La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón
17 de noviembre de 2016
El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Los tampones y técnica quirúrgica se describen en detalle.
El objetivo general de este protocolo es analizar la función renal aislada en un riñón de ratón perfundido ex vivo. Excluyendo la influencia de la presión arterial, las hormonas o el sistema nervioso autónomo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la Nefrología.
Dando acceso a la función de órganos aislados y sirviendo como una herramienta elegante para estudiar la lesión renal aguda. La principal ventaja del IPK es que se estudia la función de los órganos en ausencia de influencias sistémicas. Después de preparar al ratón para la cirugía, con unas tijeras, realice una laparotomía media desde la cresta púbica hasta el esternón.
Primero abre la piel y luego los músculos abdominales. A continuación, retira los intestinos y colócalos en el lado izquierdo del ratón, lateral desde el abdomen. Ahora, libere la vejiga del tejido conectivo y exponga ambos uréteres y la uretra.
Para estos procedimientos, coloque todas las ligaduras utilizando suturas 5-0. La primera ligadura que se coloca es alrededor del uréter izquierdo. Ciérrelo herméticamente con un nudo quirúrgico doble.
A continuación, coloque una ligadura alrededor de la uretra utilizando la misma técnica. Luego, coloca una ligadura de lazo alrededor de toda la vejiga, pero déjala desatada. Con las primeras tres suturas en su lugar, use unas tijeras oculares para hacer una incisión de un milímetro de largo en la vejiga.
En esta incisión, coloque una cánula hecha de dos centímetros de tubo de PE-50. Ahora cierre la ligadura que ata la vejiga, asegurando la cánula. Con la vejiga canulada, corte ahora el uréter izquierdo y la uretra distal de las ligaduras.
La vejiga ahora solo debe estar conectada al uréter derecho y debe moverse libremente. A continuación, extirpe los tejidos conectivos y la grasa que rodea la aorta abdominal. Luego, coloque ligaduras alrededor del punto medio de la aorta expuesta y justo debajo del diafragma entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco.
Mantenga cada uno de estos sueltos también. A continuación, coloque una ligadura alrededor de la arteria mesentérica superior. Ahora, coloque una tercera ligadura alrededor de la aorta directamente debajo de la arteria renal derecha y por encima de la arteria renal izquierda.
Esta es la ligadura número siete. Finalmente, coloque una ligadura alrededor del paquete de la vena caudal. Ahora coloque una pinza entre la ligadura número siete y la ramificación de la arteria renal izquierda.
A continuación, se realiza una pequeña incisión en la aorta, caudal a la ligadura siete, teniendo cuidado de no cortar la pared dorsal y estirar la abertura con un dilatador de vasos. En la abertura, inserte una cánula PE-50 tirada de dos centímetros, empujando la punta justo en la abrazadera. A continuación, abra la abrazadera.
A continuación, empuje la punta de la aguja cranealmente hasta que llegue a la unión de la arteria renal derecha y la aorta. Ahora cierre la ligadura siete y luego cierre la ligadura en el punto medio de la aorta abdominal. Proceda abriendo el cofre con unas tijeras diseccionando el diafragma.
Luego, con un solo corte, separe la aorta, la vena cava, el corazón y los nervios vegetativos. Ahora, inicie el control de presión de la bomba de perfusión y mantenga la presión media entre 80 y 100 milímetros de mercurio. Ahora, cierre las tres ligaduras restantes desatadas alrededor de la aorta y el paquete de la vena caudal.
Con unas tijeras, libere el riñón derecho del tejido conectivo circundante y libérelo de la cápsula adiposa. Cortar la aorta proximalmente a la ligadura entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco. A continuación, corte distalmente la arteria mesentérica superior a la ligadura alrededor de la arteria mesentérica superior.
Ahora, retire el haz de vasos que soportan el riñón, teniendo cuidado de no cortar los vasos en sí. Luego, corte el hígado en la conexión con el riñón, pero deje una pequeña parte del hígado unida a él, de modo que la vena cava se mantenga abierta por él. El siguiente paso es extraer el haz de riñón del ratón.
Ahora, deja el riñón en la cámara y retira el ratón. En la conexión entre el hígado y el riñón, coloque una ligadura de lazo. A continuación, canula la vena cava con una línea venosa y cierre la ligadura del lazo.
El riñón ahora debe permanecer estable en la caja. El flujo venoso a través de la vía venosa debe comenzar inmediatamente. La salida de orina comenzará después de aproximadamente tres minutos.
La peristalsis del uréter debe comenzar inmediatamente y permanecer estable durante al menos una hora. Cierra la caja. La preparación ya está completa y debería permanecer viable durante al menos una hora.
Después de utilizar el método descrito en ratones C57 black 6, se probó la viabilidad tisular de cuatro riñones después de una hora de perfusión continua. La presión se mantuvo en 100 milímetros continuos de mercurio. El flujo de perfusión y la resistencia vascular se mantuvieron estables en los cuatro riñones.
La tasa de filtración glomerular se evaluó mediante el aclaramiento de inulina FITC con la intención de aumentar con el tiempo, pero no de manera significativa. Se evaluó la excreción fraccionada de sodio y potasio a los 55 minutos de perfusión. Estos parámetros aumentaron en comparación con la situación in vivo.
Después de 55 minutos, la molalidad de los urinarios no se elevó por encima de la osmolalidad del flujo venoso. A continuación, se fijaron los riñones y se evaluó su ultraestructura con TEM. Los glomérulos en los segmentos S1 de los túbulos proximales parecían prácticamente inalterados.
