Name: Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a combinar microscopía intravital y ecografía con contraste para estudiar la perfusión muscular y la vasodilatación inducida por insulina en ratones. Este método permite evaluar los efectos vasculares de la insulina en modelos de diabetes tipo 2 y obesidad.

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Agradecemos a Ing. Duncan van Groen de programación el software de análisis de imagen (ImageGrabber) utilizado en este estudio. La financiación para esta investigación ha sido proporcionada por una subvención VIDI de la organización holandesa para la investigación científica (grant 016.136.372).

Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Comité ético y cuidado de los animales local. El conjunto del Protocolo de inducción de la anestesia en el ratón hasta el extremo de la abrazadera euglycemic hyperinsulinemic toma aproximadamente 2 h.
1. microcirugía preparación
<ol><li>Inducir la anestesia y analgesia en un ratón macho con 20-25 g de peso después de 14 h o durante la noche de ayuno con una inyección intraperitoneal de fentanilo (0,31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) y acepromacina (6,25 mg/kg) (anestesia FMA) y colóquelo en un control de temperatura rectal homeotérmicos almohada que mantiene la temperatura corporal en 37 ° C.</li>
	<li>Desinfectar la mesa de operación y el equipo varias veces utilizando una solución basada en alcohol.</li>
	<li>Fije una aguja de 27 G a un tubo de polietileno larga de 10 cm (PE-20) y el tubo en un conector de 4 vías. Inserte la aguja en la vena de la cola y fijar con gel adhesivo de tejido. Esta cánula se utilizará para la infusión de microburbujas, insulina, glucosa y anestesia. Nota: Adición de heparina (5 U/mL) en solución salina estéril durante la canulación de la proceso para lavar la vena de la cola (aproximadamente 10 μl) reduce la posibilidad de cánulas obstruidas.</li>
	<li>A lo largo de los protocolos experimentales y procedimientos quirúrgicos, mantener la anestesia de una infusión intravenosa continua de anestesia de la FMA a través de la cánula de la vena de cola a ritmo de 33.75 μL/kg/min.</li>
	<li>Coloque el ratón con el lado ventral hacia arriba y fije los pies con una cinta termoestable para exponer la zona superior del muslo. Utilice un exorotation leve de la articulación de la cadera (patas trasera hacia arriba) y un ángulo de 40-60° en la articulación de la rodilla para estandarizar el estiramiento del músculo en el compartimiento aductor del muslo.</li>
	<li>Eliminar el vello en la ingle y muslo superior bilateral usando una crema depilatoria. Recoger todo el pelo suelto con un hisopo de algodón húmedo.</li>
	<li>Coloque el ratón bajo un estereomicroscopio y realice los siguientes pasos quirúrgicos utilizando 10 X a 16 aumentos.</li>
	<li>Haga una incisión de 2 cm con unas tijeras de piel paralela al ligamento inguinal, justo lateral a la curvatura abdominal (figura 1). Aplicar tracción en el lado distal de la incisión distal con una pinza de bulldog (figura 1). Esto le ayudará a ajustar la ventana según sea necesario y ayudar a mantener el aceite de parafina (descrito en 1.12).</li>
	<li>Disecar el tejido adiposo de la pared abdominal. Para evitar sangrado, separar suavemente la almohadilla de grasa de la pared en lugar de disección directamente a través de la almohadilla. Tracción suave en la almohadilla de grasa en la dirección distal facilitará el proceso (figura 1).</li>
	<li>Identifique la arteria femoral y siga hasta los primeros ramas principales (la arteria epigástrica y la arteria gracilis) (figura 2). La arteria gracilis es la primera rama importante de la arteria femoral en el músculo aductor y luego discurre profundo al músculo gracilis. Se utilizarán la arteria gracilis para IVM.</li>
	<li>Identificar la fascia profunda transparente que cubre los músculos y los vasos. Usando pinzas afiladas, tire hacia arriba la fascia y corte con un microscissor.</li>
	<li>Cubre el músculo expuesto con una gota (200 μL) de la parafina líquida medicinal (temperatura ambiente o calentado previamente a 37 ° C) para evitar que el tejido preparado reseque. Asegúrese de que la gota de aceite no gotea lejos. Ajuste los dobleces de la piel de la incisión utilizando la pinza de bulldog para crear una pequeña cavidad para contener el aceite de parafina que baña los vasos.</li>
	<li>Coloque el ratón al microscopio previamente calibrado (aumento óptico de 16 X) de tal manera que la arteria gracilis es vertical en la pantalla del ordenador. Conecte el microscopio a una cámara y un ordenador basado en el sistema de análisis que puede extraer el conjunto de datos de imagen a diámetro de los vasos. El diámetro es la distancia entre los dos lados luminales del vaso. Monitoreo continuo y medición del diámetro de la arteria es deseable.</li>
	<li>Coloque la fuente de luz a una distancia suficiente (mínimo 20 cm) de la trasera para reducir la conducción principal de la luz.</li>
	<li>Aplique gel de transducción ultrasonido precalentadas para el miembro posterior contralateral superior. Coloque la sonda de ultrasonido perpendicular al eje largo del hueso fémur.</li>
	<li>Ajuste cuidadosamente el ángulo y la dirección de la sonda de ultrasonido para obtener una visión transversal del grupo del músculo aductor. Tenga cuidado de mantener la posición de la sonda de ultrasonido en relación con el ratón estable para mantener el mismo plano de proyección de imagen para mediciones de línea base y hyperinsulinemic.</li>
	<li>Deja el ratón durante 30 minutos. El diámetro de la arteria gracilis debe ser estable durante 10 min antes de documentar el diámetro basal.</li>
</ol>2. línea de base y mediciones de Hyperinsulinemic
<ol><li>Asegúrese de que el diámetro de la arteria basal gracilis es salvado por el programa de computadora usado para el IVM.</li>
	<li>Preparar de antemano las microburbujas como descrito35 y cuenta con cuchilla en contra de una concentración de 2,5 x 109 burbujas/mL justo antes del experimento.</li>
	<li>
Como las microburbujas pueden verse sólo en el modo de contraste de la máquina de ultrasonido, control de los parámetros que afectan a la imagen y los datos contraste (descrito en 2.3.1) y uso constantemente durante la adquisición.
