Name: Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende el modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratas neonatales P10 para investigar lesiones isquémicas cerebrales. Este método permite estudiar mecanismos de daño y reparación en el cerebro en desarrollo.

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La financiación fue proporcionada por las subvenciones NIH K08 NS064094 y UCSF REAC. Los autores desean agradecer a Nikita Derguin, Zinalda Vexler y Joel Faustino por su ayuda en el desarrollo de esta técnica.

Toda la investigación animal fue aprobado por la Universidad de California, San Francisco Comité de Investigación Animal y se llevó a cabo de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Departamento de Salud y Servicios Humanos, Publicación No. 85-23, 1985 EE.UU. ). Los animales fueron seguidos de cerca por los veterinarios del Comité Institucional Animal UCSF Cuidado y Uso (IACUC), acreditado por AAALAC. Se obtuvo una hembra Sprague-Dawley con un 8 días de edad camada (10 crías por camada). La madre y sus crías se les dio comida y agua ad libitum y se alojaron en una instalación de cuidado de los animales de la temperatura y controlado por la luz con el enriquecimiento de todos los días, de acuerdo al protocolo de IACUC, hasta que los cachorros fueron 10 días de edad. Todos los instrumentos quirúrgicos utilizados en este procedimiento se trataron en autoclave para asegurar la esterilidad. Esterilidad de puntas del instrumento se mantiene durante toda la cirugía. 1. Medio oclusión de la arteria cerebral <ol><li> Pesar el cachorro y garantie que es el peso adecuado (19-21 g). Anestesiar al cachorro en 3% de isoflurano en 100% O 2 y asegurarse de que no hay respuesta a una pizca pie. Mantener la temperatura de superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C con el uso de una almohadilla de calefacción bajo el escenario quirúrgico. </li><li> Asegurar el animal en posición supina con cinta a través de las regiones de los hombros. El uso de bastoncillos de algodón estériles, limpie el área cervical anterior con una solución de povidona-yodo seguido por un hisopo de 70% de etanol en agua bidestilada, alternando entre cada solución durante cuatro hisopos totales. </li><li> Localmente infiltrarse bupivacaína al 0,25% en el lugar de la incisión planeada. El uso de un estereoscopio, hacer una línea media incisión cervical 5 a 7 mm anterior para exponer la arteria carótida común (CCA). Coloque 2-4 retractores para mantener la cavidad abierta y la arteria expuesta. </li><li> Localizar la arteria carótida interna (ICA), arteria occipital (OA), y la arteria carótida externa (ACE). El novio de las arterias para obtener una visión clara. Ser autoeful no perturbar el nervio vago. NOTA: Para cachorros con operación simulada, el inicision se deja abierta y las arterias están expuestos, después de lo cual la incisión se sutura cerrado. El tiempo total de la anestesia es equivalente a la de la cirugía de la oclusión. </li><li> Cortar 1,5 cm de seda 6-0 hilo de sutura trenzado. Destrenzar la sutura, sacando hebras individuales. Asegúrese de que las cadenas individuales están ordenadas y no deshilachado. NOTA: Si es necesario, smoothe los extremos deshilachados por inmersión de la cadena sencilla en agua estéril y el aseo la hebra con puntas de fórceps. </li><li> Mientras sostiene el hilo de sutura con una pinza de 45 grados, mover las pinzas en un movimiento de arco de barrido a pasar por debajo de la ICA para que las puntas de fórceps surgen entre el ICA y OA. NOTA: Si la disección se hace bien, este paso será relativamente fácil. Si la ACI y la OA se tocan, tenga cuidado de no romper las arterias cuando el uso de los fórceps para aislar el ICA. Si se produce sangrado, aplicar presión a la arteria con las pinzas hastael sangrado se detiene. Absorber la sangre con una gasa estéril. </li><li> Tome el extremo del hilo de sutura que es retenido por la pinza y tire de ella para que el extremo es de fácil acceso. Soltar la hebra a partir de los fórceps y una copia de las pinzas de debajo de la ICA, invirtiendo el movimiento en el paso 1.5 (Figura 1A). </li><li> Atar una ligadura temporal alrededor de la ACI en la base, más cercano a donde se separa de la CCA. NOTA: Es importante para atar el nudo para que el extremo de la hebra que se sacó para eliminar el nudo es lo suficientemente largo (superior a 1 mm, de