Name: Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a preparar muestras con bajo número celular para microscopía electrónica de transmisión (TEM) usando células madre hematopoyéticas. Este método eficiente permite obtener resultados cualitativos y cuantitativos reproducibles.

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Agradecemos al Núcleo de Investigación de Patología por su ayuda con los estudios de análisis de microscopio electrónico en el Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati. El trabajo fue apoyado por los NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 a MDF).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité institucional de los animales en la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati. Para este estudio, se aislaron células madre hematopoyéticas de la médula ósea de ratones C57BL / 6 ratones endogámicos de entre 2 - 4 meses. Clasificación de células mediante FACS después de la tinción de BM con diferentes fabricantes de superficie incluyendo Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 y CD34 se utilizó para la purificación de HSC basado en Flt3 Lin- Sca-1 + c-Kit + - estrategia gating - CD34 como protocolo estándar descrito antes de las 8. PRECAUCIÓN: Varios productos químicos altamente tóxicos se utilizan durante este procedimiento. Estos son tóxicos por inhalación y contacto con la piel. Por favor, use guantes y ropa de protección. Trabajar en campana de humos mientras se trabaja con estos productos químicos. 1. células, la fijación, tinción y Pre-incrustación <ol><li> Ordenar 10.000 células madre hematopoyéticas (utilizando Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating estrategia; población LT-HSC) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 600 l de modificación de Dulbecco de Iscove Medio (IMDM) con suero bovino fetal al 10% usando FACS. </li><li> Centrifugar las CMH ordenados a 1.000 xg durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una centrífuga con cubos que oscila hacia afuera. Retire medio por aspiración suave y dejar 200 l de medio en los tubos en cada paso. En esta etapa, el sedimento celular permanece invisible en el tubo. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 0,2 ml de solución de fijación 2x a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora 1,9. <ol><li> Hacer la solución de fijación fresca antes de su uso. En 1x, la solución se compone de 3% de paraformaldehído y 2,5% de glutaraldehído en tampón de cacodilato 0,1 M. </li></ol></li><li> Centrifugar las células a 1000 xg durante 10 minutos a 30 ° C utilizando una centrífuga con cubos basculante. </li><li> Lavar las células con 600 l de tampón de 0,1 M de cacodilatousando centrifugación y dejar tampón de 200 l en el tubo después de la centrifugación. </li><li> Tinción de las células fijadas mediante la adición de 200 l de solución / ml 2 mg de azul de Evans en tampón cacodilato y se incuba durante 20 min a TA. Las células serán de color azul. </li><li> Lavar las células 3 veces con 600 l de tampón de cacodilato 0,1 M usando centrifugación y dejar tampón de 200 l en el tubo cada vez. </li><li> Vuelva a suspender las células en tampón de 200 l y transferir la suspensión celular a un tubo de 0,5 ml. Centrifugar a 1000 xg durante 10 min utilizando una centrífuga de mesa. Eliminar el tampón suavemente sin alterar el sedimento celular pequeña ahora visible, y dejar tampón de 50 l en el tubo. </li><li> Añadir 200 mg bajo punto de fusión de agarosa para 5 ml de tampón de cacodilato 0,1 M en el tubo de 15 ml de una solución de agarosa al 4%. Fundir la agarosa mediante la transferencia del tubo de agua hirviendo en una botella de vidrio de 100 ml y mantener tibia hasta que se usaron. </li><li> Añadir 200 l de 4% de agarosa de baja fusión disolvieron en 0,1 M cacodylatampón TE a la suspensión celular en un tubo de 0,5 ml e inmediatamente se centrifuga a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C usando una centrífuga de mesa. </li><li> Después de confirmar que las células sedimentaron en el fondo del tubo de 0,5 ml en la agarosa semisólida después de la centrifugación, transferir inmediatamente el tubo a 4 ° C o de hielo durante 20 min para solidificar la agarosa. Este paso es muy crítico, ya que un pequeño sedimento celular visible en este paso resulta en un buen grupo de células bajo el microscopio electrónico. </li><li> Transferir con cuidado la agarosa solidificada que contiene el sedimento celular del tubo de plástico a un plato de 35 mm de Petri que contenía tampón utilizando un G 3,10 27 aguja. </li><li> Recortar los agarosa solidificada que contiene el sedimento celular en una sola pieza de aproximadamente 