Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

El objetivo general de este procedimiento es preparar simulacros emparejados por edad y pasaje en células endoteliales infectadas con KSHV para permitir el estudio de los cambios asociados a KSHV en la expresión génica de la célula huésped, incluidas las alteraciones que impulsan la transformación maligna en el contexto de controles apropiados. Este método puede ayudar a definir los cambios fisiopatológicos clave en la biología de la célula huésped que conducen a cánceres asociados al KSHV, identificando así nuevos objetivos terapéuticos para la prevención o el tratamiento de enfermedades. La principal ventaja de este sistema es que la transformación maligna de las células endoteliales tras la infección por KSHV se produce de forma rápida y reproducible, lo que permite el estudio de eventos tempranos en el proceso oncogénico con células control emparejadas por edad y paso.

Aunque este modelo de oncogénesis viral puede proporcionar información sobre el desarrollo del sarcoma de Kaposi, también se puede aplicar a otros tipos de cáncer. Debido a que el sarcoma de Kaposi es un tumor vascular, las implicaciones de este modelo de cultivo celular se extienden hacia la comprensión de otros procesos patológicos impulsados por la angiogénesis patológica. Para empezar, prepare y filtre el tampón TNE esterilizado como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, almacene la solución a cuatro grados centígrados. Cultivo de la línea celular BCBL-1 de linfoma con derrame primario positivo para VEB positivo para KSHV en un matraz T150 lleno de 60 mililitros de medio RPMI. Mantenga las celdas a 37 grados centígrados 5% de dióxido de carbono para obtener una suspensión de aproximadamente 1 a 1,2 veces 10 a la sexta celdas por mililitro.

Una vez que se alcanza la densidad adecuada, divida las celdas de una en dos con medio fresco y agregue PMA a una concentración final de 20 nanogramos por mililitro para inducir la producción de KSHV. A continuación, incubar los cultivos durante cinco días. Después de cinco días de incubación, recoja las partículas virales haciendo girar las suspensiones celulares a 300 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo. Centrifugar los sobrenadantes una vez más a 2.500 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. Ahora que se ha aclarado, superponga cinco mililitros de solución de sacarosa al 25% en TNE con aproximadamente 30 mililitros del sobrenadante en seis tubos de ultracentrífuga.

Centrifugar los tubos equilibrados a 75.000 veces g durante dos horas a cuatro grados centígrados al vacío. Una vez completada la centrifugación, decantar el sobrenadante y secar el borde de cada tubo para eliminar la mayor cantidad de líquido posible. A continuación, vuelva a suspender el virus peletizado en 150 microlitros de tampón TNE y agrupe todas las muestras.

Mezclar bien la suspensión agrupada y dividirla en alícuotas de 25 microlitros. Almacene el virus en stock a menos 80 grados centígrados. Cultivo de células endoteliales dérmicas primarias, microvasculares o linfáticas humanas en medio EGM en un matraz T75.

Mantener el cultivo celular a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono hasta alcanzar aproximadamente el 50% de confluencia. Antes de la transducción de células endoteliales, cultive células PA317 LXSN 16E6E7 en un matraz de cultivo celular T150 lleno de 20 mililitros de DMEM a 37 grados Celsius 5% de dióxido de carbono. Una vez que se haya logrado aproximadamente el 90% de confluencia, reemplace el medio del cultivo celular PA317 con 16 mililitros de medio fresco e incube las células durante la noche.

Después de una incubación nocturna, recoja el medio del cultivo celular PA317 y clarícelo por centrifugación a 300 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Reemplace el medio EGM de un cultivo de células endoteliales confluentes al 50% con 12 mililitros del medio PA317 clarificado. Incuba las células durante cuatro horas.

A continuación, sustituya seis mililitros del medio PA317 por seis mililitros de medio EGM fresco e incube las células durante la noche. A continuación, retire el medio del cultivo de células endoteliales y alimente las células con 12 mililitros de EGM fresco. Continúe incubando las células durante 48 horas adicionales.