	<ol>
<li>Utilice los siguientes ajustes en la máquina de ecografía: aumento de contraste al 35 decibelios; el tiempo de obtener compensación en OFF; Línea densidad alta; Número de zonas focales de todo; Transmitir potencia al 4%; Transmitir ancho de viga estándar; Puerta SV a 4; Sensibilidad a 1; Persistencia en OFF. Nivel de la ubicación de zonas de Focal en el centro de la región de interés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ahorre un poco (5 s) clip. Esto se utilizará para calcular la señal de fondo.</li>
	<li>Agitar el vial que contiene las microburbujas a mano para tener una suspensión uniforme. Iniciar la infusión de las microburbujas con la cánula de la vena de la cola a una tasa de μl/min 5. Coloque el tubo de infusión en un vórtice vibratorio (x 200 por minuto) para mantener una suspensión uniforme de microburbujas.</li>
	<li>Permite 5 minutos de la infusión continua de microburbujas que se alcanza un nivel de estado estacionario. Continuar con la obtención de las curvas de tiempo-intensidad de las burbujas utilizando la función de destrucción de microburbujas (MBD) en la máquina de ultrasonido en 5 min y 10 min después del comienzo de la infusión de microburbujas (Figura 3A). Tomar la señal promedio de estas dos medidas para obtener los datos de perfusión basal.</li>
	<li>
Después de obtener los datos de referencia, comenzar la abrazadera euglycemic hyperinsulinemic como describe34. Usar la cánula de cola (a 1.3) para administrar la insulina y glucosa (anestesia).
	<ol>
<li>En Resumen, inducir un estado de hyperinsulinemic introduciendo un bolo de insulina de 200 mU/kg seguido de infusión continua de insulina (7,5 mU/kg/min) 60 min uso una infusión variable de un 20% D-glucosa para mantener la normoglucemia.</li>
		<li>Evaluar glucosa en la sangre de la vena de la cola cada 5 min con un dispositivo de monitoreo de glucosa y se mantiene a 5 mM ajustando la velocidad de infusión variable de glucosa. Determinar la sensibilidad a la insulina por un promedio de la velocidad de infusión de glucosa promedio durante los últimos 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asegúrese de que el diámetro de la arteria gracilis está documentado en los períodos de tiempo deseado (por ejemplo a 10, 30 y 60 min) del inicio de la abrazadera euglycemic hyperinsulinemic con el programa de computadora.</li>
	<li>Después de 25 min y 55 min de la abrazadera de la insulina, comienzan la segunda medición (hyperinsulinemic) CEUS para documentar la MBV en 30 o 60 min, respectivamente. Siga los mismos pasos descritos en 2.4 y 2.5. Separar y utilizar el puerto de anestesia del conector de 4 vías para infundir las microburbujas. Vuelva a colocar el tubo de la anestesia después del final de la infusión de microburbujas.</li>
	<li>Después de la terminación de IVM y las mediciones de CEUS 60 min después del comienzo de la infusión de insulina, extraiga sangre de ratón por un procedimiento de punción del corazón para su posterior análisis. Esto también será eutanasia el ratón. Disecar las arterias femoral y gracilis cuidadosamente y guárdelo para experimentos adicionales deseados (por ejemplo, Western Blot, Immunohistochemistry, vivo ex presión miografía experimentos36,37, 38).</li>
</ol>3. análisis fuera de línea

Nota: Los análisis de la IVM y CEUS mediciones deben realizarse fuera de línea por un investigador cegado. CEUS ofrece la posibilidad de distinguir la microcirculación de los vasos más grandes destructing temporalmente las microburbujas por ondas de ultrasonido de alta intensidad utilizando la función MBD. La señal (medida en unidades arbitrarias (a.u)) en los vasos más grandes se restaura más rápidamente que los de la microcirculación debido a la velocidad de microburbujas en los recipientes correspondientes.