1 - 2 mm con un bisturí. La transferencia de la pieza de agarosa que contiene el sedimento celular a un nuevo tubo de 1,5 ml. </li><li> Lavar 2 - 3 veces con 600 l de tampón cacodilato 0,1 M mediante la adición y la eliminación de buffer usando la pipeta sin centrifugación. Utilice esta pieza de agarosa que contiene el sedimento celular para el siguiente paso. En este paso, la muestra se puede almacenar a 4 ° C durante la noche antes de pasar al siguiente paso. </li></ol> 2. Osmification, deshidratación, incrustación <ol><li> Eliminar el tampón de cacodilato desde el tubo de 1,5 ml con el sedimento celular que contiene agarosa usando una pipeta. Añadir 1,0 ml de 1% tetraóxido de osmio (OsO4) de solución en una campana de humos, y se incuba durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Lavar tres veces con 600 l de tampón de cacodilato 0,1 M y transferir la muestra a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml con una tapa. </li><li> Procesar la muestra para la deshidratación, la infiltración y la incrustación en resina (por ejemplo, LX-112) con los cambios de serie de las siguientes soluciones en una placa de 6 pocillos. Mover la pieza de agarosa por células de pellets con unas pinzas. <ol><li> Sumergir la muestra en 25% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en 50% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en el 75%etanol a TA durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en 95% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Sumergir la muestra en 100% de etanol a temperatura ambiente durante 15 min, dos veces. </li><li> Sumergir la muestra en etanol: resina (3: 1) a TA durante 30 min. </li><li> Sumergir la muestra en etanol: resina (1: 1) a TA durante 30 min. </li><li> Sumergir la muestra en etanol: resina (1: 3) a TA durante 30 min. </li><li> Sumergir la muestra en resina pura a temperatura ambiente durante 60 min, dos veces. </li></ol></li><li> Transferir la muestra a la parte inferior de la punta de la pirámide molde de goma en forma de uso de fórceps con cuidado y añadir la resina más pura en la parte superior de la muestra para llenar el molde. Incubar la muestra a 60 ° C durante 72 hr para la polimerización de la resina. </li><li> Retire la pirámide resina polimerizada de los moldes girando el molde de goma. Un pequeño grupo de células negro debe ser visible en la pirámide de resina polimerizada, como se ha descrito anteriormente 7. Coloque la pirámide de resina polimerizada en el cilindro de montaje con cianoacrilato. </li></ol><ol><li> Recorte el bloque de pirámide con una hoja de afeitar y un cuchillo de diamante después de montar el bloque en un ultra-micrótomo. Hacer una forma trapezoidal ancha corta con la parte superior y la parte inferior del bloque en paralelo entre sí, y con los lados de manera uniforme en ángulo. Esta forma de la pirámide ayuda de cortes seriados. </li><li> Además, recortar el bloque de todo el sedimento celular con el bisturí de diamante y quitar las secciones de plástico alrededor de la pieza de agarosa al sedimento celular. </li><li> Cortar 1 micras secciones usando un ultra-micrótomo. Mover las secciones 1 m desde el barco del agua a un portaobjetos de vidrio utilizando una herramienta de pestañas y una herramienta de lazo de metal como se informó anteriormente 7. secciones de transferencia de diapositivas y diapositivas de transferencia a la placa caliente (37 ° C) para el secado. </li><li> Añadir una gota de solución de azul de toluidina a las secciones utilizando una jeringa equipada con 0,22 micras filtro y se incuba durante 3 min. Enjuague los portaobjetos con agua destilada y ly las secciones se sequen. Consulte con un microscopio de luz para identificar la posición de las células. </li><li> Los cortes de secciones ultrafinas (70 - 100 nm) utilizando un cuchillo de diamante. Mueve 2 - 3 secciones en las redes de malla 200 de la embarcación del agua a un plato de Petri de vidrio usando una herramienta de pestañas. </li><li> Transferir el cristal placa de Petri que contiene cuadrículas con secciones de una placa caliente a 30 ° C para secar las secciones durante 30 minutos. </li><li> Tinción de las rejillas con gotas de acetato de uranilo al 1% a temperatura ambiente durante 10 min y luego enjuague en agua destilada 6 - 8 veces. Mancha con citrato de plomo de Reynolds, a TA durante 5 min y enjuague en agua destilada 6 - 8 veces. Transferir el cristal placa de Petri que contiene las cuadrículas en una placa caliente a 37 ° C para secar las secciones. </li><li> Analizar las secciones con un microscopio electrónico, a 80 kV 7. </li></ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
