Inducible líneas celulares estables LAP-etiquetado para la investigación de la función de proteínas, espacio-temporal y localización de las redes de interacción de proteínas

El objetivo general de este procedimiento es generar localización inducible y purificación de afinidad, o líneas celulares estables marcadas con LAP, para investigar la función de las proteínas, la localización espacio-temporal y las redes de interacción de proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología molecular y celular relacionadas con la función de las proteínas, la localización del ciclo celular de las proteínas bajo cero y las interacciones de las proteínas. La principal ventaja de este método es que es susceptible de análisis de alto rendimiento de grupos de proteínas, y se puede utilizar para diseccionar los componentes proteicos de las vías biológicas.

Para comenzar este procedimiento, clone el marco de lectura abierto del gen de interés en el vector marcado con LAP y transfectúelo en células HEK293 como se describe en el protocolo de texto. Un día después de la transfección, reemplace el medio DMEM/F12 menos Tet por medios nuevos. Dos días después de la transfección, dividir las células al 25% de confluencia.

Espere que las celdas se adhieran aproximadamente cinco horas. A continuación, añada los medios que contengan higromicina menos Tet DMEM/F12 a la concentración predeterminada. Para las células HEK293, use 100 microgramos por mililitro de higromicina.

Reemplace el medio según sea necesario hasta que aparezcan focos celulares distintos que se asemejen a manchas opacas contra la placa transparente. Agregue 20 microlitros de tripsina en la parte superior de cada foco celular y colóquelo hacia arriba y hacia abajo dos veces con una punta de pipeta de 200 microlitros. Transfiera las células en una placa de 24 pocillos y expanda las células mediante el crecimiento continuo en medios que contengan higromicina menos Tet DMEM/F12.

Ampliar la línea celular validada con marcado con LAP para la purificación por afinidad en tándem, o TAP, aislamiento de complejos de proteínas. Para ello, pase continuamente todas las células HEK293 a placas más grandes y/o botellas de rodillo, y menos los medios Tet DMEM/F12 a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. Para las líneas celulares inducibles por Tet/Dox, induzca las células durante 10 a 15 horas añadiendo una concentración de 0,2 microgramos por mililitro de Tet/Dox cuando las células alcancen aproximadamente el 70% de confluencia.

Cosecha las células por agitación o tripsinización. Luego, explíquelos a 875 veces g durante cinco a 10 minutos. Para acoplar el anticuerpo anti-GFP a las perlas de proteína A, equilibre 160 microlitros de perlas de proteína A de volumen empaquetado con PBST en un tubo de 1,5 mililitros.

Lave las cuentas tres veces con 1 mililitro de PBST. Después de cada paso de lavado a lo largo de este procedimiento, las perlas se centrifugan a 5000 veces g durante 10 segundos y se elimina el sobrenadante. Después de volver a suspender las perlas en 500 microlitros de PBST, agregue 80 microgramos de anticuerpo anti-GFP rápido purificado por afinidad a cada tubo, que contiene 160 microlitros de perlas.

Mezclar durante una hora a temperatura ambiente. Lave las perlas dos veces con un mililitro de PBST, luego lave las perlas dos veces con un mililitro de borato de sodio 0.2 molar, pH Después del lavado final, agregue 900 microlitros de tampón de borato de sodio, para llevar el volumen final a un mililitro. Luego, agregue 100 microlitros de DMP de 220 molares a la suspensión de perlas, para una concentración final de 20 milimolares.

Gire los tubos suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación con DMP, lavar las perlas una vez con un mililitro de etanolamina 0,2 molar, cloruro de sodio 0,2 molar pH 8,5, para inactivar el reticulante residual. Luego, vuelva a suspender las cuentas en un mililitro del mismo tampón y gírelas durante una hora a temperatura ambiente.

Después de peletizar las perlas, vuelva a suspenderlas en 500 microlitros adicionales del tampón. Las cuentas preparadas son estables durante varios meses a cuatro grados centígrados. Para preparar los lisados celulares, vuelva a suspender 500 microlitros de volumen celular empaquetado en 2,5 mililitros de LAP 300, con DTT 0,5 milimolar e inhibidores de la proteasa.

Añadir 90 microlitros de fenoxipolietoxietanol nonilo al 10% y mezclar por inversión. Coloque la mezcla en hielo durante 10 minutos. Centrifugar a 21.000 veces g durante 10 minutos.