Para subcultivar células endoteliales, retire el medio y lave las células con 12 mililitros de PBS libre de cationes. A continuación, añada tres mililitros de una solución comercial de disociación enzimática e incube las células a 37 grados centígrados durante tres minutos. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las celdas a 300 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Una vez peletizadas, vuelva a suspender las células en medio EGM fresco y divida la suspensión uniformemente en tres matraces T75. Ajustar el volumen de los cultivos a 12 mililitros de EGM por matraz. A continuación, añada 200 microgramos por mililitro de G418 para seleccionar las células endoteliales transducidas.

Recolectar las células endoteliales transducidas por digestión enzimática como se mostró anteriormente. Resuspender el pellet de células endoteliales en un mililitro de medio EGM. A continuación, mezcle cinco microlitros de la suspensión celular con 45 microlitros de solución azul de tripano y cuente las células viables con un hemocitómetro.

Siembre 2.5 veces 10 a la quinta celda viable en dos mililitros de medio EGM por pocillo de una placa de seis pocillos. Al día siguiente, retire el medio EGM y lave las células de cada pocillo con tres mililitros de PBS con calcio y magnesio. A continuación, añada dos mililitros de medio EBM a cada pocillo.

Para infectar las células con KSHV, agregue de cinco a 20 microlitros de caldo de virus a cada pocillo y agite la placa para mezclar las suspensiones. Agregue un volumen igual de tampón TNE a cada pocillo que contenga células infectadas simuladas. Después de centrifugar la placa a 400 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente, incubarla a 37 grados centígrados durante 90 minutos.

A continuación, añada dos mililitros de medio EGM a cada pocillo e incube los cultivos durante la noche. Después de la incubación, retire el medio EGM de cada pocillo y reemplácelo con dos mililitros de EGM fresco. Cuando las células alcancen una confluencia de aproximadamente el 90%, recójalas por digestión enzimática como se mostró anteriormente.

Agrupe las células de tres pocillos en un matraz T75 marcado con el número total de pasajes en el pasaje después de la infección. Antes de realizar la prueba o congelar, amplíe los cultivos de células endoteliales simuladas e infectadas con KSHV dividiéndolos de uno a tres durante al menos dos pasos adicionales. Aquí se presenta una imagen microscópica de células endoteliales infectadas simuladas confluentes que revelan la apariencia clásica de adoquín.

La división celular en estas células se inhibe al contacto cuando el cultivo alcanza la confluencia. Las células endoteliales infectadas por KSHV desarrollan una morfología alargada en forma de huso que recuerda a las células fusiformes del sarcoma de Kaposi. A diferencia de las células infectadas simuladamente, las células endoteliales infectadas con KSHV continúan proliferando incluso cuando alcanzan la confluencia, lo que lleva al desarrollo de focos celulares de múltiples capas.

Al perder el contacto con el sustrato, las células endoteliales infectadas simuladamente sufren una muerte celular apoptótica, anoikis, además de que no forman colonias en agar blando. Por el contrario, las células infectadas por KSHV son resistentes a los anoikis y a las colonias en crecimiento cuando se cultivan en agar blando. El desarrollo de la morfología fusiforme en las células endoteliales infectadas por KSHV se acompaña de la expresión de la proteína de latencia viral ORF73 y, en menor medida, de un factor de procesividad viral ORF59.

Cuando se infectaron con KSHV BAC16 marcado con una proteína fluorescente verde, las células endoteliales desarrollaron una morfología en forma de huso y demuestran la expresión de GFP que confirma la relación casual entre la infección por KSHV en el fenotipo observado. Después de su desarrollo, este modelo de cultivo celular allanó el camino para que los investigadores evaluaran las alteraciones del ARNm de la célula huésped y la expresión de proteínas inducidas por la infección por KSHV. En consecuencia, se han identificado los principales mecanismos patogénicos que subyacen a la oncogénesis mediada por KSHV y que representan dianas terapéuticas prometedoras.

No olvide que el KSHV es un agente BSL-2 y debe manejarse con procedimientos y prácticas de contención de bioseguridad adecuados.