<ol><li>Utilizar una estación de trabajo fuera de línea o el software en la máquina de ultrasonido para hacer los análisis.</li>
	<li>Dibujar una región de interés (ROI) para incluir la microcirculación. Dibujar un ROI separado para incluir los grandes vasos femorales (Figura 3A).</li>
	<li>Duplicar ROIs de microcirculación los recipientes más grandes para las medidas de fondo, línea de base y hyperinsulinemic utilizando la función de copia ROI en el software.</li>
	<li>Restar la señal de intensidad de la medida de fondo de la línea de base y las mediciones de hyperinsulinemic.</li>
	<li>Dividir la señal de la intensidad de la microcirculación por la señal de intensidad de los vasos femorales. Línea de base y hyperinsulinemic MBVs se pueden comparar.</li>
</ol>

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Visual Inc. Sonics había cubierto la cuota de libre acceso, mientras que la estructura y el contenido del artículo seguía siendo toda la responsabilidad de los autores.

Hemos desarrollado una técnica para estimar simultáneamente acciones vasculares de la insulina en las arterias más grandes (con IVM) y la microcirculación de músculo esquelético (con CEUS). Los pasos críticos para las medidas exitosas y confiables son: 1) exponiendo correctamente la arteria gracilis sin sangrado; 2) prevención de fugas de aceite de parafina baño la arteria; 3) tener un acceso venoso patente (cánula de la vena de la cola) para la infusión del agente de contraste (microburbujas) y compuestos vasoactivos (insulina).
El estudio de la disfunción microvascular en el músculo ha ido ganando la atención en el contexto de la obesidad y la insulina resistencia14,25,39,40. El impacto negativo de la obesidad y resistencia a la insulina sobre la función vascular se manifiesta en los diferentes niveles del árbol vascular. En adelante, diferentes enfoques deben evaluar estos cambios. El uso combinado de las técnicas de IVM y CEUS en el mismo ratón proporciona una poderosa herramienta para cuantificar los efectos de la insulina en los diferentes niveles de la vasculatura. IVM permite visualización directa y el análisis cuantitativo de la arteria de resistencia y CEUS para la evaluación de los cambios inducidos por la insulina en perfusión muscular.
Estudiando el compartimiento del músculo aductor tiene varias ventajas. Las arterias son de fácil acceso y la naturaleza superficial de la incisión, es posible cerrar la incisión de la piel con una sutura estéril absorbible 5.0 después de que termine el experimento. Los animales fueron inyectados por vía subcutánea con buprenorfina después de los experimentos como analgésico a dosis de 0.1 mg/kg y permite recuperar en un ambiente cálido. Los ratones toleraron el procedimiento muy bien y hemos experimentado ninguna pérdida de los animales ni las infecciones de la trasera en más de 35 animales estudiados. Esto hace posible para el seguimiento o estudio de los animales de manera longitudinal. Los animales utilizados en estos experimentos, sin embargo, fueron anestesiados con 1,8% inhalado isoflurano con oxígeno que fluye en 0,4 L/min aunque una máscara de la anestesia. En contraste con isoflurano anestesia41,42, anestesia FMA no molesta sensibilidad a la insulina periférica. Un plan de futuro es estudiar cómo los ratones recuperan de la anestesia de la FMA.
El compartimiento del músculo aductor es también útil desde varios compuestos vasoactivos mediación local y posteriores efectos vasculares pueden ser evaluados. Por ejemplo, la aplicación tópica de estos compuestos en el tejido Diana es factible utilizando técnicas superfusion28 o manipulación quirúrgica y la implantación de puños farmacoactivos que rodean los vasos43. Además, la arteria gracilis puede ser aislada y estudiada en la laringe de presión. Nuestro grupo y otros se han reunido importantes evidencias experimentales utilizando el miógrafo presión para documentar los efectos de la insulina y otros compuestos vasoactivos sobre esta arteria ex vivo36,37,38.
Una limitación inherente a la utilización de la técnica de la IVM es la exposición quirúrgica del músculo y la aplicación de aceite de parafina para estabilizar los vasos. No está claro si estas acciones impactan el medio ambiente nativo de la arteria. Sin embargo, la Figura 3A muestra que el diámetro de la base de la arteria gracilis bañada en aceite de parafina no cambia considerablemente. Se ha demostrado también que el aceite mineral con éxito inhibe la difusión de oxígeno, protegiendo el tejido de hyperoxic condiciones44. Por otra parte, el aceite ayuda a reducir la variación en el diámetro basal de las arterias. Por esta razón somos partidarios de utilizar aceite de parafina y dejar que el resto de la preparación durante al menos 30 minutos. De nota, el uso de solución salina tamponada en lugar de aceite – o no-dio lugar a diámetros muy variables y constricción de los vasos (datos no mostrados). Por otra parte, al final de los experimentos aislados las arterias gracilis - bañadas en aceite de parafina - y probado su reactividad en la laringe de presión ex vivo. Las arterias de bañado de aceite de parafina reaccionaron del mismo modo para controlar las arterias al ser estimulados con insulina y la acetilcolina (un vasodilatador) (datos no mostrados). La vasodilatación inducida por la insulina consistente muestra claramente que el protocolo IVM descrito en este estudio produce resultados confiables.