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<li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
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<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método permite el análisis TEM de bajo número de células, mediante el uso de la tinción de azul de Evans y la incrustación de agarosa para localizar un pequeño sedimento celular durante la deshidratación, la incrustación de resina y los procesos de corte. Es importante destacar, que mantiene juntos los grupos de células y preserva la ultra-estructura de la célula, que es deseable para examinar células múltiples para la cuantificación de datos. En estudios TEM, a menudo se requiere un se...

Detalles-Ultra estructurales y sub-orgánulos de células se han puesto de manifiesto principalmente por microscopía electrónica de transmisión (TEM) estudios de tejidos o sedimentos celulares 1,2. piezas sólidas de tejidos se pueden utilizar fácilmente para estudios de microscopía electrónica. Sin embargo, los análisis de TEM 1,3 en las células en suspensión siguen siendo difíciles y requieren altos números de células, es decir, millones de células. Debido a esto, los análisis ultra-estructurales de las poblaciones de células raras en suspensión, por ejemplo, células madre hematopoyéticas (HSC), no son evaluados fácilmente. Múltiples intentos para el análisis de TEM de las muestras de los escasos utilizando cytospin o monocapa enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativa del número limitado de células. Por lo tanto, el requisito de un número alto de células limita el uso de esta potente herramienta para entender los detalles ultraestructurales subcelulares de las poblaciones de células raras. Una limitación clave para los estudios TEM con un número limitado de célulass en suspensión es la localización de las células para el procesamiento y, por tanto, los estudios de TEM de las células limitadas con particular tamaños pequeños siguen siendo difíciles. Varios enfoques alternativos se han adoptado para hacer frente a esta limitación: la BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerización mediada por la suspensión celular, la tinción de las células con un tinte para que sean visibles en un soporte de película delgada incluyendo cubreobjetos, y análisis TEM de las preparaciones de citospina 4-6. Sin embargo, se logró un éxito muy limitado, como se encontraron muy pocas células en secciones después de ultra-seccionamiento. El desafío clave de identificación de células dispersas persiste debido a la monocapa de células se mantiene prácticamente invisible en el gel solidificado para seccionar. Además, la preparación de citospina de células puede alterar su organización celular debido a la propagación de células y la fragilidad de la estructura celular. Por lo tanto, estos inconvenientes inherentes justifican un enfoque novedoso para llevar a cabo estudios de TEM de las poblaciones de células raras con másconsistencia. Para superar este problema, hemos descrito un método nuevo y preparación de la muestra alternativa para los estudios de TEM de las poblaciones de células raras 7. Aquí, se presenta un protocolo de preparación de muestras eficiente para llevar a cabo TEM de las muestras biológicas con escasos resultados cualitativos y cuantitativos consistentes. Evans tinción con azul se llevó a cabo después de la fijación para localizar un pequeño sedimento celular a partir de células de bajo número, es decir, 10.000 médula ósea madre hematopoyéticas y células progenitoras que de otro modo habrían permanecido invisible, y el sedimento se incrusta en agarosa antes de procesos de deshidratación y de la resina de inclusión. Este método agrupa las células juntos y permite el análisis eficaz de la ultraestructura y organización subcelular de las células madre hematopoyéticas (identificado como Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -; HSC), una rara 0,2 - población de células 0,5% en la médula ósea. Este pro experimentaltocol puede ser útil para llevar a cabo estudios de ultra-estructurales y obtener resultados cuantitativos en muchas poblaciones raras pero altamente importantes.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído 20% Acuoso Soln</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15713</td><td><fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte> Tóxico por inhalación, contacto con la piel. Use guantes, use campana extractora.</td></tr><tr><td>Gluteraldehído 70% Acuoso Soln</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>16350</td><td><fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte> Tóxico por inhalación, contacto con la piel. Use guantes, use campana extractora.