El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en In Vitro modelos de cáncer

El objetivo general de este protocolo es investigar la asociación del splicing aberrante con perfiles de resistencia a fármacos en modelos in vitro de tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la farmacología molecular y la resistencia a la quimioterapia, como por ejemplo, ¿cuál es el mecanismo subyacente a la resistencia a los medicamentos a nivel postranscripcional? La principal ventaja de esta técnica es que combina un protocolo de cribado de citotoxicidad bien establecido con un potente análisis transcriptómico basado en la secuenciación de próxima generación.

Esta técnica podría conducir a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen al fracaso de la quimioterapia y mejorará la detección temprana de la resistencia a los fármacos. Este método puede proporcionar información sobre los determinantes de la resistencia a los fármacos en todo el genoma en modelos de líneas celulares. Pero también se puede aplicar a otros sistemas, como las muestras primarias de pacientes y los xenoinjertos.

La demostración de este procedimiento correrá a cargo de Johan Fomirno, técnico de nuestro laboratorio en el Centro Oncológico de Ámsterdam. Para realizar el ensayo MTT para células leucémicas, prepare una placa experimental de fondo plano de 96 pocillos. Dedicar pozos a concentraciones de fármacos para controlar células y para controlar medios sin células.

Prepare un rango de dilución del medicamento de dexametasona o dex. Agregue 30 microlitros de cada dilución dex en un pocillo apropiado de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de incluir cada concentración por triplicado.

Coseche células leucémicas de crecimiento exponencial y vuelva a suspenderlas a su concentración óptima de siembra. Agregue 120 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo que contenga la solución del medicamento o el medio de crecimiento, e incube a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Después de la etapa de incubación, agregue 15 microlitros de reactivo MTT a cada pocillo utilizando una pipeta repetitiva.

Agite el plato durante cinco minutos con un agitador de platos hasta un máximo de 900 batidos por minuto. Vuelva a colocar las placas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora de cultivos celulares e incube durante otras cuatro a seis horas. Después de la incubación, asegúrese de volver a suspender completamente los cristales de formazano, ya que los valores de absorbancia dependen de la solubilización adecuada del compuesto.

Agregue 150 microlitros de isopropanol acidificado a cada pocillo y mezcle bien con una pipeta multicanal para volver a suspender completamente todos los cristales de formazano. Usando un lector de microplacas, determine la densidad óptica o OD a 540 y 720 nanómetros para garantizar una medición precisa corrigiendo los antecedentes OD.To realizar un ensayo SRB para células de carcinoma de páncreas, prepare una placa experimental de fondo plano de 96 pocillos. Siembra células de carcinoma de páncreas que crecen en fase exponencial por triplicado en placas de fondo plano de 96 pocillos a la densidad adecuada en 100 microlitros de medio mediante el uso de una pipeta multicanal.

Agregue 100 microlitros de pocillos medianos a medianos y cocine durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono para garantizar la adhesión adecuada de las células a la placa. Agregue 100 microlitros de cada dilución en un pocillo apropiado de la placa de 96 pocillos mediante el uso de una pipeta multicanal. Asegúrate de tener cada concentración por triplicado.

Incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. A continuación, añada 25 microlitros de solución fría de TCA a los pocillos utilizando una pipeta multicanal. Incubar las placas durante al menos 60 minutos a cuatro grados centígrados para precipitar y fijar las proteínas en el fondo de los pocillos.

Vacíe el plato retirando el medio y séquelo brevemente sobre un pañuelo de papel. Lavar cinco veces con agua del grifo antes de vaciar la placa y secar a temperatura ambiente. Agregue 50 microlitros de solución de SRB por pocillo usando una pipeta repetitiva y tiña durante 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, vacíe la placa eliminando la mancha SRB. Después de lavar la placa cuatro veces con ácido acético al 1%, vacíe la placa y déjela secar a temperatura ambiente. Añadir 150 microlitros de solución de Tris por pocillo utilizando una pipeta multicanal y mezclar durante tres minutos en un agitador de platos hasta un máximo de 900 batidos por minuto.

