cerca de la pared del intestino delgado.

A continuación, retire todo el intestino delgado y el colon y use unas tijeras para extraer los parches de Peyer ovalados extendidos a lo largo del intestino. Cuando se hayan recolectado todos los tejidos linfáticos, muela los ganglios linfáticos mesentéricos y los parches de Peyer entre dos portaobjetos esmerilados en PBS complementado con FBS en hielo. Después de generar suspensiones individuales de células individuales de bazo y timo de la misma manera, centrifuga las células del bazo seguidas de la lisis de glóbulos rojos esplénicos con un mililitro de bazo ACK Lysing Buffers.

Después de un minuto, restaure la isotonicidad con nueve mililitros de PBS y vuelva a centrifugar las células. Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de PBS y filtre las células a través de un filtro de células de 100 micras. A continuación, recoja las células mediante otra centrifugación, resuspendiendo el pellet en cinco mililitros de medio RPI para su enumeración por exclusión de azul tripano.

Después de recolectar el intestino delgado desde el duodeno hasta el íleon, junto con todo el colon, use fórceps para eliminar el tejido adiposo y mesentérico adicional del intestino e inmediatamente coloque el tejido intestinal en PBS helado. Use fórceps para extraer los parches de Peyer a lo largo de la región distal del intestino delgado. Luego use unas tijeras para abrir el intestino a lo largo y enjuague completamente el tejido con 10 mililitros de PBS helado.

Transfiera la muestra a 20 mililitros de tampón de predigestión durante dos incubaciones de 30 minutos a 37 grados centígrados y 50 rpm en un agitador, vórtice el tejido durante 30 segundos a 12.000 rpm y presione todos los fragmentos a través de un filtro de células de 100 micras al final de cada incubación para recoger la capa de células epiteliales. A continuación, agregue 20 mililitros de solución fresca de EDTA a la suspensión celular para otra incubación de 30 minutos con agitación a 37 grados centígrados, filtrando y enfriando las células epiteliales intestinales al final de la incubación como se acaba de demostrar. Coloque los fragmentos de intestino restantes en hielo y recoja las células epiteliales intestinales agrupadas por centrifugación, seguida de un lavado en 10 mililitros de HBSS suplementado con FBS.

Vuelva a suspender el pellet lavado en ocho mililitros de medio de sílice coloidal al 44% y superponga la suspensión celular con cinco mililitros de medio de sílice coloidal al 67%. Separe las células por centrifugación y utilice una pipeta de un mililitro para eliminar los cinco mililitros superiores del medio de separación celular. A continuación, recoja las células en la interfaz y lave las células epiteliales intestinales en 10 mililitros de medio RPMI, resuspendiendo el pellet en cinco mililitros de RPMI fresco.

Después de preparar suspensiones de células individuales del bazo a partir de ratones IL-22 td-Tomato como se acaba de demostrar. Vuelva a suspender las células a una concentración de una vez 10 a la séptima célula por mililitro en PBS estéril y utilice el método de aislamiento de células CD4 negativas de ratón para purificar las células T CD4 positivas. A continuación, etiquete las células T con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD45RB durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación seguida de un lavado en dos mililitros de PBS suplementado con FBS. Vuelva a suspender el pellet lavado en un mililitro de PBS y FBS frescos y clasifique las células T marcadas por citometría de flujo según su coexpresión de CD4 y CD45RB. Cuando se hayan clasificado todas las células, recójalas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet a una concentración de una vez de 10 a seis células por mililitro en PBS estéril para la inyección de las células en receptores de ratones RAG1 knockout.

Para crear el transgen reportero murino de IL-22, se utilizó la recombinación de transgenes para modificar un cromosoma artificial bacteriano portador de la langosta IL-22 que también contiene un marcador de selección positivo y un gen de resistencia a los antibióticos cloranfenicol. Después de introducir tdTomato en el exón 1, la secuencia del péptido señal se interrumpió, atrapando el reportero de tdTomato dentro de las células que expresan IL-22 y permitiendo su detección y aislamiento por citometría de flujo. Para probar la fidelidad de los reporteros de IL-22, los esplenocitos generados in vitro se pueden cultivar en condiciones Th22 o neutras con la expresión de IL-22 tdTomato aparente tanto por citometría de flujo como por microscopía fluorescente.

In vivo, los reporteros de IL-22 se detectaron en diferentes tejidos de ratón en condiciones homeostáticas con la mayor parte de la señal observada en las células de la lámina propia del intestino, pero no en el ganglio linfático axilar, el bazo o el timo. En un modelo de colitis murino inducida por la transferencia de células T altas CD4 positivas para CD45RB reportero a ratones RAG1 knockout, los reporteros de tdTomato se visualizan primero en los ganglios linfáticos mesentéricos, pero su eventual acumulación en la lámina propia del intestino delgado distal y los tejidos del colon. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe elegir el clon BAC correcto.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el establecimiento de modelos de infección pulmonar o cutánea utilizando este ratón reportero para responder preguntas adicionales sobre el papel de la IL-22 en la defensa del huésped y la reparación de tejidos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la función de las proteínas secretadas que demuestran una baja expresión utilizando un modelo de ratón como este. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar un ratón reportero transgénico e identificar los genes reporteros de IL-22 in vitro e in vivo.