</td></tr><tr><td>Tampón de cacodiladado&nbsp;</td><td>Ciencia de la microscopía electrónica</td><td>12300</td><td>Prepare un tampón de cacodiladato de 0,1 M (pH 7,4) en agua destilada, guárdelo a 4 °C. <fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte> Irritante por inhalación o contacto con la piel, use guantes y trabaje en la campana extractora.</td></tr><tr><td>Evans Azul &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Tetraóxido de osmio</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>19130</td><td>1 g en 50 ml de tampón de cacodiladato de 0,1 M para hacer un 2% de OsO4, <fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte> Muy tóxico por inhalación o contacto con la piel, oxidante fuerte, use ropa protectora, protección para los ojos, use campana extractora.</td></tr><tr><td>LX-112 Kits de incrustación (LADD&reg;)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (anhídrido dodecenilsuccínico)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mezcle 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 y luego agregue 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (anhídrido de metilo nádico)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Resinas epoxi Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td><fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte> Tóxico por inhalación, contacto con la piel. Use guantes, ropa protectora, use una campana extractora.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetilaminometil)fenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo Reynolds (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td><fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte> Tóxico por inhalación, evite el contacto con la piel o los ojos.</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td><fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte> Tóxico por inhalación, evite el contacto con la piel o los ojos.</td></tr><tr><td>Medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composición: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucosa, Ca, Mg, piruvato de césped etc. Para detalles https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Molde de punta piramidal&nbsp;</td><td>Cilindros de montaje Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtomo&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 rejillas de malla (nikil)</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico</td><td>Hitachi modelo H-7650&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de motor de captura</td><td>de imágenes AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico de 35 mm</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super pegamento Cianoacrilato&nbsp;</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar Viales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de centelleo de vidrio&nbsp;</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td>de pestañas</tr><tr><td>Herramienta de bucle de metal&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis tem

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporciona detalles de la organización celular y ultraestructura. Sin embargo, el análisis de TEM de las poblaciones de células raras, especialmente células en suspensión, tales como células madre hematopoyéticas (HSC), sigue siendo limitada debido a la exigencia de un número de células de alta durante la preparación de la muestra. Hay algunos enfoques Cytospin o monocapa para el análisis TEM de las muestras de los escasos, pero estos enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativos a partir del número limitado de células. Aquí, se describe un enfoque alternativo y novedoso para la preparación de muestras en los estudios TEM para poblaciones de células raras que permite el análisis cuantitativo. Un número relativamente bajo de células, es decir, 10.000 HSC, se utilizó con éxito para el análisis de TEM en comparación con los millones de células utilizadas normalmente para estudios de TEM. En particular, la tinción de azul de Evans se realizó después de paraformaldehído-glutaraldehído fijación (PFA-GA) para visualizar la pequeña pel celulardejar, lo que facilitó la incorporación de agarosa. No se observaron agrupaciones de numerosas células en cortes ultrafinos. Las células tenían una morfología bien conservada, y los detalles ultra-estructurales de la mitocondria complejos y varios de Golgi eran visibles. Este protocolo eficiente, fácil y reproducible permite la preparación de muestras de un número bajo de células y se puede utilizar para el análisis TEM cualitativa y cuantitativa sobre las poblaciones de células raras de muestras biológicas limitados.