menos de 3 mm) para agarrar fácilmente con fórceps, garantizando al mismo tiempo que existe una cantidad apropiada de hilo de sutura en el otro lado del nudo para la retracción. </li><li> retraer con cuidado la ICA lateralmente y utilizar un clip para asegurar la hebra para el exceso de piel cerca de la región axila en el lado opuesto de la incisión. Asegúrese de que este hilo de retracción es lo suficientemente tenso para detener el flujo de sangre antes de proceder a la siguiente etapa, aminimizar el riesgo de hemorragia no controlada. Observe que la arteria es plana y pálido. NOTA: No se exceda en retracción, ya que puede causar una rotura parcial o total de la ACI. La retracción puede ajustarse justo antes de hacer la arteriotomía tirando de la hebra en el lado opuesto al clip. </li><li> Usar 45 ° pinzas para agarrar otra hebra de sutura sin trenzar y el bucle por debajo y alrededor de la ICA, como en el paso 1.5. Posición esta hebra lateral a la cadena de retracción (Figura 1B). NOTA: Este paso también se puede hacer antes de la retracción. Si no está seguro acerca de la calidad de la retracción, este nudo puede ser muy libremente atado antes del siguiente paso. </li><li> Cortar una mitad de camino arteriotomía 0,2 mm entre las ligaduras atadas y no vinculadas, errar más cerca de la ligadura atado. NOTA: La sangre restante en la arteria atado-off puede vaciar a través de la arteriotomía, pero no debe exceder de 5 l. Si el sangrado continúa, tire con cuidado de la hebra de retracción para aumentar la retracción, con la atención a unavoid dañar la arteria de la tensión excesiva. </li><li> Usando una regla métrica, medir la sutura oclusiva y cortar la sutura con una asignación adicional de 2-3 mm para la eliminación del oclusor durante la reperfusión. Mantenga el oclusor con pinzas de 45 grados y el uso de fórceps rectas para crear una curva en la longitud apropiada para alcanzar el MCA, marcando un punto de parada para el adelanto. NOTA: A 10 mm de longitud de la oclusión desde el extremo de la punta de silicona a la curva se usa para P10 Sprague Dawley o Long Evans crías de rata en este rango de peso. </li><li> El uso de 45 ° fórceps, alimentar la sutura oclusión nylon recubierto de silicona en la arteriotomía y avanzar la sutura a la curva que marca la distancia predeterminada a la MCA (Figura 1C). Asegurar que el avance se siente suave; parar inmediatamente avance si se sienta resistencia. Durante el avance, el objetivo de la sutura en una dirección que es paralela a la CC / ECA, hacia la cabeza. NOTA: Si la sutura dorsal es avanzada, haciala columna vertebral del animal, que se puede ejecutar en la arteria pterigopalatina (PTA). Si la resistencia se sentía después de 3-5 mm de avance, la sutura ha afectado a la unión PTA. Copia del oclusor fuera de la arteria hasta que la cabeza de silicona es cerca de la arteriotomía antes de ajustar la dirección de avance. No es necesario eliminar por completo el oclusor de la arteriotomía. </li><li> Asegurar el oclusor atando una ligadura temporal, usando la hebra de la etapa 1.10 (Figura 1D). </li><li> Retire el clip retractor. Recortar las hebras de las dos ligaduras temporales de manera que la hebra del nudo que se tira para retirar el nudo es fácil de agarrar con pinzas rectas y es más larga que la hebra que se tira para apretar el nudo. NOTA: Los hilos deben ser lo suficientemente corto para que no se enreden en la cavidad después del cierre. </li><li> Eliminar los retractores y cerrar la cavidad usando 6-0 seda trenzada para crear tres a cuatro suturas interrumpidas. </li><li> Retire el cachorro deanestesia y lo coloca sobre una almohadilla de calentamiento en aire ambiente. Supervisar el cachorro hasta que se haya recuperado la suficiente conciencia para mantener decúbito esternal y asegúrese de que se ha recuperado completamente antes de volver a la presa. Asegúrese de que el cachorro mantiene una temperatura de la superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C. </li><li> Durante la oclusión, la resonancia magnética de difusión ponderada (DW-MRI) bajo anestesia con isoflurano se puede utilizar para verificar la inducción apropiada de la lesión. La Figura 2 demuestra la lesión isquémica en curso detectada por DW-MRI durante tMCAO 9. NOTA: giro imagen planar eco ponderada-Diffusion se lleva a cabo de 10-15 minutos antes de la reperfusión. todo el cerebro se forma la imagen con 