Name: La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende la técnica de riñón perfundido aislado del ratón para estudiar función renal ex vivo sin influencias sistémicas. Este método permite investigar lesión renal aguda en nefrología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a Hans-Joachim Schurek por sus valiosos consejos científicos. Los autores desean agradecer a Monique Carrel y Michèle Heidemeyer por su excelente asistencia técnica, a David Penton Ribas y Nourdine Faresse por la lectura crítica del manuscrito y a Carsten Wagner y Jürg Biber por el anticuerpo NaPi-2a. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional Suizo para la Competencia en Investigación "Kidney.CH" y por una subvención de proyecto (310030_143929/1) de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia.

Todos los procedimientos con animales descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con la legislación suiza y aprobados por la administración veterinaria del Cantón de Zurich, Suiza. 1. tampón de preparación de <ol><li> Preparar soluciones de 1 - 4 y la solución de la hormona antidiurética (ADH) (Tabla 1). </li><li> Preparar el tampón de diálisis (Tabla 1). NOTA: Este es el tampón utilizado como el tampón de diálisis durante la perfusión. Más tarde, los eritrocitos se diluyeron en este tampón para formar el líquido de perfusión final. </li><li> preparado de eritrocitos. <ol><li> Diluir 250 ml de concentrado de eritrocitos humanos (material ensayado obtenida del banco de sangre local) a 500 ml con tampón de diálisis. Se centrifuga a 2.000 g durante 8 min. Eliminar el tampón, teniendo cuidado de no eliminar los eritrocitos. Se repite 3 veces. </li></ol></li><li> Preparar el (albúmina de suero bovino; BSA) de albúmina de buffer. <ol><li> En 200 ml de dialysitampón s, se disuelven 44 g de BSA utilizando una barra de agitación. Se filtra la solución con papel de filtro. </li></ol></li><li> Preparar el líquido de perfusión. <ol><li> Filtrar los eritrocitos de la etapa 1.3.1 a través de papel de filtro en el tampón de BSA. Llenar hasta un volumen total de 800 ml con tampón de diálisis. NOTA: Este es el líquido de perfusión final. El hematocrito ahora debe estar entre 8 y 12%. El líquido de perfusión se puede almacenar durante un máximo de 12 horas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Inicio de la diálisis y Oxigenación <ol><li> Encienda el baño de agua que rodea el depósito más grande de amortiguación, depósito de regulación más pequeña, y la cámara húmeda (una pequeña cámara, de doble pared llevó a 37 ° C y 100% de humedad para sostener más tarde el riñón) a 37 ° C (Figura 2) . </li><li> Llenar el depósito de regulación más grande con el tampón de diálisis y el depósito más pequeña con el perfundido. </li><li> Encienda el 5% de CO 2 O de entrada de gas 2/95% a tampón de diálisis. </li><li> Cambie en diálisis continua del líquido de perfusión frente al tampón de diálisis. Tenga cuidado de usar un tubo de diálisis de bajo flujo. Continúe con el Paso 3. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Figura 2: Dibujo esquemático del circuito de perfusión. Esquema muestra los componentes principales del circuito de perfusión y la dirección del flujo de tampón. Todos los componentes rodeadas de azul oscuro se mantienen a 37 ° C con un baño de agua / termostato. 1: Diálisis tampón de por lo menos 3 veces el volumen del tampón de perfusión se burbujea continuamente con 95% O2 / 5% de CO 2. 2: Diálisis tampón y tampón de perfusión se dializan de forma continua entre sí en un tubo de diálisis por una bomba de rodillos. 3: througho constante Debido a esta diálisis, el tampón de perfusión se enriquece con 9% de O2 / 5% de CO 2 y electrolitos niveles se mantienenperfusión ut. 4: una bomba de rodillos propulsa el tampón de perfusión hacia el riñón. 5: Un receptor de aire elimina ondas peristálticas y actúa como una trampa de burbujas. 6: El transductor de presión (conectado a 4. (bomba de rodillos) para mantener una presión continua al tiempo que permite el flujo libre alterna). 7: A lo largo de la perfusión, el riñón se mantiene en una cámara húmeda para la humedad del aire 100% y 37 ° C de temperatura de riñón. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 3. Procedimiento quirúrgico Parte 1 (para un diagrama de todas las ligaduras, véase la Figura 3) Nota: Realizar todas las ligaduras utilizando 5-0 hilo quirúrgico. <ol><li> Anestesiar un ratón mediante inyección intraperitoneal (10 l / g de peso corporal, 20 mg / ml de ketamina y 1 mg / ml de xilazina disuelto en 0,9% NaCl). Confirmar suficiente profundidad de anesthEIAS ensayando la ausencia de reflejos del pie trasero. </li><li> Fijar el ratón en una posición supina en la cámara húmeda. Proteger los ojos con ungüento veterinario. Colocar una jeringa de 1 ml por debajo de la columna vertebral para elevar los vasos lumbares. </li><li> Realizar una laparotomía media de la cresta del pubis a la apertura del esternón primero la piel, los músculos abdominales, con unas tijeras. </li><li> Retire el intestino y lo coloca en el lado izquierdo del ratón lateral del abdomen. </li><li> Liberar la vejiga a partir de tejido conjuntivo y explorar ambos uréteres y la uretra. </li><li> Colocar una ligadura alrededor del uréter izquierdo (I