Un protocolo eficiente y consistente para la preparación de muestras para realizar análisis de TEM se describe de bajo número de células. Tinción posterior a la fijación con azul de Evans y la transferencia de las células a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml ayudó a visualizar el pequeño sedimento celular 7. Osmification con tetraóxido de osmio en agarosa condujo a una fácil detección del sedimento celular oscuro durante la deshidratación y la incrustación. <p class="jov...

Aquí, presentamos un protocolo para preparar muestras con números de celdas bajos para el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras con un bajo número de células para realizar análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) de manera eficiente y reproducible. Este método puede ayudar a revelar todas las estructuras de células reales y condiciones fisiológicas más cercanas a la realidad en el campo biomédico. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden obtener resultados tanto cualitativos como cuantitativos a partir de un bajo número de células de forma reproducible.Para comenzar, utilice un citómetro de flujo para separar 10.000 células madre hematopoyéticas, o CMH, en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL que contenga 600 microlitros de medio de Iscoves modificado de Dulbecco con 10 % de FBS. Usando una centrífuga con rotor de balanceo, centrifugue las CMH separadas a 1.000 × g durante 10 minutos.Utilice aspiración suave para eliminar todo el medio excepto 200 microlitros. Para fijar las células, agregue 0,2 mL de una solución fijadora recién preparada al doble de concentración (2X) e incube a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, agregue 600 microlitros de tampón cacodilato 0,1 molar para lavar las células.Centrifugue las células nuevamente, esta vez a 30 grados Celsius. Luego, tras la centrifugación y después de eliminar todo el tampón excepto 200 microlitros, agregue 200 microlitros de azul de Evans a dos miligramos por mililitro en tampón cacodilato, e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para teñir las células. Use 600 microlitros de tampón cacodilato 0,1 molar para lavar las células tres veces.Luego, resuspenda las células en los 200 microlitros restantes de tampón antes de transferir la suspensión celular a un tubo de 0,5 mL. En este paso, el precipitado debe ser visible en el tubo. Con una centrífuga de banco, centrifugue las células a 1.000 ×g durante 10 minutos.Luego, retire suavemente el tampón sin perturbar el pequeño pellet celular ahora visible, dejando 50 microlitros de tampón en el tubo. Prepare una solución de agarosa al 4 %, agregando 200 miligramos de agarosa de baja fusión a cinco mililitros de tampón cacodilato 0,1 molar en un tubo de 15 mL. Derrita la agarosa transfiriendo el tubo al agua hirviendo en un frasco de vidrio de 100 mL.Añada 200 microlitros de la solución de agarosa al tubo de la suspensión celular. Centrifugue inmediatamente a 1.000 ×g y 30 grados Celsius durante 10 minutos. Después de confirmar que las células se han sedimentado en la agarosa semisólida en el fondo del tubo, transfiera inmediatamente el tubo a cuatro grados Celsius, o hielo, durante 20 minutos para solidificar la agarosa.Usando una aguja de 27 gauge, transfiera cuidadosamente el agarosa solidificado, que contiene el sedimento celular, a una placa de Petri plástica de 35 mL que contenga tampón cacodilato 0,1 molar. Con un escalpelo, corte el agarosa solidificado que contiene el sedimento celular en un solo trozo de aproximadamente uno a dos milímetros. Luego, transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mL.Añada 600 microlitros de tampón cacodilato 0,1 molar y lave el pellet celular de agarosa utilizando una pipeta para añadir y retirar el tampón. Retire el tampón del pellet celular de agarosa y, en una campana extractora, utilizando ropa protectora y guantes, añada un mililitro de solución de tetraóxido de osmio al 1%. Incube el pellet celular a cuatro grados Celsius durante una hora.Después de la incubación, lave la muestra tres veces. Trasfiera la muestra a un vial de vidrio de 20 mL con tapa. A