La ventaja de aplicar ambas técnicas en el mismo ratón supera algunas de las limitaciones intrínsecas de una técnica por otra: CEUS estima MBV en el músculo en vivo, pero no se pueden ver embarcaciones individuales; IVM, es posible ver embarcaciones individuales, aunque no puede estimar MBV. Un plan de futuro es utilizar microscopía IVM del músculo cremáster en combinación con CEUS del músculo aductor en el lado contralateral. Esta modificación puede proporcionar una estimación de lo MBV (con CEUS) y un acceso óptico directo a los capilares (con IVM). El protocolo puede ser modificado más lejos; el conector de 4 vías utilizado para la cánula de la cola se puede conectar a un conector de 5 vías. Por esto, podemos evitar desmontar el tubo de anestesia al realizar la segunda medición de CEUS (descrita en el punto 2.9). En nuestra experiencia, los ratones toleraron el protocolo actual bien. Otra modificación que se puede hacer en el presente Protocolo es la tasa de fijación de insulina utilizada. Se utilizaron 7,5 tipo pinza mU/kg/min que se considera supra fisiológicas. Según el estudio, puede utilizarse una tasa más baja de insulina abrazadera (3 por ejemplo el mU/kg/min).
Si bien hemos encontrado el protocolo descrito confiable, hay limitaciones específicas que necesitan atención. Hay situaciones cuando la medición del diámetro arterial no es óptima. Ejecución de los pasos de preparación requiere algo de experiencia con el modelo. Es fundamental que el aceite de parafina no gotea desde el entorno del buque como suplementar con aceite nuevo se perturban la nave y cambiar el diámetro, lo que es necesario dejar que el resto de la arteria durante otros 30 minutos. Además, la reflexión de la luz (se describe en paso 1.14 del Protocolo) en la superficie de la parafina era a veces demasiado brillante, lo que dificulta ver la arteria. Esto puede ser contrarrestado por dirigir la fuente de luz para que la luz cae en un ángulo para el aceite de parafina superficial y paralelo a la arteria.
En conclusión, la combinación de técnicas de IVM y CEUS que se describe en este estudio hace posible cuantificar los efectos diferentes de la insulina en los diferentes niveles de la vasculatura. IVM de la arteria gracilis proporciona una idea de los cambios vasculares ascendentes contribuyendo a aguas abajo de la perfusión microvascular con CEUS. Abogamos por la combinación de varias técnicas experimentales en el ratón mismo para mejor evaluar la función vascular.

En respuesta a un aumento en el nivel de glucosa en sangre, el páncreas secreta insulina en el torrente sanguíneo donde se distribuye rápidamente a los tejidos de la blanco tales como músculo esquelético, a través de las arterias de resistencia y capilares. Músculo esquelético es responsable de ~ 80% de absorción de glucosa postprandial1. La entrega de la insulina en el intersticio del músculo esquelético se ha demostrado que un índice de limitar el paso de las acciones metabólicas de la insulina que promueven la eliminación de glucosa2,3,4. Dentro de 10-15 min, la insulina aumenta el volumen de sangre capilar (reclutamiento microvascular), un efecto que se produce antes de que el flujo sanguíneo total aumenta5,6. Contratación microvascular expande la superficie endotelial disponible para intercambio de nutrientes (e insulina)7,8. Mediada por la insulina microvascular precede y está independientemente asociada con cambios en el músculo esquelético la glucosa absorción8,9. El efecto de la insulina sobre la vasculatura se ha denominado 'sensibilidad a la insulina vascular'.
Se ha demostrado que el reclutamiento microvascular mediada por la insulina y la vasodilatación inducida por la insulina son deterioradas en obesas Zucker ratas10,11. Por otra parte, lean ratones con menor densidad capilar Mostrar músculo insulina resistencia12. En su influyente trabajo, Kubota et al demostró que insulina deteriorada señalización en las células endoteliales causado reducción en reclutamiento microvascular inducida por la insulina, que reduce la absorción de glucosa en músculo esquelético por aproximadamente 40%13. Estas anormalidades en la función microvascular no sólo ocurren en el músculo, sino también en varios otros tejidos y órganos como el corazón, retina y riñón14,15,16. Estos ejemplos y otros estudios17,18,19,20 sugieren que los efectos vasculares de la insulina son un mecanismo importante en la fisiología (patho) de resistencia a la insulina y su complicaciones.
Mientras que hay pruebas sustanciales de que la insulina aumenta volumen sanguíneo microvascular (MBV) en músculo esquelético5,6, los mecanismos por los cuales esto ocurre no son completamente entendidos9. Vasodilatación dependiente del endotelio es esencial en muchos aspectos de la vascular insulina sensibilidad21,22,23 a diferentes niveles de la vasculatura. Sensibilidad a la insulina vascular se puede manifestar por la relajación inducida por la insulina de las arterias de resistencia y por la relajación de las arteriolas pre capilares para aumentar la perfusión microvascular cambio superficie7,24, 25.