ligadura). Cierralo. </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la uretra (ligadura II). Cierralo. </li><li> Colocar una ligadura &quot;lazo&quot; alrededor de toda la vejiga (ligadura III). </li><li> Incisión en la vejiga 1 mm. </li><li> Canular la abertura con 2 cm PE 50 tubos. </li><li> Cerrar ligadura III alrededor de la tubería. </li><li> Cortar el uréter izquierdo y la uretra distal de las ligaduras. el bladder está ahora unido al uréter derecho solamente y se mueve libremente. </li><li> Desactive la aorta abdominal de tejido conectivo y grasa. </li><li> Colocar una ligadura mediados de aorta abdominal (IV ligadura). </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la aorta por debajo del diafragma entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco (V ligadura). </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la arteria mesentérica superior (VI ligadura). </li><li> Colocar una ligadura aórtica directamente debajo de la derecha y por encima de la arteria renal izquierda (VII ligadura). </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la vena caudal del paquete (cava) (VIII ligadura). Vaya al paso 4. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Figura 3: Representación esquemática de las ligaduras colocadas durante la cirugía. Vista del abdomen abierto después de la laparotomía. El intestino se mueve hacia la izquierda. L y R indican el riñón izquierdo y derecho. lalíneas negras muestran el área de la respectiva ligadura. Las ligaduras se colocan primero y luego cerrados, según el orden indicado en el texto. X marca la ubicación de la incisión para la canulación de la aorta. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 4. El cebado del circuito de perfusión <ol><li> Arrancar la bomba rotativa y llenar el tubo con líquido de perfusión. Tenga cuidado de vaciar todas las burbujas de aire. </li><li> Complete el dispositivo receptor de aire a aproximadamente a mitad de la altura de líquido de perfusión. </li><li> Calibrar el transductor de presión a 0 mm Hg cuando todos los tubos se llena y el flujo es 0. Mantenga la aguja de perfusión a nivel del riñón durante este tiempo. </li><li> Mantener el caudal a un nivel mínimo constante (0,6 ml / min) y vaya al paso 5. </li></ol> 5. Procedimiento quirúrgico Parte 2 <ol><li> Colocar una pinza de ligadura entre el IV y la ramificación de la izquierda renal arteria. </li><li> Hacer una pequeña incisión en la aorta caudal de ligadura IV, teniendo cuidado de no cortar la pared dorsal. </li><li> Dilatar la abertura en la aorta con un dilatador de vasos. </li><li> Canular la aorta con una aguja (2 cm de largo, tirado PE 50), empujando la punta justo a la abrazadera. </li><li> Abra la pinza. </li><li> Empuje la punta de la aguja cranealmente hasta que llega a la unión de la arteria renal derecha y la aorta. </li><li> Cerrar ligadura VII. </li><li> Cerrar ligadura IV. </li><li> Abre el cofre con las tijeras de disección por el diafragma. Con un solo corte, separar la aorta, vena cava, el corazón y los nervios vegetativos. Con este paso, el animal se sacrificó mediante exanguinación rápida bajo anestesia profunda continua. </li><li> Comience control de la presión de la bomba de perfusión. Mantener la presión media de entre 80 y 100 mmHg. </li><li> Cerrar V. ligadura </li><li> Cerrar ligadura VI. </li><li> Cerrar ligadura VIII. </li><li> Libre el riñón derecho de tissu conjuntivoE y su incorporación en la cápsula adiposa con unas tijeras. </li><li> Cortar la aorta proximal a la ligadura V. </li><li> Cortar la arteria mesentérica superior distal a la ligadura VI. </li><li> Cortar el paquete recipiente de riñón de apoyo a cabo, teniendo cuidado de no cortar en los propios vasos. </li><li> Cortar el hígado en la conexión con el riñón. Tener cuidado para liberar el riñón, pero dejar una pequeña parte de la adherente hígado a ella, de modo que la vena cava se mantiene abierta por el mismo. </li><li> Tome el paquete de riñón de ratón. Retire el ratón desde la cámara húmeda. </li><li> Colocar una ligadura &quot;lazo&quot; alrededor de la conexión del hígado y el riñón (IX ligadura). </li><li> Canular la vena cava con una línea venosa (2 cm PE 50). </li><li> Cerrar ligadura IX. La salida venosa a través de la línea venosa debe comenzar inmediatamente. </li><li> Cierre la cámara húmeda. </li></ol> 6. Los análisis intermedios <ol><li> Durante la siguiente hora, supervisar continuamente el flujo sanguíneo y intravasculla presión ar 15. Recoger el flujo venoso, que se puede utilizar para el análisis de, por ejemplo, la liberación de renina renal 7. Recoger la orina para el análisis de la concentración de electrolitos y el filtrado glomerular 14. Después de 1 hora de perfusión, los riñones pueden ser congeladas instantáneamente por el Western Blot o fijarse para obtener imágenes de los enfoques 16. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
<li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li>
<li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li>
<li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+albumin+filtration%3A+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li>
<li>Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li>
<li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos y nada más que revelar.