2 mm de espesor secciones coronales en serie usando los siguientes ajustes de la secuencia de impulsos: TR / TE = 5.000 / 60 ms, 4 promedios, campo de visión = 35 mm, matriz de datos = 128x128, duración gradiente de difusión = 20 ms, separación = 29,7 ms, amplitud = 70mt / m, y b-factor = 1.045 s / mm2.Animales que presentan una falta de implicación cortical o lesión isquémica atípico, tal como en el tronco cerebral, están excluidos. </li></ol> 2. La reperfusión NOTA: La oclusión se lleva a cabo durante 3 h para producir una cantidad de moderada a grave de lesión que involucra el cuerpo estriado y la corteza. <ol><li> En aproximadamente 2 h y 50 min después de la oclusión de la MCA, anestesiar el cachorro en 3% de isoflurano en 100% O 2. Mantener una temperatura de superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C con el uso de una almohadilla de calefacción bajo el escenario quirúrgico. </li><li> Retire las suturas interrumpidas desde el paso 1.16 y localizar la unión, que está marcado por las dos ligaduras y el extremo de cola de la sutura oclusiva. NOTA: los animales con operación simulada se inducen y permanecen bajo anestesia durante un período de tiempo equivalente a los animales ocluidos. La incisión se abre una vez más y se sutura cerrado. Para los animales con operación simulada, continúe con el paso 2,11. </li><li> Con cuidado, desateel nudo más lateral previamente atado en el paso 1.14 tirando de la cadena más larga. NOTA: Si hay resistencia en desatar el nudo, deja de asegurar que la hebra correcta del nudo se está tirando. Si la resistencia continúa, aumentar la ampliación para una mejor visión. Tenga cuidado cuando la desvinculación, ya que es posible dañar la arteria durante este paso. </li><li> Retire el hilo de sutura de la cavidad. </li><li> Exactamente a 3 h después de la oclusión de la ACM, lentamente la sutura oclusiva de la arteria. No habrá ninguna resistencia. NOTA: En la mayoría de los casos, no habrá sangrado. Si se produce una pequeña cantidad de sangrado, aplicar presión a la arteria en el sitio arteriotomía. </li><li> El uso de fórceps para aplicar presión a la arteriotomía, como el siguiente paso restablece el flujo sanguíneo ICA para la reperfusión. </li><li> Cuidadosamente desatar el nudo medial usando el mismo método que en el paso 2.3. </li><li> Retire el hilo de sutura desde el cuerpo y aplicar un agente hemostático a la arteriotomía para detener el sangrado. </li&gt; <li> Asegúrese de que el sangrado se detenga. NOTA: El Retorno forma original de la arteria y el rojo confirma que el flujo sanguíneo ICA ha sido restaurada. </li><li> Eliminar los retractores y cerrar la cavidad con tres a cuatro suturas interrumpidas de 6-0 seda trenzada. </li><li> Retire el cachorro de la anestesia y colocarlo sobre una almohadilla térmica en el aire de la habitación. Monitorear hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal y garantizar la plena recuperación antes de devolverla a la presa. Asegúrese de que el cachorro mantiene una temperatura de la superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C. </li><li> Inspeccionar las crías al día durante 5 días. Recprd sus pesos e inspeccionar los sitios de incisión de cerca para la curación adecuada. Retire las suturas después de 7-14 días. Lesiones post-tMCAO se pueden obtener imágenes con resonancia magnética, si se desea 9. NOTA: Los animales pueden perder hasta 1 g de peso en el primer día, pero normalmente recuperar el peso sin la intervención y estar dentro de un similares sopesart rango a los controles por día 4-5. En raras ocasiones, un cachorro puede perder el exceso de peso o tienen dificultades para alimentarse, lo que requiere de una sonda oral alimenta durante 2-3 días. </li><li> En P21, lesión se puede evaluar de manera fiable con las pruebas de comportamiento sensoriomotoras, tales como rotarod o la cría de cilindro. Las pruebas cognitivas se puede realizar tan pronto como 4-6 semanas de edad usando evaluaciones tales como el reconocimiento de objetos novedosos o el laberinto de agua de Morris 13. </li><li> La eutanasia a las ratas por inyección intraperitoneal de Euthasol (50 mg / kg) para la cosecha cerebro 11, 12. </li><li> El análisis histológico para evaluar el volumen de lesión o respuesta a las intervenciones pueden llevarse a cabo con violeta de cresilo o tinción H &amp; E (Figura 3) 10. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos en el protocolo En primer lugar, es importante para mantener la normotermia desde la iniciación de la anestesia hasta la recuperación completa, ya que hay efectos tanto de la hipotermia y la hipertermia 17 18 en la progresión de la lesión cerebral en animales inmaduros y maduros a conocer. En segundo lugar, asegurando al mismo tiempo el animal y retraer la incisión, un posicionamiento óptimo de monitor de respiración y para garantizar que la tráquea está libre de compresión es esencial. En tercer lugar, evitar apretar o estirar el nervio vago, ya que esto puede causar cambios en la frecuencia cardíaca con la estimulación vagal. En cuarto lugar, debido a la retracción de la ICA es necesario para controlar el sangrado durante la arteriotomía, se debe prestar atención al grado de tensión durante la retracción para evitar dañar la arteria. Si la arteria no lágrima de retracción, o si hay una mala incisión arteriotomía, el animal debe ser excluido del análisis debido al riesgode la hemorragia y la mala reperfusión. Modificaciones y solución de problemas El uso de MRI como una guía, la longitud de la sutura puede ser optimizada para asegurar que la punta de silicona ocluye correctamente la MCA para crear la isquemia focal. Si la RM no está disponible, las crías pueden ser sacrificados antes de la reperfusión para la disección para visualizar la colocación de la sutura. Ajustar la longitud de sutura según sea necesario. El peso de las crías altamente correlaciona con los requisitos de longitud de oclusión de sutura. El tiempo de oclusión se puede modificar para ajustar el grado de gravedad de la lesión. Además, la forma de la sutura y la longitud son críticos. Para P10 ratas Sprague-Dawley y Long Evans que pesaban 19-21 g, 10 mm es la longitud óptima de la inserción en nuestra experiencia. Además la inserción de la sutura oclusiva puede resultar en la perforación de la MCA. Además, la consistencia en la forma del filamento de oclusión en cada cirugía resultará en un aumento de la consistencia de la lesión pattern 19, 20. Por esta razón, se recomienda el uso de suturas fabricadas profesionalmente para este propósito específico. También es importante tener en cuenta que el patrón de lesión puede diferir entre los profesionales debido a las diferencias aparentemente hora en la técnica. Limitaciones de la técnica La realización de esta técnica en una pequeña, el desarrollo de roedores requiere experiencia significativa. Si se realiza correctamente, el cirujano es capaz de provocar un patrón de lesión muy consistente a través de animales de diferentes tamaños y alcanzar una tasa de supervivencia mayor que 95%. Además, las herramientas quirúrgicas adecuadas son esenciales. Los instrumentos quirúrgicos deben estar bien mantenidos para asegurar que todas las puntas de los instrumentos se aproximan adecuadamente. Importancia de esta técnica con respecto a los métodos existentes o alternativos Mientras que la hipoxia-isquemia, o el Rice-Vannucci modelo 2 </sup&gt;, se utiliza más comúnmente para estudiar la lesión hipóxico-isquémica en el cerebro en desarrollo, es importante tener en cuenta que este modelo de tMCAO es distinta de HI en que existe una isquemia focal transitoria y sin hipoxia global, seguida de una fase de reperfusión cuando el se elimina la obstrucción y el flujo sanguíneo se restaura. Esto causa una lesión más consistente y reproducible y es más clínicamente de traslación haciendo que un patrón de lesión similar a la observada en el ictus neonatal a término. Esto permite el estudio de los patrones de lesiones focales y respuestas compensatorias en el tejido sano. Las aplicaciones futuras después de dominar esta técnica Este modelo es similar a la causa más común de accidente cerebrovascular en los neonatos humanos, un trombo oclusivo transitorio que se produce durante el período perinatal 11, 21. La etiología no está del todo claro y es más probable multifactorial, pero se presume en la mayoría de los casos to ser el resultado de émbolos que pasan de la placenta 11. Además, muchos recién nacidos con accidente cerebrovascular perinatal presunta menudo se presentan con la actividad convulsiva tarde o examen neurológico focal sutiles anormalidades 22. Esto hace que el uso de un modelo de lesión consistente, traslacional para identificar los mecanismos de progresión de lesiones y posibles estrategias terapéuticas cruciales.