La microscopia intravital (IVM) se ha utilizado en una variedad de preparaciones de tejido incluyendo cámaras de pliegues de ratón dorso26, el mesentery del ratón y rata27modelos de isquemia del miembro en el ratón28 y la bolsa de la mejilla del hámster 29. ecografía de contraste (CEUS) es otra técnica de imagen que permite la evaluación de la microcirculación cardiaca30 como músculo esquelético31. Utiliza microburbujas llenas de gas inerte que se comportan rheologically como células de sangre rojas y permanecen completamente dentro del lumen vascular. Estas microburbujas se infundieron por vía intravenosa a un ritmo constante para lograr un estado estacionario. Una onda de ultrasonido de alta energía, entonces, puede utilizarse para destruir las microburbujas. Velocidad de reposición de las microburbujas en la región de interés (ROI) representa la velocidad de flujo (MFV). La intensidad total de la señal de la imagen de contraste representa la MBV. CEUS puede realizarse varias veces (también en seres humanos) y ha avanzado en la comprensión de la disfunción vascular que se produce en Estados de resistencia a la insulina (discutidos en Barrett et al. 32).
En el presente estudio Describimos una nueva técnica para estudiar la regulación de la perfusión muscular, a través del uso simultáneo de IVM y CEUS. Aquí nos centramos en acciones vasculares de la insulina en el compartimiento aductor de la trasera del ratón. Este compartimiento es uno de los mayores grupos de músculo esquelético en el ratón, lo que permite estudios de la absorción local de la glucosa en un músculo representativo. Este compartimiento es ideal para IVM, la preparación y la visualización de las arterias son fácilmente accesibles por un procedimiento quirúrgico estandarizado28. Por otra parte, nuestro propio grupo y otros han demostrado que el CEUS puede ser utilizados en este compartimiento33,34.
Una ventaja de la técnica combinada de IVM y CEUS es la posibilidad de evaluar el efecto de la insulina a nivel de las grandes arteriolas (arterias de alimentación o resistencia) y de la microcirculación (capilares camas) en el mismo grupo muscular. Además, la aplicación simultánea de los dos métodos proporciona la penetración en la temporal acción de la insulina a nivel de las arterias de resistencia y la microcirculación. Esto combinado IVM y técnica CEUS puede aplicarse también en otros campos de la biología vascular. Por ejemplo, la función de varias proteínas y ciertas condiciones fisiopatológicas que afectan el endotelio puede estudiarse mediante modelos de octavos de final. Además, ambas técnicas pueden utilizarse en un ratón en varios puntos de tiempo, reduciendo el tiempo y costo de la investigación.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Ratones</td><td>Río</td><td></td> Charles <td>Los ratones utilizados fueron criados internamente por el</td></tr><tr><td>sistema de ultrasonido de alta resolución Vevo 2100</td><td>de VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transductor no lineal MS250</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 software</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido (Aquasonic 100, incoloro)</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009</td><td>Gel de ultrasonido utilizado para transmitir las ondas de ultrasonido</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR international</td><td>58815-234</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica&nbsp;</td><td>Pantlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Precision Xceed&nbsp;</td><td>Abbott</td><td></td><td>Para medir el nivel de glucosa en sangre durante el pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico</td></tr><tr><td>Insulina Novorapid</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa monohidrato&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>1083421000</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada</td><td>B. Braun</td><td>152118062</td><td></td></tr><tr><td>PE-20 tubo médico</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427405</td><td></td></tr><tr><td>Aguja, calibre 27&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson & Co</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Cinta médica</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr>Soporte <td></td><td></td><td>de</td><td>sonda de ultrasonido</td> Incorporado</tr><tr><td>Hisopos de</td><td></td><td></td> algodón <td>Múltiple</td></tr><tr><td>Depilador</td><td></td><td></td> de crema equivalente <td>múltiple Adhesivo</td></tr> de <tr><td>tejido de gel</td><td>Derma+flex</td><td>GA30005-2222</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de infusión</td><td>Harvard Aparato</td><td>Harvard Apparatus PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras pequeñas y rectas finas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas rectas con punta fina</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Basler</td><td>scA1390-17gc</td><td></td></tr><tr><td>Programa Image Grabber</td><td>Integrado en el</td><td></td><td>propio sistema de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas, 1 mL</td><td>Fisher</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz, fibra óptica</td><td>Schott</td><td>KL1500</td><td>Idealmente tiene brazos ajustables</td></tr><tr><td>Aceite de parafina</td><td></td><td></td><td>Equivalente múltiple</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Microbubbles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfocolina&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365C</td><td></td></tr><tr><td>estearato de polioxietileno&nbsp;</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>p3440</td><td></td></tr><tr><td>gas