El ratón aislados del riñón perfundido es una herramienta para el estudio de la función renal en un ambiente controlado ex vivo durante 1 hora, reduciendo la brecha entre los experimentos in vivo en animales intactos, lo que puede ser defectuoso por el impacto de numerosos factores sistémicos, y los experimentos in vitro en segmentos de la nefrona aisladas o células cultivadas, lo que necesariamente descuidar el impacto de la estructura de los órganos intactos en la función. Hay, al c...

La perfusión aislada de órganos ha sido objeto de un esfuerzo continuo entre los fisiólogos durante muchas décadas 1. La técnica permite la función del órgano, sin influencias sistémicas como la hipertensión arterial, las hormonas, o los nervios, para ser estudiado. Carl Eduard Loebell se considera que es el primero que ha descrito la perfusión con éxito de un riñón aislado, en 1849 2. Desde entonces, el aparato de perfusión ha sufrido refinamiento significativo. Frey y Gruber introdujeron un pulmón artificial para las bombas de oxigenación y perfusión continua para pulsátiles 2. Mientras que los primeros investigadores estudiaron principalmente los riñones de los mamíferos grandes, a saber, cerdos y perros 2 3 -el primer informe del uso de riñones de rata, por Weiss et al. , Fue un hito en el estudio de la perfusión de los órganos mamífero pequeño 4. Schurek et al. informaron la necesidad de la adición de eritrocitos de mamíferos al perfundido si tubular renal suficienteoxigenación debía lograrse 5. Crítico para experimentos a largo plazo fue la introducción de la diálisis continua de la memoria intermedia por el mismo grupo de investigación 6. En 2003, Schweda et al. fueron los primeros en informar de un riñón aislado perfundido funcional del ratón (MIPK) 7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. 18 y Lindell et al. 14. Aunque técnicamente más difícil que la rata aislado y perfundido de riñón, el uso de la MIPK lleva la ventaja de permitir el uso de una amplia gama de ratones genéticamente alterados. Este artículo presenta los detalles del método de los autores de la perfusión de los riñones de ratones aislados durante 1 hora. El método permite la evaluación continua de la tasa de flujo renal, la resistencia vascular, la liberación de hormonas, el análisis de gases en sangre, análisis de orina, y la aplicación de fármacos. Después del procedimiento, los riñones podrían ser procesados ​​para el análisis molecular y bioquímica, se fijarán para microscopía, otrasplantado en un ratón receptor (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general de la posible entrada / salida para el riñón aislado y perfundido. BGA: análisis de gases en sangre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Esta técnica es probable que reciba una atención creciente en los próximos años, ya que muchas aplicaciones innovadoras se están discutiendo con el amanecer de la perfusión renal normothermic prolongado antes del trasplante (con o sin la aplicación de anti-rechazo o drogas genoma de edición) 8, 9, 10 , 11, la bioingeniería de los riñones enteros de andamios descelularizados 12, y la aplicación de altas dosis de tintes fluorescentes para la imagen multifotónica 13 </sup&gt;. También es un modelo ideal con el que estudiar el papel de los genes específicos durante la lesión renal aguda 14. Un protocolo paso a paso se da para permitir que otros laboratorios para realizar la perfusión aislada de riñón de ratón con éxito. En primer lugar, se especifica la composición y preparación de la memoria intermedia. A continuación, la cirugía se describe en detalle y se muestran los pasos críticos. En tercer lugar, se presentan los datos que son representativos de una preparación exitosa: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, la tasa de filtración glomerular, y el electrolito fraccionada mediciones funcionales de micrografías de viabilidad y electrónicas de transmisión de la morfología de los diferentes segmentos de la nefrona de los riñones perfundidos todos excreción- fijo después de 1 hora de perfusión.