Accidente cerebrovascular durante el período neonatal es una causa importante de muerte y discapacidad, se produce en hasta 1 de cada 2.300 nacidos vivos 1. Esto conduce a la alteración del desarrollo del sistema nervioso central y aumenta la morbilidad a largo plazo, incluyendo el aumento de la incidencia de la epilepsia, retraso mental parálisis cerebral, y otros tipos de motor o la disfunción cognitiva. Los efectos de por vida de un derrame cerebral a principios hacen modelos animales de traslación esencial para el examen de los mecanismos de lesión y reparación en esta población, incluyendo estrategias para proteger el cerebro lesionado o para potenciar la reparación. Diferentes modelos de isquemia se han utilizado para estudiar la lesión cerebral en los animales adultos, y mientras el arroz-Vannucci (Modificado Levine) 2 procedimiento se utiliza comúnmente para estudiar lesión hipóxico-isquémica en el cerebro en desarrollo, focal isquemia-reperfusión es un mecanismo distinto de la lesión causando lesiones focales, con un núcleo y penu lesionadambra y el tejido no lesionado remoto. Los modelos Koizumi 3 y 4 Longa se desarrollaron en ratas adultas para lograr oclusión de la arteria cerebral media transitoria a través de la arteria carótida común (CCA) y la arteria carótida externa (ACE), respectivamente. En ambos modelos, la ligadura permanente y cauterización de ramas de la arteria son importantes para minimizar el sangrado y para simplificar el procedimiento quirúrgico, que también causa efectos adversos sobre la capacidad del animal para alimentar y para aumentar de peso después de una lesión. Además, hay mecanismos de lesión distintas en el cerebro inmaduro y los patrones específicos de lesión visto como resultado. Más recientemente, el accidente cerebrovascular photothrombotic (prueba Rosa Bengala-) 5 y la ligadura de MCA permanente 6 se han utilizado para estudiar derrame cerebral neonatal y adulto. Tanto accidente cerebrovascular photothrombotic y la ligadura de MCA crear cambios permanentes en el flujo sanguíneo cerebral que dan lugar a una falta de reperfusion. La reperfusión es un componente crítico del desarrollo y la progresión de la lesión focal, con un aumento de la excitotoxicidad, formación de radicales libres, y la producción de óxido nítrico que conduce a la célula retardada muerte que implica las cascadas que son distintas de la fase isquémica 7 de señalización. Hipoxiaisquemia implica la ligadura de la carótida unilateral permanente seguido de hipoxia global, que también difiere de la causa del daño hipóxico-isquémica en el ser humano y no causa un patrón de lesión focal constante, por lo que el estudio del núcleo lesionado y penumbra más difícil. Hemos descrito previamente un modelo de accidente cerebrovascular por isquemia-reperfusión no hemorrágico en la rata inmadura usando oclusión de la arteria cerebral media transitoria (MCAO) 8, 9, 10. Este es un método menos invasivo que accede y ocluye la MCA a través de la arteria carótida interna sin ligati permanenteo cauterización. Esto proporciona un modelo de lesión similar a la causa más común de accidente cerebrovascular en el período perinatal 11, 12. Este modelo de isquemia-reperfusión de lesión resulta en daños en el cuerpo estriado ipsilateral y la corteza parieto-temporal. Este modelo de tMCAO también permite el control sobre la gravedad de la lesión mediante la variación de la duración de la oclusión. El examen de las vías de señalización y los cambios histológicos en el núcleo lesionado y penumbra y en el tejido ipsilateral y contralateral ileso puede aclarar aún más los mecanismos de la lesión y la reparación en el cerebro inmaduro. Este estudio demostrará este modelo de lesión importante para el cerebro en desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Anestésico isofluorano</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td>, <td>al 3%&nbsp;</td></tr><tr><td>Surgioscopio trinocular</td><td>World Precision Instruments</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td> ajuste <td>bajo a medio</td></tr><tr><td>Termómetro IR</td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>Kit de retracción para animales pequeños&nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras CermaCut</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de #5SF Dumont</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>112522-00</td><td>2x</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5/45 Herramientas</td><td>de ciencia fina</td><td>11251-35</td><td>2x</td></tr><tr><td>B-2 Micro Clamp</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>Elementos para la aplicación de abrazadera</td><td>Fina Herramientas de ciencia</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vannas Tijeras</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15000-03</td><td>borde de corte de 2 mm</td></tr><tr><td>Suturas de oclusión</td><td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>Regla</td><td>Herramientas de ciencia fina</td> Agente <td></td><td></td></tr><tr><td>hemostático&nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture</td><td>Ethicon</td><td>769G</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0,22 mL/kg</td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Henry Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de laboratorio</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