Después de la centrifugación, recoja este sobrenadante de baja velocidad y reserve una muestra de 10 microlitros para el análisis en gel. Después de transferir el sobrenadante de baja velocidad a un tubo TLA 100.3, centrifugar a 100.000 veces g durante una hora a cuatro grados centígrados. Recoja este sobrenadante de alta velocidad en un tubo y colóquelo en hielo, reservando una muestra de 10 microlitros para el análisis en gel.

Para la primera captura de afinidad a través de la unión a perlas anti-GFP, preeluya las perlas acopladas a anticuerpos lavándolas tres veces con un mililitro de tampón de elución para eliminar los anticuerpos desacoplados y reducir el fondo. Realice esto rápidamente. No deje las cuentas en sal alta durante mucho tiempo.

A continuación, lavar las perlas tres veces con un mililitro de LAP 200 N. A continuación, mezclar el extracto sobrenadante de alta velocidad con perlas de anticuerpos durante una hora a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar el extracto a 21.000 veces g durante 10 minutos, reserve una muestra de 10 microlitros del sobrenadante para el análisis en gel. Realizar tres lavados rápidos de las perlas con un mililitro de LAP 200 N, que contiene 0,5 milimolares de DTT e inhibidores de la proteasa.

Use el mismo tampón para lavar las perlas dos veces más con un tiempo de incubación de cinco minutos para cada lavado. Luego, lave las perlas rápidamente dos veces más con 1 mililitro de LAP 200 N que contiene 0.5 milimolares de DTT y sin inhibidores de la proteasa, antes de agregar la proteasa del Virus del Grabado del Tabaco, o TEV. Agregue 10 microgramos de la proteasa TEV en un mililitro de LAP 200 N a las perlas y gire los tubos a cuatro grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, granule las cuentas y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Enjuague las perlas dos veces con 160 microlitros de LAP 200 N, que contiene 0,5 milimolares de DTT e inhibidores de la proteasa para eliminar cualquier proteína residual. Para la segunda captura de afinidad a través de la unión a la agarosa de proteína S, lavar un tubo de 80 microlitros de suspensión de agarosa de proteína S tres veces con un mililitro de LAP 200 N. Agregue el sobrenadante eluido TEV a las perlas de proteína S y métalas durante tres horas a cuatro grados Celsius.

Después de peletizar las perlas, lávelas tres veces con un mililitro de LAP 200 N que contiene 0,5 milimolares de DTT e inhibidores de la proteasa. Luego, lava las cuentas dos veces con un mililitro de LAP 100. Eluir las proteínas de la proteína S agarosa añadiendo 50 microlitros de tampón de muestra Laemmli 4x y calentando a 97 grados centígrados durante 10 minutos.

Para identificar las proteínas que interactúan mediante análisis de espectrometría de masas, pruebe la calidad de la purificación analizando las muestras recolectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. La plata tiñe el gel resultante. Además, inmunoborre los eluidos y la sonda con anticuerpos anti-GFP para asegurarse de que la purificación marcada con LAP funcionó.

Para identificar las especies estequiométricas y subestequiométricas copurificadoras, se tomó la muestra de elución final y se separó mediante SDS-PAGE. Tiñe el gel con una tinción de proteínas compatible con la espectrometría de masas. Extirpe las bandas más prominentes en el gel y el espacio entre ellas para procesar las bandas por separado para su análisis por espectrometría de masas.

Aquí se muestra un análisis representativo de Western blot de las muestras de proteínas de células LAP-Tau HEK293 no inducidas e inducidas por Dox. Las células se sondean con anticuerpos anti-Tubulina para detectar el control de la carga de Tubulina y se sondean con anti-GFP para detectar la proteína Tau marcada con LAP. Nótese que la LAP-Tau sólo se expresa cuando las células son inducidas con Dox.

Las células míticas que expresan LAP-Tau se fijaron y co-teñieron el ADN y la tubulina con anticuerpos anti-Tubulina, y la localización subcelular de LAP-Tau se analizó mediante microscopía de fluorescencia. Nótese que LAP-Tau se localiza en el huso mitótico y en los polos del huso durante la mitosis. Aquí se muestra un gel teñido de plata representativo de la purificación LAP-Tau.

Los carriles representan el peso molecular, los lisados aclarados y los eluidos finales. Las muestras se analizaron en un gel SDS-PAGE de 4-20% y el gel se tiñó de plata para visualizar las proteínas purificadas. Tenga en cuenta que una banda correspondiente a LAP-Tau está marcada con un asterisco, y se pueden ver varias otras bandas correspondientes a proteínas copurificadoras.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar líneas celulares estables inducibles marcadas con LAP y cómo realizar purificaciones bioquímicas de proteínas marcadas con LAP para el análisis proteómico y la identificación de redes de interacción de proteínas.