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Circuito de perfusión:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara húmeda 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannular con cesta y puerto lateral</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Termostato TC120-ST5&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Bomba de rodillos Reglo</td><td>Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Depósito encamisado para solución tampón 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Depósito encamisado para solución tampón 0,5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de presión APT300&nbsp;</td><td>Aparato de Harvard/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>Transductor TAM-D Plugsys</td><td>Aparato de Harvard/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Servocontrolador Plugsys</td><td>Aparato de Harvard/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>Adquisición de datos HSE-USB</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Dializador de bajo flujo Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE Tubo para canulación de aorta 1,19 mm de diámetro interno x 1,70 mm de diámetro exterior</td><td>Materias Primas Científicas Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Reactivos tampón:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Ácido glutámico sal monosódica hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-(-)-Málico sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodio-L-Lactato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>ácido alfa-cetoglutárico sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hormona antidiurética dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulina</td><td>Sigma-Aldrich Filtro Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td> utilizado para la filtración de eritrocitos</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Análisis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Este es un requisito previo para el estudio de la fisiología del órgano aislado y para muchas aplicaciones innovadoras que pueden ser posibles en el futuro, incluyendo descelularización la perfusión de bioingeniería renal o la administración de anti-rechazo o drogas genoma de edición en altas dosis para cebar el riñón para el trasplante. Durante el tiempo de la perfusión, el riñón puede ser manipulado, la función renal puede ser evaluada, y diversos productos farmacéuticos administrado. Después del procedimiento, el riñón puede ser trasplantado o tratados con la biología molecular, análisis bioquímicos, o microscopía. Este artículo describe el líquido de perfusión y la técnica quirúrgica necesaria para la perfusión ex vivo de los riñones de ratones. Los detalles del aparato de perfusión y se dan los datos se presentan mostrando la vESPONSABILIDAD de la preparación del riñón: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, y de orina de datos como, micrografías electrónicas de transmisión funcionales de los diferentes segmentos de la nefrona como lecturas morfológicas, y transferencias Western de las proteínas de transporte de los diferentes segmentos de la nefrona como lectura molecular.

Con el método descrito, aislados riñones de ratón pueden permanecer viables durante al menos 1 hr. Hemos probado la viabilidad del tejido después de 1 hora de perfusión continua con el funcional (flujo sanguíneo renal y la resistencia vascular, el análisis de gases en sangre del flujo venoso, la tasa de filtración glomerular, urinaria fraccional de Na + y K + excreción, y la osmolaridad urinaria) y morfológica (electrónica de transmisión microscopía, TEM)...

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Los tampones y técnica quirúrgica se describen en detalle.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