transitoria de la arteria cerebral media oclusión modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas p10

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Se han utilizado varios modelos animales para estudiar la lesión hipóxico-isquémica, la lesión traumática, la hipoxia global o la isquemia permanente tanto en el cerebro inmaduro como en el maduro. El accidente cerebrovascular ocurre comúnmente en el período perinatal en los seres humanos, y la isquemia-reperfusión transitoria es la forma más común de accidente cerebrovascular en los recién nacidos. La fase de reperfusión es un componente crítico de la progresión de la lesión, que ocurre durante un período de días a semanas, y de la respuesta endógena a la lesión. Este modelo de rata postnatal en el día 10 (p10) de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO) crea una lesión focal unilateral y no hemorrágica por isquemia-reperfusión que se puede utilizar para estudiar los mecanismos de la lesión focal y la reparación en el cerebro equivalente a término completo. El patrón de lesión que produce la tMCAO es consistente y altamente reproducible y puede confirmarse con resonancias magnéticas o análisis histológicos. La gravedad de la lesión se puede manipular a través de cambios en el tiempo de oclusión y otros métodos que se discutirán.

La gravedad de la lesión causada por tMCAO es altamente dependiente de tanto el tiempo de oclusión y la experiencia del cirujano. Una oclusión de 90 min a menudo produce una leve a moderada patrón de lesión, mientras que 3 h produce una lesión de moderada a severa. Gravedad de la lesión puede ser evaluada mediante una variedad de métodos, incluyendo MRI, histología, o análisis de comportamiento a corto o largo plazo. La figura 2 muestra un ejemplo de la DW-MRI realizó 75 min en una oclusión de 90 minutos, lo que confirma la lesión isquémica que implica el hemisferio ipsilateral. formación de imágenes ponderado Difusión demuestra el aumento de la difusión en el cuerpo estriado ipsilateral y la mayoría de la corteza ipsilateral, sin cambios contralaterales, durante la fase isquémica aguda. Esto se correlaciona con un nivel moderado de lesión a largo plazo, que incluye tanto el córtex y la sustancia gris profunda. La oclusión de la MCA en los resultadosla muerte celular que se inicia en el cuerpo estriado de lesión menos grave y se desarrolla empeoramiento lesión cortical y del hipocampo para tiempos de oclusión más largos y lesión más grave. Durante la optimización de la técnica quirúrgica, tales como la determinación de la longitud de inserción de sutura, MRI es muy recomendable, ya que permite la confirmación de la colocación de sutura adecuada y visualización de edema y la progresión de lesiones durante la oclusión 14, 15, 16. Si la RM no está disponible, H &amp; E o coloración violeta de cresilo son métodos histológicos sencillo y fiable para determinar la morfología de la lesión y se pueden utilizar en ambos puntos temporales tempranos y tardíos después de la tMCAO. La Figura 3 demuestra un patrón de lesión de moderada a grave en el examen histopatológico tras un 3 h oclusión, lo que demuestra la formación de quistes y el volumen en el cuerpo estriado ipsilateral y la corteza. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" imparcial cuantificaci estereol de secciones cresilo-violeta-manchado para calcular la relaci ipsilateral a volumen hemisf contralateral confirma lesi isqu ipsilateral. espec despu anestesiar al animal con euthasol el cerebro se cosech mediante perfusi transcard en m pbs paraformaldeh post-fijaci durante noche y equilibrio sacarosa todo seccion intervalos fue seleccionado cada secci duod montado ti violeta cresilo>10. Incluso con lesiones leves, cambios del aparato locomotor, tales como circular y hemiparesia, se observan durante el período de oclusión. Con lesiones más graves, estos cambios persistirán después de la reperfusión. las pruebas de comportamiento adicional se puede utilizar para evaluar la gravedad de la lesión, incluyendo rotarod o cilindro pruebas de cría para la función sensomotora y el laberinto de agua de Morris parala función cognitiva 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg"> Figura 1: Imágenes quirúrgicos en vivo de la Procedimiento tMCAO. (A) La primera hebra de sutura se enrolla alrededor de la ICA, como se detalla en el paso 1.6. (B) La primera ligadura temporal está ligada y la ICA se retrae. El segundo hilo de sutura se enrolla alrededor de la ACI, lateral a la primera hebra de sutura, como se detalla en el paso 1.9. (C) La sutura oclusión revestido de silicona se introduce en el sitio de arteriotomía, como se detalla en el paso 1,12. (D) La segunda ligadura temporal está ligada a asegurar el oclusor en su lugar, como se detalla en el paso 1,14. Barra de escala = 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg"> Figura 2: MRI Durante OCCLderrame demuestra la adecuada Lesión unilateral. Anterior a posterior, cortes de imagen coronal de la DW-MRI, realizados durante una oclusión 90 min, demostrar una mayor difusión que implica el hemisferio ipsilateral (flechas), que es coherente con la lesión isquémica en curso en la fase aguda. Reproducido con permiso del ictus 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg"> Figura 3: Lesión unilateral Involucrar el cuerpo estriado y la corteza a las 4 semanas siguientes tMCAO. Posterior a anterior, cresil-violeta-manchado secciones cerebrales coronales (cada uno 50 mM) cosechado de P38 animales demuestran lesión bastante grave (las flechas muestran la formación de quistes ipsilateral y redujeron cortical yvolumen estriatal) después de un 3 h tMCAO en P10. El orificio redondo en el lado izquierdo representa un identificador hemisferio contralateral. Barra de escala = 5 mm. Reproducido con permiso del Neurobiología del 12 de Enfermedades. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El accidente cerebrovascular neonatal es una causa significativa de lesión cerebral temprana que requiere un modelo traslacional con patrones de lesión focal consistentes y alta reproducibilidad para permitir el estudio. Este estudio describe el procedimiento quirúrgico detallado para crear una lesión focal no hemorrágica, unilateral por isquemia-reperfusión en roedores equivalentes a término.