Algunos segmentos S2, S3 de los túbulos proximales de las extremidades ascendentes gruesas, pero no todos, mostraron signos de daño orgánico. Tras una inspección más cercana, los túbulos contorneados distales y los conductos colectores no mostraron signos de necrosis. En general, los riñones reflejaron lo reportado para los riñones perfundidos aislados en ratas.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos de análisis como imágenes o hechos seguidos de análisis de proteínas o ARN en el tejido para obtener más información.
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Descripción general
La técnica del riñón aislado perfundido en ratón (MIPK) permite el análisis de la función renal en un entorno ex vivo durante una hora. Este método excluye influencias sistémicas, proporcionando información sobre la función del órgano aislado y sobre la lesión renal aguda.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Nefrología
- Técnicas de perfusión orgánica
- Investigación sobre lesión renal aguda
Antecedentes
- La técnica MIPK está diseñada para estudiar la función renal sin la influencia de la presión arterial ni de hormonas.
- Este método es fundamental para comprender la función de órganos aislados.
- Sirve como una herramienta valiosa para investigar la lesión renal aguda.
- La preparación quirúrgica implica una laparotomía media para acceder al riñón.
Objetivo del estudio
- Analizar la función renal aislada en un entorno controlado ex vivo.
- Excluir las influencias sistémicas sobre el rendimiento renal.
- Proporcionar información sobre los mecanismos de lesión renal aguda.
Métodos Utilizados
- Preparación del ratón para la cirugía.
- Laparotomía media desde la cresta púbica hasta el esternón.
- Perfusión del riñón aislado con tampones específicos.
- Monitoreo de la función renal durante el período de perfusión.
Resultados principales
- Mantenimiento exitoso de la función renal durante una hora ex vivo.
- Demuestra los efectos de la lesión renal aguda en un entorno controlado.
- Información obtenida sobre la respuesta del órgano aislado a la perfusión.
- Validación de la técnica MIPK como herramienta de investigación.
Conclusiones
- La técnica MIPK es efectiva para estudiar la función renal sin influencias sistémicas.
- Este método mejora la comprensión de los mecanismos de la lesión renal aguda.
- Proporciona una plataforma para futuras investigaciones en nefrología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La técnica del riñón aislado perfundido en ratón (MIPK) permite la eliminación mecanicista de riesgos de dianas renales mediante el aislamiento de la función del órgano de los factores de confusión sistémicos. Esto apoya la validación de dianas y el desarrollo de ensayos en programas de descubrimiento centrados en nefrología. El método proporciona una confianza predictiva para evaluar candidatos a fármacos en un sistema ex vivo controlado y reproducible.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Evalúa hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de las respuestas renales aisladas a compuestos, sin interferencia hormonal ni neural.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas mediante la medición directa del flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular y la producción urinaria.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que modifican la tasa de filtración glomerular o el manejo de electrolitos en un sistema relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores con lecturas funcionales y moleculares cuantitativas.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones del ensayo mediante presión de perfusión controlada y cronogramas consistentes de recolección de orina.
- Valor de escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma para la modelización de lesión renal aguda y el perfilado de transportadores en diferentes segmentos del túbulo nefronal.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor traslacional: Mantiene la relevancia de la enfermedad mediante lecturas estructurales y moleculares, incluyendo la ultraestructura por microscopía electrónica de transmisión y el análisis por inmunotransferencia de proteínas de transporte.
- Continuidad preclínica: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al permitir el análisis del tejido tras la perfusión para estudios de imagen, proteínas o ARN.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta las decisiones de avance al revelar patrones de daño tubular segmento-específicos bajo estrés de perfusión.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
La técnica MIPK se enmarca dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre un blanco hasta la identificación de un compuesto inicial, proporcionando una validación funcional antes del compromiso preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de la función renal para clarificar los efectos específicos de los fármacos en determinadas vías.
- Cribado: Proporciona disponibilidad del ensayo mediante parámetros estables de perfusión y resultados cuantificables, como la depuración de inulina marcada con FITC y la excreción fraccional de electrolitos.
- Analítica: Genera conjuntos de datos comparativos mediante mediciones de resistencia vascular, tasa de filtración glomerular y osmolaridad para clasificar los efectos de los compuestos.
- Investigación Translacional: Permite la continuidad mediante el análisis de tejidos posteriores a la perfusión para alinear biomarcadores y obtener información mecanicista.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de perfusión reutilizable para el perfilado de segmentos nefrónicos y estudios de inhibición de transportadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al eliminar variables sistémicas en la evaluación de la función renal.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante una preparación quirúrgica estandarizada y el control de la presión de perfusión (80–100 mmHg).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales tempranos de riesgo en un contexto específico del riñón.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en respuestas directas a nivel del órgano frente a perturbaciones farmacológicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía vascular y técnicas de canulación en ratones.
- Depende de un aparato de perfusión capaz de mantener presiones y caudales estables.
- Exige estandarización entre los equipos para una colocación consistente de ligaduras y canulación de la vejiga.
- Las consideraciones de adaptación incluyen el tamaño de los vasos específicos de la especie y la composición del tampón de perfusión.
- Limitación práctica: la ventana de viabilidad de aproximadamente una hora restringe los estudios de exposición prolongada a compuestos.