El objetivo general de este protocolo es analizar la función renal aislada en un riñón de ratón perfundido ex vivo. Excluyendo la influencia de la presión arterial, las hormonas o el sistema nervioso autónomo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la nefrología.Proporciona información sobre la función de órganos aislados y sirve como una herramienta elegante para estudiar la lesión renal aguda. La principal ventaja de la IPK es que la función del órgano se estudia en ausencia de influencias sistémicas. Después de preparar al ratón para la cirugía, utilizando tijeras, realice una laparotomía media desde la cresta púbica hasta el esternón.Primero abra la piel y luego los músculos abdominales. A continuación, retire los intestinos y colóquelos en el lado izquierdo del ratón, lateral al abdomen. Ahora, libere la vejiga del tejido conectivo y exponga ambos uréteres y la uretra.Para estos procedimientos, coloque todas las ligaduras utilizando suturas 5-0. La primera ligadura debe colocarse alrededor del uréter izquierdo. Ciérrela firmemente con un nudo quirúrgico doble.A continuación, coloque una ligadura alrededor de la uretra utilizando la misma técnica. Luego, coloque una ligadura de lazo alrededor de toda la vejiga, pero déjela sin atar. Con los primeros tres puntos colocados, use tijeras de ojo para hacer una incisión de un milímetro de longitud en la vejiga.En esta incisión, coloque una cánula hecha de dos centímetros de tubo PE-50. Ahora cierre la ligadura que rodea la vejiga, asegurando la cánula. Con la vejiga canulada, corte ahora el uréter izquierdo y la uretra distal a las ligaduras.La vejiga ahora debería estar unida únicamente al uréter derecho y debería moverse libremente. A continuación, elimine los tejidos conectivos y la grasa que rodean la aorta abdominal. Luego coloque ligaduras alrededor del punto medio de la aorta expuesta y justo debajo del diafragma, entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco.Mantenga también cada uno de estos sueltos. A continuación, coloque una ligadura alrededor de la arteria mesentérica superior. Ahora, coloque una tercera ligadura alrededor de la aorta directamente por debajo de la arteria renal derecha y por encima de la arteria renal izquierda.Esta es la ligadura número siete. Finalmente, coloque una ligadura alrededor del paquete de la vena caudal. Ahora coloque una pinza entre la ligadura número siete y la bifurcación de la arteria renal izquierda.A continuación, realice una pequeña incisión en la aorta, caudal a la ligadura siete, teniendo cuidado de no cortar la pared dorsal y ensanche la abertura con un dilatador de vasos. Introduzca en la abertura una cánula de PE-50 estirada de dos centímetros, avanzando la punta justo dentro del clamp. A continuación, abra el clamp.A continuación, empuje la punta de la aguja cranealmente hasta que alcance la unión de la arteria renal derecha y la aorta. Ahora cierre la ligadura siete y luego cierre la ligadura en el punto medio de la aorta abdominal. Proceda abriendo el tórax con tijeras mediante la disección del diafragma.Luego, con un solo corte, separe la aorta, la vena cava, el corazón y los nervios vegetativos. Ahora, inicie el control de presión de la bomba de perfusión y mantenga la presión media entre 80 y 100 milímetros de mercurio. A continuación, cierre las tres ligaduras restantes no atadas alrededor del paquete de la aorta y la vena caudal.Con tijeras, libere el riñón derecho del tejido conectivo circundante y sáquelo de la cápsula adiposa. Corte la aorta proximalmente al ligamento entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco. A continuación, corte la arteria mesentérica superior distalmente al ligamento alrededor de la arteria mesentérica superior.Ahora, retire el haz de vasos de soporte del riñón, teniendo cuidado de no cortar los vasos mismos. A continuación, corte el hígado en la conexión con el riñón, pero deje una pequeña parte del hígado adherida a este, de modo que la vena cava permanezca abierta gracias a ella. El siguiente paso consiste en retirar el haz del riñón del ratón.Ahora, deje el riñón en la cámara y retire al ratón. En la conexión entre el hígado y el riñón, coloque una ligadura de lazo. Luego, canule la vena cava con una línea venosa y cierre la ligadura de lazo.El riñón ahora debe estar estable dentro de la caja. El flujo venoso a través de la línea venosa debe comenzar inmediatamente. El flujo de orina comenzará después de aproximadamente tres minutos.La peristalsis del uréter debe comenzar inmediatamente y mantenerse estable durante al menos una hora. Cierre la caja. La preparación ya está completa y debe permanecer viable durante al menos una hora.Después de utilizar el método descrito en ratones C57 black 6, se evaluó la viabilidad del tejido de cuatro riñones tras una hora de perfusión continua. La presión se mantuvo constantemente en 100 milímetros de mercurio. El flujo del perfusado y la resistencia vascular permanecieron estables en los cuatro riñones.La tasa de filtración glomerular se evaluó mediante la depuración de inulina marcada con FITC, cuyo objetivo era aumentar con el tiempo, aunque sin alcanzar significancia. La excreción fraccional de sodio y potasio se evaluó tras 55 minutos de perfusión. Estos parámetros aumentaron en comparación con la situación in vivo.Después de 55 minutos, la molalidad de la orina no aumentó por encima de la osmolaridad del flujo venoso de salida. Luego, los riñones se fijaron y se evaluó su ultraestructura mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Los glomérulos en los segmentos S1 de los túbulos contorneados proximales parecían en gran parte inalterados.Algunos, pero no todos, los segmentos S2 y S3 de los t&uacute;bulos proximales en las asas ascendentes gruesas que no estaban cerca de los haces vasculares mostraron signos de da&ntilde;o org&aacute;nico. Tras un examen m&aacute;s detallado, los t&uacute;bulos contorneados distales y los conductos colectores no mostraron signos de necrosis. En general, los ri&ntilde;ones reflejaron lo que se ha descrito para ri&ntilde;ones aislados y perfundidos de rata.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos de análisis como imágenes o análisis posteriores de proteínas o ARN en el tejido para obtener mayores conocimientos.