perfluorobutano&nbsp;</td><td>F2 Chemicals</td><td>C4F10(g)</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico Decon FS200&nbsp;</td><td>Decon Ultrasonics Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix &nbsp;</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515370-0810</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Contador Coulter Beckman</td><td>Coulter Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combina la microscopia intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Se ha demostrado que acciones vasculares de la insulina contribuyen a la regulación de la sensibilidad a la insulina. Efectos de la insulina en perfusión muscular regulan postprandial entrega de nutrientes y hormonas a los tejidos sensibles a la insulina. Aquí describimos una técnica para combinar la microscopia intravital (IVM) y la sonografía contraste (CEUS) el compartimiento aductor de la trasera del ratón para visualizar simultáneamente las arterias de resistencia muscular y de la perfusión de la la microcirculación en vivo. Al mismo tiempo evaluar el efecto de la insulina en múltiples niveles del árbol vascular es importante estudiar las relaciones entre los múltiples efectos vasoactivos de la insulina y de la perfusión muscular. Se realizaron experimentos en este estudio en ratones. En primer lugar, se introduce la cánula de la vena de la cola para la infusión de la anestesia, compuestos vasoactivos y agente de contraste de ultrasonido (microburbujas encapsuladas de lípidos). En segundo lugar, una pequeña incisión en la ingle para exponer el árbol arterial del compartimiento del músculo aductor. La sonda de ultrasonido se coloca entonces en el miembro superior contralateral posterior a ver los músculos de la sección transversal. Evaluar parámetros de línea de base, se evalúa el diámetro arterial y microburbujas posteriormente se infunden a un ritmo constante para estimar el flujo de sangre muscular y volumen sanguíneo microvascular (MBV). Cuando se aplica antes y durante una abrazadera euglycemic hyperinsulinemic, IVM y CEUS combinados permiten evaluar los cambios inducidos por la insulina del diámetro arterial, la perfusión microvascular del músculo y sensibilidad a la insulina de todo el cuerpo. Por otra parte, la relación temporal entre las respuestas de la microcirculación y las arterias de resistencia a la insulina puede ser cuantificada. También es posible durante el seguimiento el tiempo longitudinalmente en ratones, lo que es una herramienta valiosa para estudiar los cambios en la sensibilidad a la insulina vascular y cuerpo entero.

Velocidad de infusión de glucosa durante la abrazadera euglycemic hyperinsulinemic (sensibilidad a la insulina) fue 180.21 ± 19.81 μmol/kg/min la aplicación Local de aceite de parafina en el compartimiento del músculo aductor para estabilizar la nave no cambió el diámetro basal promedio de las arterias (μm ± 29.0 73,6 vs 68,8 ± 17,9 μm; p = 0,58) pero ayudó a reducir la variación de los animales probaron (Figura 4A). Insulina constantemente aumentaron el diámetro de la arteria gracilis (14,58 ± 6,2% a los 60 min; N = 9) que fue significativamente diferente (p &lt; 0.0001) por el cambio de diámetro causado por infusión salina (-6.3 ± 4,9%; N = 6). Vasodilatación inducida por la insulina fue apreciable después de 10 min (10,09 ± 5,1%; p = 0,002) y alcanzó aproximadamente el 95% de su capacidad máxima de dilatoria después de 30 minutos.
Uso de CEUS, insulina constantemente aumentaron músculo MBV (figura 5A) 33,5% (± 31.04%, N = 7; p = 0.0009) comparado con infusión salina (-10.63 ± 27.87%, N = 6) (figura 5B). Los datos presentados son las intensidades de señal del músculo de los MBV dividido por en los vasos femorales. Esto reduce la variación experimental entre las diferentes medidas y diferentes ratones (datos no mostrados). La intensidad de señal en los vasos femorales corresponde linealmente con la concentración de microburbujas en la circulación (figura 3). Corrección de señal de los vasos femorales en teoría corrige las diferencias en las concentraciones de microburbujas utilizado (figura 3D). Datos se presentan en esta sección como media ± desviación estándar.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig1.jpg"> Figura 1: Exposición quirúrgica del compartimiento aductor de la trasera. (A) se hace una incisión en la ingle, paralelo a la dirección del ligamento inguinal. (B) tracción suave en la almohadilla de grasa en las direcciones distales (flechas negras) presentará el tejido conectivo (*) entre la almohadilla de grasa y la pared abdominal. Pliegues (C) la piel de la incisión pueden ajustarse usando la pinza bulldog para crear una pequeña cavidad para contener el aceite de parafina que baña los vasos. (D) el ultrasonido sonda se coloca en el miembro superior contralateral posterior después de la arteria preparado gracilis es vista usando un microscopio calibrado. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig2.jpg"> Figura 2: Microscopia intravital de la trasera del ratón. La arteria femoral (A) da lugar a la arteria epigástrica (B) y la arteria gracilis (C) que se extiende sobre el grupo de músculo aductor (D). La arteria gracilis se utiliza para el IVM utilizando un microscopio calibrado. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig3.jpg"> Figura 3: Señal de intensidad de la ecografía de contraste en el volumen de sangre Microvascular del músculo y los vasos femorales. (A) visión no lineal del contraste de la imagen modo de la plataforma digital de la proyección de imagen durante la infusión constante de microburbujas en un ratón macho superior trasera. Panel de la derecha: dos ROIs se dibujan para representar el músculo MBV y los vasos femorales. Sólo la parte superficial del compartimento músculo aductor está incluida en el ROI como la señal de intensidad disminuye con la profundidad. Panel de la izquierda: curva de tiempo-intensidad del músculo MBV ROI. Las líneas verticales representan la destrucción de las microburbujas (MBD) con ondas de alta energía. Inmediatamente después de la MBD, medio de contraste no está presente en el plano de proyección de imagen que empieza a llenar poco a poco con microburbujas. Después de 10-15 s, se ha alcanzado el pico del realce del contraste. (B-D) Después de una señal de estado estacionario se alcanzó, se duplicó la velocidad de infusión de 2,5 x 109 burbujas/mL (5, 10, 20 μl/min). Intensidad de señal del músculo MBV (B) y los vasos femorales (C) la duplicación de la concentración de microburbujas en la circulación en paralelo. (D) corrección muscular MBV para la señal de los vasos femorales elimina la variabilidad en la intensidad de la señal causada por concentraciones diferentes de microburbujas (N = 9; barras de error representan la desviación estándar). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig4.jpg"> Figura 4: Mediciones de microscopia intravital de la arteria Gracilis. (A) aceite de parafina reduce la variación de las arterias de gracilis de diferentes animales (que es 29.0 μm sin parafina vs 17,9 μm después de aplicar el aceite), manteniendo el diámetro basal promedio estable (73,6 μm vs 68,8 μm; p = 0.58). (B) diámetro Arterial en condiciones basales y después de 60 min de infusiones de insulina o solución salina. Insulina después de 60 min infusión constantemente dilatada la arteria gracilis (p &lt; 0.0001) comparado con infusión salina. (C) la vasodilatación inducida por la insulina se produce en 10 minutos después del comienzo de la infusión (p = 0.002) y alcanza el 95% de la máxima en 30 minutos barras de Error representan desviación de estándar; prueba T de Student se utiliza para la estadística. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig5.jpg"> Figura 5: Microvascular mediciones de volumen de sangre mediante ecografía de contraste del compartimiento del músculo aductor de la trasera del ratón. Insulina (A) resultó en un aumento constante de MBV 30 min después del comienzo de la infusión de insulina. (B) la diferencia entre el hyperinsulinemic y las mediciones de línea base (cambio MBV) se denota como el reclutamiento microvascular mediada por la insulina. Insulina inducida por un 33,5% (± 31.04%, p = 0,016; N = 7) reclutamiento microvascular comparado con infusión salina (-10.63 ± 27.87%, N = 6). Barras de error representan la desviación estándar. prueba T de Student se utiliza para la estadística. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Vasodilatación inducida por la insulina regula la perfusión muscular y aumenta la microvascular superficie (reclutamiento microvascular) disponibles para el intercambio de solutos entre la sangre y del tejido intersticio. Combinado la microscopia intravital y ecografía de contraste se presenta para evaluar simultáneamente la acción de la insulina en los vasos más grandes y la microcirculación en vivo.

Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

El objetivo general de esta técnica combinada de ecografía con contraste y microscopía intravital es visualizar simultáneamente las arterias resistentes a los músculos y estudiar la perfusión de la microcirculación del músculo esquelético in vivo. Este método ayuda a responder preguntas clave en los campos de la diabetes tipo 2 y la obesidad sobre la regulación de la sensibilidad a la insulina y el flujo sanguíneo de los órganos. El día del procedimiento, después de desinfectar el área de operación y el equipo con una solución a base de alcohol, equipe una pieza de tubo de PE20 de 10 centímetros con una aguja de calibre 27 y conecte el tubo a un conector de cuatro vías.Inserte la aguja en la vena de la cola de un ratón macho CD57 BL6 anestesiado de 20 a 25 gramos en ayunas. Y use gel adhesivo para tejidos para fijar la aguja al tejido de la piel. Coloque el ratón en posición supina y utilice cinta termoestable para fijar los pies, dejando al descubierto la zona superior del muslo.Usando una ligera exo-rotación de la articulación de la cadera, mire las patas de la extremidad trasera hacia arriba con las rodillas en un ángulo de 40 a 60 grados para estandarizar el estiramiento del músculo en el compartimento aductor del muslo. Use una crema depilatoria para eliminar bilateralmente el vello en las áreas de la ingle y la parte superior del muslo, recogiendo todo el vello suelto con un hisopo de algodón húmedo. A continuación, coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10 a 16X, y haga una incisión de dos centímetros paralela al ligamento inguinal, justo lateral a la curvatura abdominal.Es importante practicar la colocación de la incisión en la piel, que debe ser lo suficientemente pequeña como para que el perifemoral no se filtre, pero lo suficientemente grande como para que se pueda ver la vasculatura. Con una pinza de bulldog, aplique tracción al lado distal de la incisión, luego diseccione el tejido adiposo lejos de la pared abdominal, separando suavemente la almohadilla de grasa de la pared en dirección distal en lugar de diseccionar directamente a través de la almohadilla para evitar sangrado. Identificar la arteria femoral, siguiendo el vaso hasta las arterias epigástrica y gracilis y la fascia profunda transparente que cubre los músculos y los vasos.Con pinzas afiladas, tire de la fascia hacia arriba y corte el tejido con unas microtijeras. Luego cubra el músculo expuesto con una gota de 200 microlitros de aceite de parafina para evitar que el tejido se seque