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

El objetivo general de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratas neonatas es proporcionar un modelo traslacional del accidente cerebrovascular en neonatos a término. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la lesión cerebral isquémica neonatal al comprender los mecanismos de lesión y reparación en el cerebro en desarrollo, y cómo podemos modificarlos con diferentes estrategias terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un modelo fisiológicamente preciso del accidente cerebrovascular isquémico arterial focal en neonatos, y también incluye un componente de reperfusión, que es una parte importante de la progresión de la lesión en neonatos humanos.La demostración visual de este modelo es fundamental, porque los pasos de esta cirugía pueden ser muy difíciles de aprender. Las representaciones bidimensionales de la anatomía arterial no siempre demuestran adecuadamente la naturaleza compleja de la ramificación tridimensional en la rata. Comience pesando al cachorro para asegurarse de que pesa entre 19 y 21 gramos.Después de anestesiar al cachorro con isoflurano inhalado de acuerdo con los protocolos aprobados, asegúrese de que no haya respuesta a un pellizco en el pie. Mantenga la temperatura de la superficie corporal con el uso de una almohadilla térmica debajo de la etapa quirúrgica. Asegure al animal en posición supina con cinta adhesiva en las regiones de los hombros.Utilice hisopos de algodón estériles para frotar el área cervical anterior con etanol al 70%, seguido de un hisopo de solución de povidona yodada. A continuación, infiltre localmente bupivacaína al 0,25% en el sitio de la incisión planificada. Luego, mientras trabaja a través de un estereoscopio, haga una incisión cervical anterior en la línea media de cinco a siete milímetros para exponer la arteria carótida común.Coloque de dos a cuatro retractores para mantener la cavidad abierta y la arteria expuesta. A continuación, localice la arteria carótida interna, la arteria occipital y la arteria carótida externa. Retire el tejido conectivo y la grasa de las arterias para obtener una visión clara.Después de cortar 1,5 centímetros de hilo de sutura trenzado de seda 6-0, destrenza la sutura, sacando las hebras individuales. Asegúrate de que las hebras individuales estén limpias y no deshilachadas. Mientras sostiene la tira de sutura dentro de unas pinzas de 45 grados, barra las pinzas en un arco debajo del ICA para que las puntas emerjan entre el ICA y el OA. A continuación, agarre el extremo de la hebra de sutura y tire de él para que el extremo sea de fácil acceso.Suelte la hebra de las pinzas y retroceda hacia afuera desde debajo de la ICA, invirtiendo el movimiento anterior. Ate una ligadura temporal alrededor del ACI en la base más cercana a donde se separa del ACC. Retraiga con cuidado el ICA lateralmente, luego use un clip para asegurar el mechón retráctil al exceso de piel cerca de la región de la axila en el lado opuesto a la incisión.Asegúrese de que la hebra retráctil esté lo suficientemente tensa como para detener el flujo sanguíneo antes de continuar con el siguiente paso. La arteria debe ser plana y pálida. Use un fórceps de 45 grados para agarrar otra hebra de sutura sin trenzar y enróllela debajo y alrededor del ICA como antes.Coloque esta hebra lateral a la hebra de retracción. A continuación, corte una arteriotomía de 0,2 milímetros a medio camino entre las ligaduras atadas y desatadas, errando más cerca de la ligadura atada. Ahora, usando una regla métrica, mida 10 milímetros de sutura de nailon recubierta de silicona como sutura de oclusión.Corte la sutura con un margen adicional de dos a tres milímetros para retirarla durante la reperfusión. Sostenga la sutura oclusiva con pinzas de 45 grados y use pinzas rectas para crear una curva, marcando el punto de parada del avance. Introduzca la sutura oclusiva en la arteriotomía, apuntándola paralelamente al ECA y hacia la cabeza.Avance suavemente la sutura hasta alcanzar la curva. A continuación, utilice la hebra colocada lateralmente a la hebra de retracción para atar una ligadura temporal y asegurar la sutura de oclusión. Retire el clip retractor, luego recorte las hebras de ambas ligaduras temporales, dejando la hebra que se usará para quitar el nudo más larga que la hebra utilizada para apretarlo.Retire los retractores y cierre la cavidad con seda trenzada 6-0 para crear tres o cuatro suturas interrumpidas. Retire al cachorro de la anestesia y colóquelo sobre una almohadilla térmica en el aire ambiente. Monitoree al cachorro hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal, y asegúrese de que esté completamente recuperado antes de devolverlo a la madre.Durante la oclusión, se pueden utilizar imágenes de resonancia magnética ponderadas por difusión para verificar la inducción adecuada de la lesión. Estas imágenes muestran una lesión isquémica en curso, indicada por la flecha, detectada por DW-MRI durante el MCAO. Aproximadamente dos horas y 50 minutos después de la oclusión de la ACM, prepare los materiales quirúrgicos y luego comience el procedimiento de reperfusión anestesiando como antes.Retire las suturas interrumpidas y localice la unión, que está marcada por las dos ligaduras y el extremo de la cola de la sutura oclusiva. Desate con cuidado el nudo más lateral de la ligadura temporal tirando de la hebra más larga y retire la hebra de sutura de la cavidad. Exactamente tres horas después de la oclusión de la ACM, retire lentamente la sutura oclusiva de la arteria.No debe haber resistencia. Use fórceps para aplicar presión a la arteriotomía y luego desate con cuidado el nudo medial para restaurar el flujo sanguíneo. Después de retirar la hebra de sutura del cuerpo, aplique un agente hemostático a la arteriotomía para detener el sangrado.El retorno de la forma original de la arteria y el color rojo confirma que se ha restablecido el flujo sanguíneo de la ICA. Retire los retractores y cierre la cavidad con seda trenzada 6-0 para crear tres o cuatro suturas interrumpidas. Retire al cachorro de la anestesia y permita que se recupere con monitoreo como antes antes de devolverlo a la jaula de la casa.Inspeccione a los cachorros diariamente durante cinco días. Registre sus pesos e inspeccione de cerca los sitios de las incisiones para verificar una cicatrización adecuada. Estas secciones posteriores a anteriores del cerebro teñidas con violeta de cresilo de 50 micras extraídas de animales P-38 demuestran una lesión bastante grave después de un TMCAO de tres horas en P-10.La flecha indica la formación de quistes ipsilaterales y la reducción del volumen cortical y estriatal. El orificio redondo en el lado izquierdo representa un identificador de hemisferio contralateral. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, si bien este procedimiento es conceptualmente simple, el éxito y el dominio pueden llevar horas de optimización y práctica.Una vez dominada, la oclusión puede completarse en menos de 10 minutos, mientras que la reperfusión puede completarse en menos de cinco minutos.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Inducción quirúrgica del daño cerebral isquémico en la rata es un modelo ampliamente utilizado para la investigación del accidente cerebrovascular. Aquí se demuestra la inducción de isquemia cerebral focal por oclusión de la arteria cerebral media. Visualización del infarto como resultado de la tinción histológica y la resonancia magnética también se indica.