continuación, deshidrate la muestra utilizando una serie de etanol.Luego, infiltre la muestra con concentraciones crecientes de resina LX 112 en etanol antes de incubarla dos veces en resina al 100 % durante 60 minutos cada vez. Utilizando pinzas, transfiera cuidadosamente la muestra al fondo de un molde de goma con forma de punta de pirámide y añada resina pura encima de la muestra para llenar el molde. Incube la muestra a 60 grados Celsius durante 72 horas para polimerizar la resina.Una vez que la resina esté polimerizada, retírela de los moldes girando el molde de goma. Debe ser visible un pequeño grupo negro de células en la pirámide de resina polimerizada. Utilice cianoacrilato para fijar la pirámide de resina polimerizada sobre un cilindro de montaje para el corte en secciones.Después de montar el bloque en un ultramicrotomo, utilice una cuchilla de afeitar y un cuchillo de diamante para recortar el bloque piramidal, formando una figura trapezoidal corta y ancha con la parte superior e inferior del bloque paralelas entre sí, y con los lados uniformemente angulados. A continuación, use el cuchillo de diamante para recortar el bloque alrededor del pellet celular y retire las secciones de plástico alrededor del trozo de agarosa con el pellet celular. Con el ultramicrotomo, corte secciones de un micrómetro y utilice una herramienta de pestaña y un asa metálica para transferir las secciones desde la cubeta de agua hasta un portaobjetos de vidrio.Luego, coloque los portaobjetos sobre una placa calefactora a 37 grados Celsius para secarlos. Utilizando una jeringa con un filtro de 0,22 micrómetros, agregue una gota de solución de azul de toluidina a las secciones e incube durante tres minutos. A continuación, enjuague los portaobjetos con agua destilada y deje secar las secciones.Después del secado, revise las secciones bajo un microscopio óptico para identificar la posición de las células. A continuación, use un cuchillo de diamante para cortar secciones ultradelgadas. Luego, con una herramienta de pestaña, transfiera de dos a tres secciones a rejillas de 200 mallas desde la cubeta de agua y colóquelas en una placa de Petri de vidrio.Transfiera el recipiente con rejillas a una placa calefactora a 30 grados Celsius durante 30 minutos para secar las secciones. Añada gotas de acetato de uranilo al 1 % y incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para teñir las rejillas. Luego, use agua destilada para enjuagar de seis a ocho veces.Tiña con citrato de plomo de Reynolds a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de enjuagar de seis a ocho veces. Transfiera la placa de vidrio que contiene las rejillas a una placa calefactora a 37 grados Celsius para secar las secciones. Finalmente, analice las secciones con un microscopio electrónico a 87 kilovoltios.Se muestran aquí a baja magnificación secciones semifinas teñidas con azul de toluidina procedentes de bloques que contienen un pequeño pellet celular, lo que confirma un grupo de células. Esta imagen de mayor aumento muestra la morfología intacta de las células. Esta figura representa un campo general del grupo celular a partir de secciones ultradelgadas teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y analizadas mediante microscopía electrónica.Se muestra aquí una única CTH, lo que demuestra que la morfología y la ultraestructura de las células se conservaron adecuadamente. Una micrografía electrónica de mayor aumento muestra con gran detalle las ultraestructuras intracelulares de una CTH individual. Además, imágenes de alto aumento capturaron con buena definición la estructura y la integridad de orgánulos subcelulares, como las mitocondrias.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco a seis horas, y para la tinción azul avanzada, el embebido en agarosa y el posterior procesamiento normal de MET, se requieren de cinco a seis días si se realiza adecuadamente. Así que, tras ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo preparar muestras a partir de células reales para el análisis por MET.

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Investigación

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