y use la pinza bulldog para organizar estos pliegues de la piel de la incisión para hacer una pequeña cavidad para sostener el aceite bañando los vasos. Ahora ajuste el mouse para que la arteria gracilis esté vertical en la pantalla de la computadora con un aumento de 16X y coloque una fuente de luz a un mínimo de 20 centímetros de la extremidad posterior para reducir la conducción de calor de la luz.Se aplica gel de transducción de ultrasonido precalentado en la extremidad posterior contralateral superior y se coloca la sonda de ultrasonido perpendicular al eje largo del hueso del fémur. Ajuste cuidadosamente el ángulo y la dirección de la sonda de ultrasonido para obtener una vista transversal del grupo muscular aductor, teniendo cuidado de mantener la posición de la sonda estable para mantener el mismo plano de imagen para las mediciones iniciales e hiperinsulinémicas. La colocación de la sonda ecográfica debe estandarizarse de forma que se estudie la misma porción de la extremidad posterior superior en todos los ratones con la sonda en la misma posición para las mediciones basales e hiperinsulinémicas.Después de colocar correctamente la sonda de ultrasonido y haber preparado con éxito la arteria gracilis para las mediciones, deje que los ratones se estabilicen durante 30 minutos. Después de un período de estabilización de 30 minutos, proceda a realizar las mediciones de referencia. Mida y guarde el diámetro basal de la arteria gracilis.Dado que las microburbujas solo se pueden ver en el modo de contraste de la máquina de ultrasonidos, configure los parámetros apropiados en el sistema de imágenes para la evaluación de microburbujas. Nivele la ubicación de las zonas focales al centro de la región de interés y guarde un clip de cinco segundos para calcular la señal de fondo. Direccionan las microburbujas a una concentración de 2,5 veces 10 a 9 burbujas por mililitro, y agitan manualmente el vial que contiene las microburbujas para obtener una suspensión uniforme.Comience a infundir las microburbujas a través de la cánula de la vena de cola a una velocidad de cinco microlitros por minuto, manteniendo el tubo de infusión en un vórtice vibratorio para mantener una suspensión uniforme de microburbujas. Después de cinco minutos de infusión continua, utilice la función de destrucción de microburbujas para generar curvas de intensidad de tiempo de las burbujas a los cinco y 10 minutos al comienzo de la infusión de microburbujas. Evalúe la glucosa en sangre de la vena de la cola cada cinco minutos.Una vez obtenidos los datos basales, se debe iniciar el pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico utilizando la cánula de cola para administrar 200 miliunidades por kilogramo de bolo de insulina. Mantenga una infusión continua de insulina de 7,5 miliunidades por kilogramo por minuto durante 60 minutos. La monitorización seriada del nivel de glucosa en sangre debe realizarse en gotas de sangre obtenidas de la punta de la cola, como se ha mostrado anteriormente.Utilice una infusión variable de glucosa al 20%DE para mantener la euglucemia. Con el software de imágenes, mida el diámetro de la arteria gracilis en los puntos de tiempo deseados después del inicio del pinzamiento euglucémico hiperinsulinémico. Después de 25 y/o 55 minutos, comience la segunda medición de ultrasonografía hiperinsulinémica con contraste, para monitorizar el volumen sanguíneo microvascular a los 30 y/o 60 minutos, respectivamente, como se acaba de demostrar, utilizando el puerto de anestesia para infundir las microburbujas.Como lo demuestran estos datos, la aplicación local de aceite de parafina en el compartimiento del músculo aductor estabiliza el vaso sin cambiar el diámetro promedio de referencia de las arterias y ayuda a reducir la variación entre los animales analizados. La infusión de insulina aumenta constantemente el diámetro de la arteria gracilis en comparación con los cambios de diámetro inducidos por la infusión de solución salina, con una vasodilatación inducida por la insulina evidente después de 10 minutos y una capacidad dilatadora máxima de aproximadamente el 95% después de 30 minutos. Mediante el uso de la ultrasonografía con contraste, la insulina también aumenta constantemente el volumen sanguíneo microvascular muscular en comparación con la infusión de solución salina.La intensidad de la señal en los vasos femorales se corresponde linealmente con la concentración de microburbujas en la circulación, con ajustes en la señal del vaso femoral, corrigiendo teóricamente las diferencias en la concentración de microburbujas utilizadas. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar reactivos y microburbujas recién preparados, y dejar que el ratón se estabilice durante 30 minutos con anestesia continua antes de realizar las mediciones experimentales.Después de este procedimiento, se pueden probar nuevos medicamentos para responder preguntas adicionales, como por ejemplo, cuál es el efecto de un nuevo componente vasoactivo en la vasculatura. Tras su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los científicos en el campo de la biología vascular evalúen los efectos de nuevos tratamientos y el cambio de interés en ratones norco. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar simultáneamente el diámetro de las arterias resistentes a los músculos y evaluar la perfusión de la extremidad posterior del ratón in vivo, utilizando microscopía intravital y ecografía con contraste.

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Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina (Video) | JoVE Journal

Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

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