Modelo de isquemia cerebral focal por oclusión endovascular de sutura de la arteria cerebral media en la rata

Se demuestra en el video de un método para producir una oclusión de arteria cerebral media en ratones adultos con un monofilamento intraluminal. También mostrará cómo evaluar la extensión del infarto cerebral por el cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) tinción.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Fuente: Larpthaveesarp, A., et. al. Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media del accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10. J. vis. exp. (2017)Este video muestra el establecimiento del modelo de oclusión de la arteria cerebral media en una cría de rata. La arteria carótida interna (ACI) queda expuesta y se asegura una ligadura para restringir el flujo sanguíneo. Se inserta un ocluso a través de la ICA para llegar a la arteria cerebral media. A continuación, se permite...

Generación de una oclusión de la arteria cerebral media en una cría de rata para inducir isquemia cerebral local

Se describe un método altamente reproducible para la oclusión permanente de un vaso sanguíneo principal cerebral de roedor. Esta técnica se puede lograr con muy poco daño periférico, mínima pérdida de sangre, una alta tasa de supervivencia a largo plazo, y el volumen del infarto coherente acorde con la población clínica humana.

Permanente oclusión vascular cerebral<em&gt; Vía</em&gt; Ligadura doble y transección

Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Diferentes modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) se utilizan en la investigación experimental del accidente cerebrovascular. Aquí, se describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular de MCAo transitorio a través de la arteria carótida externa (ECA), que tiene como objetivo imitar el accidente cerebrovascular humano, en el que el trombo cerebrovascular se elimina debido a la lisis o terapia espontánea del coágulo.

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

Este protocolo demuestra un modelo único de brazada de ratón con un infarto de tamaño medio y una excelente tasa de supervivencia. Este modelo permite a los investigadores preclínicos de accidentes cerebrovasculares extender la duración de la isquemia, utilizar ratones de edad avanzada y evaluar los resultados funcionales a largo plazo.

Un modelo de oclusión transcraneal modificado de la arteria cerebral media para estudiar los resultados del accidente cerebrovascular en ratones ancianos

Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.

Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

El protocolo actual describe un modelo de rata de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media que preserva la estructura anatómica de los vasos cerebrales sin causar daño.

Un modelo en ratas de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media sin dañar la estructura anatómica de los vasos cerebrales

El objetivo de este estudio fue establecer un método reproducible para realizar una craneectomía seguida de una oclusión permanente y selectiva de la arteria cerebral media en ratas, para su aplicación en estudios experimentales de déficits de memoria motora y espacial.

Oclusión selectiva y permanente de la arteria cerebral media en ratas: un enfoque experimental para estudiar déficits de memoria motora y espacial

Aprende el modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratas neonatales P10 para investigar lesiones isquémicas cerebrales. Este método permite estudiar mecanismos de daño y reparación en el cerebro en desarrollo.

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

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