Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras con un número de células bajo para realizar análisis TEM de manera eficiente y reproducible. Este método puede ayudar a revelar todas las estructuras de las células reales y una mejor configuración fisiológica en el campo biomédico. La principal ventaja de esta técnica es que tanto los resultados cualitativos como cuantitativos se pueden obtener a partir de un número bajo de células de forma reproducible.

Para empezar, utilice datos para clasificar 10.000 células madre hematopoyéticas, o HSC, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Contiene 600 microlitros de medio dulbecco modificado isocoves con 10%FBS. Usando una centrífuga con cubos abatibles, gire los HSC clasificados a 1.000 veces G durante 10 minutos.

Utilice la aspiración gentil para eliminar todos menos 200 microlitros del medio. Para fijar las células, añadir 0,2 mL de solución fijadora dos X recién preparada, e incubar a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, agregue 600 microlitros de tampón de cacodilato 0,1 molar para lavar las células.

Vuelve a centrifugar las células, esta vez a 30 grados centígrados. Luego, después de la centrifugación, y eliminando todos menos 200 microlitros de tampón, agregue 200 microlitros de dos miligramos por mililitro de azul evans en tampón de cacodilato e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para teñir las células. Utilice 600 microlitros de tampón de cacodilato 0,1 molar para lavar las células tres veces.

A continuación, vuelva a suspender las células en los 200 microlitros restantes de tampón antes de transferir la suspensión de la célula a un tubo de 0,5 ml. En este paso, el pellet debe ser visible en el tubo. Con una centrífuga de mesa, haga girar las células a 1.000 veces G durante 10 minutos.

A continuación, retire suavemente el tampón sin alterar el pellet de celda diminuta ahora visible, dejando 50 microlitros de tampón en el tubo. Prepare una solución de agarosa al 4%, añadiendo 200 miligramos de agarosa de bajo punto de fusión a cinco mililitros de tampón de cacodilato 0,1 molar en un tubo de 15 mL. Derrita la agarosa transfiriendo el tubo a agua hirviendo en una botella de vidrio de 100 ml.

Añadir 200 microlitros de la solución de agarosa al tubo de la suspensión celular. Centrifugar inmediatamente a 1.000 veces G y a 30 grados centígrados durante 10 minutos. Después de confirmar que las células se granularon en la agarosa semisólida en el fondo del tubo, transfiera inmediatamente el tubo a cuatro grados centígrados, o hielo, durante 20 minutos para solidificar la agarosa.

Con una aguja de calibre 27, transfiera con cuidado la agarosa solidificada, que contiene el pellet de celda, a una placa de Petri de plástico de 35 ml que contiene 0,1 tampón de cacodilato molar. Con un recorte de bisturí, la agarosa solidificada que contiene la célula se forma en una sola pieza de aproximadamente uno o dos milímetros. A continuación, transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 ml.

Añadir 600 microlitros de tampón de cacodilato 0,1 molar y lavar el pellet de célula de agarosa utilizando una pipeta para añadir y retirar el tampón. Retire el tampón del pellet de celda de agarosa y en una campana extractora, mientras usa ropa protectora y guantes, agregue un mililitro de solución de tetróxido de osmio al 1%. Incubar el pellet de la célula a cuatro grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación, lave la muestra tres veces. Transfiéralo a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml con tapón. A continuación, deshidrate la muestra utilizando una serie de etanol.

A continuación, infiltre la muestra en concentraciones crecientes de resina LX 112 en etanol antes de incubar en resina al 100% dos veces durante 60 minutos cada vez. Con pinzas, transfiera con cuidado la muestra a la parte inferior de un molde de goma en forma de punta piramidal y agregue resina pura encima de la muestra para llenar el molde. Incubar la muestra a 60 grados centígrados durante 72 horas para polimerizar la resina.

Cuando la resina esté polimerizada, retírela de los moldes girando el molde de goma. Un pequeño grupo negro de células debe ser visible en la pirámide de resina polimerizada. Utilice cianoacrilato para fijar la pirámide de resina polimerizada a un cilindro de montaje para seccionar.

Después de montar el bloque en un ultramicrótomo, use una hoja de afeitar y un cuchillo de diamante para recortar el bloque piramidal, haciendo una forma trapezoidal corta y ancha con la parte superior e inferior del bloque paralelas entre sí, y con lados inclinados uniformemente. Luego use el cuchillo de diamante para recortar el bloque alrededor de la paleta de celda y retire las secciones de plástico alrededor de la pieza de agarosa de la celda de pellet. Con el ultramicrótomo, corte secciones de un micrómetro y use una herramienta de pestañas y un lazo de metal para mover las secciones del bote de agua a un portaobjetos de vidrio.

A continuación, coloque los portaobjetos en una placa calefactora a 37 grados centígrados para que se sequen. Con una jeringa con un filtro de 0,22 micrómetros, agregue una gota de solución de azul de teluatina a las secciones e incube durante tres minutos. Luego, con agua destilada, levante los portaobjetos y deje que las secciones se sequen.

Después del secado, revise las secciones bajo un microscopio óptico para identificar la posición de las células. A continuación, utilice un cuchillo de diamante para cortar secciones ultrafinas. Luego, con una herramienta para pestañas, mueva dos o tres secciones en 200 rejillas de malla desde el bote de agua y colóquelas en una placa de Petri de vidrio.

Transfiera el plato con rejillas a una placa caliente a 30 grados centígrados durante 30 minutos para secar las secciones. Agregue gotas de acetato de uranilo al 1% e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para manchar las rejillas. Luego, use agua destilada para enjuagar de seis a ocho veces.

Teñir con citrato de plomo Reynolds a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de enjuagar de seis a ocho veces. Transfiera la placa de Petri de vidrio que contiene las rejillas a una placa caliente a 37 grados centígrados para secar las secciones. Por último, analice las secciones con un microscopio electrónico a 87 kilovoltios.

Aquí se muestran con bajo aumento secciones semifinas teñidas con azul de toluidina de bloques que contienen una pequeña bolita de células que confirman un grupo de células. Esta imagen de mayor aumento muestra la morfología intacta de las células. Esta figura representa un campo de visión general del grupo de células de secciones ultradelgadas que se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se analizaron mediante microscopía electrónica.

Aquí se muestra un solo HSC, lo que demuestra que la morfología y la ultraestructura de las células estaban bien conservadas. Una micrografía electrónica altamente detallada de un HSC individual muestra las ultraestructuras intracelulares. Además, las imágenes de gran aumento capturaron la estructura bien conservada y la integridad de los orgánulos subcelulares, como las mitocondrias.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco o seis horas, y para la tinción azul avanzada y la inclusión de agarosa, y luego el procesamiento normal de TEM tomará de cinco a seis días si se realiza correctamente. Entonces, después de ver este video, tiene una buena comprensión de cómo preparar muestras a partir de la preparación de células reales para el análisis TEM.