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un modelo murino precisa para la lesión renal aguda (IRA), debido a la isquemia es una herramienta importante para investigar la lesión renal aguda y, posiblemente, encontrar herramientas terapéuticas para tratar la lesión renal. El sistema de peso que cuelga ofrece una herramienta para la oclusión de la arteria renal inmediata y confiable y la reperfusión, sin causar congestión renal.

El uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada

En este video, describimos el procedimiento para la extracción de riñón del espacio retroperitoneal del ratón. El riñón extraído se puede microdiseccionar para obtener un riñón intacto sin una cápsula renal y la capa de grasa circundante.

Extracción de riñón intacto de ratón: una técnica para obtener riñón sin cápsula renal a partir de modelos murinos

Este video describe el método para aislar glomérulos intactos de riñones de ratón. Los glomérulos encapsulados y descapsulados así obtenidos pueden utilizarse posteriormente para cultivar las excrecencias de las células epiteliales parietales del riñón murino.

Aislamiento de glomérulos: una técnica para obtener glomérulos intactos a partir de riñón murino

Se describen modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión inducida moderada y grave en la que los ratones se someten a pedículo renal unilateral de sujeción seguida de simultánea o en diferido nefrectomía contralateral, respectivamente. Estos modelos dan consistentemente lugar a la disfunción renal y la fibrosis después de la lesión, pero gravedad de la lesión y la supervivencia dependen de equipos de fondo, la edad y quirúrgicos ratón.

La isquemia-reperfusión modelo de lesión renal aguda y post lesión fibrosis en ratones

Se necesitan técnicas fiables y eficientes para el aislamiento de las células inmunitarias renales para aplicaciones posteriores. Esto requiere el marcaje de anticuerpos de superficie de una pequeña cantidad de células inmunitarias renales. En este artículo, describimos un método conciso para el aislamiento de células inmunitarias renales que aparentemente logra este objetivo.

Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes

Este protocolo proporciona un enfoque rentable para aislar y caracterizar ratón primario células tubulares renales que posteriormente pueden cultivarse el evaluar funciones biológicas renal ex vivo, incluyendo bioenergética mitocondrial.

Aislamiento, caracterización y alto rendimiento análisis de flujo extracelular de ratón células epiteliales tubulares renales primarias

Aquí presentamos un protocolo para murino en vivo etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular con biotina. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés.

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Este artículo proporciona instrucciones detalladas para permitir a los investigadores realizar la obstrucción ureteral unilateral reversible en ratones utilizando un modelo estandarizado que permite el análisis de los resultados estructurales y funcionales a largo plazo después de la reversión de la obstrucción ureteral prolongada.

Un modelo de ratón para evaluar los resultados estructurales y funcionales a largo plazo después de la reversión de la obstrucción ureteral unilateral prolongada

Este artículo presenta un modelo isquémico de ERC utilizando IRI renal unilateral con nefrectomía contralateral realizada un día antes de la recogida de la muestra; este protocolo permite una evaluación funcional basada en suero, una alta supervivencia y patología reproducible de ERC a los 28 y 42 días, proporcionando una plataforma versátil para estudios mecanicistas e intervencionistas.

Modelo murino de transición de enfermedad renal aguda a crónica inducida por isquemia/lesión de reperfusión renal

Se utilizó un sistema láser de imagen con contraste de motas para monitorizar los cambios en el flujo sanguíneo microvascular renal durante la isquemia-reperfusión unilateral tras la resección del riñón derecho en ratones.

Perfusión microvascular monitorizada mediante imagen láser de contraste de speckles durante la lesión por isquemia renal-reperfusión en ratones

Aprende la técnica de riñón perfundido aislado del ratón para estudiar función renal ex vivo sin influencias sistémicas. Este método permite investigar lesión renal aguda en nefrología.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

Explorar más videos