Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

El objetivo general de este sistema recombinante de detección del VHB es facilitar la realización de pruebas masivas de detección de agentes contra el virus de la hepatitis B o VHB. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VHB, como la detección de agentes anti-VHB y la identificación de los factores del VHB. La principal ventaja de esta técnica es que el sistema reportero del VHB puede monitorizar las primeras etapas del ciclo de replicación del VHB.

Después de preparar el medio de cultivo celular, el día antes de la transvección, coloque cuatro veces 10 a las seis células HepG2 en el medio, en un plato recubierto de colágeno de 10 cm. Incubar las células a 37 grados C en una incubadora humidificada al 5%CO2. Utilizando un agente transveccionario de acuerdo con las instrucciones del fabricante, transvecnte las células con 5 mcg de pUC1 2HBV delta epsilon y 5 mcg de pUC1 2HBV/NL.

Al día siguiente, retire el medio de cultivo y agregue 10 ml de medio de cultivo fresco. Luego, una semana después de la transvección, transfiera el medio de cultivo que contiene el VHB recombinante a un tubo de 50 mL. A continuación, agregue 10 ml de medio de cultivo fresco a la placa que contiene las células transvectadas.

A continuación, recoja y centrifugue el medio de cultivo a 2.300 x g durante cinco minutos para eliminar los restos celulares que contienen el VHB recombinante. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 45 mcm. A continuación, añada un volumen igual de 25% de PEG, 1,5 molar de NaCl, al filtrado, y mezcle suavemente.

Incubar la muestra durante la noche a cuatro grados C. Al día siguiente, centrifugar la solución a 2,300 x g y cuatro grados C, durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en 5 mL de tampón TNE. Ahora centrifugue la muestra nuevamente para eliminar los restos celulares, luego cargue 5 mL del VHB recombinante que contiene TNE en 8 mL de sacarosa al 20% en TNE.

Centrifugar los dos a 100, 000 x g y 15 grados centígrados durante tres horas. Deseche la mayor cantidad posible del sobrenadante y utilice 1 mL de DMEM sin suero por cada 40 mL de cultivo inicial para volver a suspender el pellet. Incubar la suspensión a cuatro grados centígrados durante la noche.

A la mañana siguiente, filtre la suspensión a través de un filtro de 45 mcm. Luego prepare alícuotas de 5 mL y almacene los tubos a menos 80 grados centígrados. Placas de células HepG2, que expresan de manera estable el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, o NTCP, que son susceptibles a la infección por VHB, e incuban a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Un día antes de la infección, coloque aproximadamente cinco veces 10 a la cuarta células NTCP HepG2 en los pocillos de una placa recubierta de colágeno de 96 pocillos, en 1 mL de medio de cultivo. Descongele el VHB recombinante en un baño de agua a 37 grados centígrados, hasta que quede un poco de hielo en el vial. Prepare el medio para la infección combinando 78 mcL de medio de cultivo fresco, 2 mcL de DMSO, 10 mcL de 40% PEG 8000, en 1x PBS, y 10 mcL de VPH recombinante.

Agregue 100 mcL de solución recombinante de VHB a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Un día después de la infección, use 300 mcL de PBS para lavar la célula tres veces para eliminar la proteína reportera contaminante de la fracción viral. Añada 200 mcL de medio de cultivo, que contenga 2% de DMSO, a las células infectadas e incube durante una semana o menos.

Para llevar a cabo el análisis de la infección por VHB, una semana después de la infección, use PBS para lavar las células infectadas tres veces. Agregue 50 mcL de tampón de lisis a las células infectadas. Agite la placa de cultivo durante cinco minutos y luego centrifugue a 2.000 x g durante cinco minutos.

Agregue 50 mcL del sustrato reportero a una placa luminométrica. A continuación, añada 20 mcL del lisado celular a la placa y mezcle agitando brevemente. Finalmente, coloque la placa en el luminómetro e inicie la lectura.

Este gel muestra la digestión del plásmido reportero pUC1 2HBVNL construido y el plásmido auxiliar delta pUC1 2HBV con HindII y EcoRI. Ambas muestras producen los tamaños de banda esperados. En este Western blot, los lisados de células HepG2, o células HepG2 que expresan NTCP recombinante marcado con myc e infectadas con VHB recombinante, se probaron con un anticuerpo anti-myc que reconoce las proteínas recombinantes no glicosiladas de 34 kDa y las proteínas recombinantes aisladas con glicosilación de 65 kDa.

Los gráficos que se muestran aquí ilustran la cinética del gen reportero. Niveles de ARN y ADN en el clon 22 de HepG2 NTCP infectado con HepG2 recombinante, o células de hepatocitos primarios humanos. Los niveles de ARN del VHB en la actividad reportera se elevaron a los tres días después de la infección, tanto en las células infectadas como en los hepatocitos primarios.

Por el contrario, no hubo cambios en los niveles de ADN a los nueve días después de la infección, porque el VHB recombinante es deficiente para el núcleo y el polo funcionales, que desempeñan un papel importante en la vía de replicación del ADN intracelular. En esta figura, se ilustra la inhibición del VHB recombinante por la inmunoglobulina de la hepatitis B, o HBIG, heparina e IFN-beta. La HBIG y la heparina suprimieron fuertemente la actividad del reportero a menos del 10% a 75 U/mL y 150 U/mL, respectivamente.

Por otro lado, el IFN-beta suprimió la actividad del reportero a menos del 50% a 1000 U/mL. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana para la preparación del VHB recombinante, en seis días para la infección por el VHB recombinante y, en resumen, medios para la medición de la proteína reportera, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el paso de lavado que elimina la proteína reportera contaminante de la fracción de sesgo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros resultados como la infección por el VHB ancho para responder a la pregunta adicional de que el VHB recombinante no produjo primeros resultados positivos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VHB exploraran el desarrollo de un agente anti-VHB en un modelo de cultivo celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar e infectar células con VHB recombinante.

No olvide que trabajar con el VHB recombinante puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes mientras se realiza este procedimiento.