Lea la densidad óptica a 540 nanómetros. Gire las muestras a 300 veces g durante tres minutos. Después de eliminar el sobrenadante, extraiga el ARNm total utilizando columnas de centrifugación de membrana de sílice disponibles en el mercado.

Determine la concentración y la pureza del ARN total mediante el uso de espectrofotómetro UV-Vis. Para preparar la biblioteca de secuenciación, utilice dos microgramos de ARNm total por muestra. Siga el protocolo de preparación de la biblioteca de ARNm de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Después de agrupar las bibliotecas en una sola muestra hasta una concentración final de 10 nanomoles por litro utilizando un bioanalizador, utilice un sistema de secuenciación de alto rendimiento con modo de par de bases de 100 lecturas únicas. Diseñe todos los cebadores como se describe en el protocolo de texto. Para la síntesis de ADNc de primera cadena, configure la transcripción inversa de un microgramo del ARN aislado a ADNc mediante el uso de 200 unidades por microlitro de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney en su tampón de reacción diluido de uno a cinco con agua estéril.

Para realizar la reacción RT-PCR, agregue un microlitro de ADNc a la mezcla de reacción de PCR y coloque los tubos en el termociclador. Ejecute el programa como se describe en el protocolo de texto. Después de la PCR, cargue las muestras en un gel de agarosa al 1% y haga funcionar el gel en tampón TBE a 100 voltios durante aproximadamente 30 minutos en un sistema de electroforesis.

Para evitar la contaminación cruzada, utilice las puntas de los filtros mientras realiza el ensayo qRT-PCR. Para realizar qRT-PCR, prepare la mezcla de reacción de PCR con verde de cianina para cada variante de empalme específica que se vaya a detectar, así como para el gen de mantenimiento. Cargue la mezcla maestra en una placa blanca de 96 pocillos y prepare duplicados para cada muestra.

Agregue cinco microlitros de ADNc diluidos 10 veces en agua a cada mezcla antes de colocar la placa en el termociclador. Aquí se muestran las curvas de inhibición del crecimiento determinadas por el ensayo MTT para células leucémicas y el ensayo SRB para células de carcinoma pancreático. Las curvas de las células resistentes a la dexametasona y a la gemcitabina se desplazan hacia la derecha, lo que indica una inhibición del crecimiento en comparación con las células sensibles parentales.

La concentración y la calidad de las bibliotecas de ADNc para todas las líneas celulares se determinan con un chip de ADN bioanalizador. Los electroferogramas muestran picos de fluorescencia en aproximadamente 300 pares de bases, lo que es indicativo de buena calidad para el procedimiento de secuenciación de ARN posterior. Las lecturas cortas del gen candidato DDX5 se pueden visualizar como gráficos de Sashimi donde las líneas de conexión representan uniones de empalme.

La transcripción de DDX5 muestra un uso diferencial de las células de tipo salvaje CEM/R30dm del exón 12 y CEM y CEM en comparación con las líneas celulares resistentes a los glucocorticoides, CEM-C3 y CEM-R5. Los resultados de la secuenciación de ARN se validan mediante la realización de RT-PCR en genes seleccionados para los que los cebadores se emparejan y ceden el rendimiento a los exones ubicados aguas arriba y aguas abajo del exón empalmado alternativamente. Aquí se muestra el empalme diferencial del gen DDX5.

La cuantificación de transcripciones empalmadas diferencialmente a través del ensayo qRT-PCR utilizando cebadores inversos específicos de isoformas confirma la regulación negativa específica de la variante de empalme del exón 12 delta de DDX5 y una sublínea específica resistente a los glucocorticoides. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras de ARN en hielo para evitar la degradación.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la sobreexpresión ectópica de una nueva variante de empalme. Esto responderá a preguntas adicionales como el impacto funcional del perfil de empalme alternativo en la resistencia a los medicamentos. Esta técnica puede allanar el camino para que las investigaciones en el campo de la farmacología molecular exploren los determinantes de la resistencia a los medicamentos en todo el genoma.