Name: Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende a etiquetar xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama usando partículas lentivirales con reporteros GFP y luciferasa. Este método permite el seguimiento del crecimiento tumoral y la detección de metástasis mediante imágenes in vivo.

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Los autores agradecen al Dr. Darrel Kotton la Universidad de Boston para proporcionar el fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W de vectores y protocolos para la producción de lentivirus de alto título usado en estos estudios. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), el NCI K22CA181250 (DMC) y R01 CA140985 (CAS) subvención .NCI P30CA046934 Centro apoyado en imágenes in vivo y el cultivo de tejidos núcleos a Universidad de Colorado AMC.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos en el protocolo: El uso de partículas de lentivirus de título alto (&gt; 10 8 TU / ml) es un paso crítico en el éxito de este protocolo, ya que permite un control cuidadoso de la composición de los medios de comunicación durante la transducción in vitro. Si bien varios métodos para la producción de partículas virales de alto título han sido bien descritos 18,19; Este protocolo utiliza partículas lentivirales producidos como s...

El desarrollo de xenoinjertos derivados de pacientes tumorales (PDXs), donde las muestras de tumor resecado quirúrgicamente injertados directamente en ratones inmunocomprometidos, ofrece varias ventajas sobre los modelos estándar de xenoinjertos de la línea celular y representa un avance importante en la investigación del cáncer 1,2. PDXs pueden ser mantenidos y expandido en pasajes sucesivos con una mínima alteración de las características genéticas y biológicas del tumor crecido en el primer paso; y reflejar con mayor precisión la heterogeneidad del tumor de xenoinjertos derivados de las líneas celulares de cáncer humano 3-8. Estos modelos se utilizan ahora ampliamente como una plataforma para la personalización de la terapéutica del cáncer 9,10, como una plataforma preclínica en el desarrollo de fármacos y 6,11 como una herramienta experimental para el estudio de la biología del cáncer 4,12. La mayoría de PDXs se implantan y se propagan por vía subcutánea, que permite que sea viable la medición del crecimiento del tumor con el tiempo usando calibradores. sin embargo, La enfermedad metastásica ha sido más difícil de modelar utilizando PDXs. Específicamente para el cáncer de mama, xenoinjertos con capacidad metastásica a los diferentes órganos se han descrito 3,5,13, pero la frecuencia de difusión espontánea a los sitios de metástasis es extremadamente baja. Cuando se informó, la identificación y cuantificación de la carga metastásico se basa en el examen histológico de los órganos diana laboriosa post-mortem. líneas celulares de cáncer que expresan bioluminiscente (luciferasa, Luc) o fluorescente (proteína verde fluorescente, GFP) reporteros de genes se utilizan comúnmente en modelos experimentales de metástasis de cáncer de mama a cerebro, pulmón, hueso e hígado después de intracardíaca, cola-vena, intrafemoral y la inyección esplénica 14-16. Aunque estos modelos evitan la difusión de los tumores primarios, que son valiosos para estudiar los mecanismos de tropismo de órganos y la colonización metastásica. Sin embargo, las células derivadas de tumores de pacientes primarios y PDXs pueden tener baja las tasas de transfección o transducción using procedimientos estándar. Una alternativa es establecer líneas celulares derivadas de PDX in vitro 17, que puede ser etiquetado a continuación, utilizando protocolos de cultivo de tejidos convencionales. Esta estrategia, sin embargo, no es adecuado para la mayoría de etiquetado PDXs, para lo cual la línea de células derivación es difícil y puede cambiar el fenotipo de las células. Aquí se presenta un protocolo para la transducción de las células tumorales disociadas-PDX con lentiviral vectores adecuados para la formación de imágenes in vivo. Además, se describe la metástasis experimental usando inyección intracardíaca de células PDX luc-GFP etiquetados disociadas en ratones inmunocomprometidos. Un protocolo básico para la transducción de organoides disociadas-PDX con el gen reportero que expresa lentivirus se ha descrito previamente 18. En el protocolo actual se describen métodos adicionales para enriquecer en células tumorales humanas y obtener cerca de la eficiencia de transducción de 100%, así como el uso de PDXs marcados para la detección de cáncer de mama experimentalmetástasis. Este protocolo se puede adaptar para el etiquetado de múltiples tipos de cáncer de PDXs con diversos marcadores luminiscentes y fluorescentes, así como la modulación de la expresión génica (es decir, desmontables shRNA de genes de interés).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hongos-antibióticos</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105-500</td><td>Tampón de digestión</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Red Ca2+/Mg2+ libre</td><td>de Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex</td><td>Cultrex</td><td>3433-005-01 Extracto de</td><td>matriz de basamento (BME)</td></tr><tr><td>30 &#176; Agitador C</td><td>NewBrunswick Scientific CO. INC</td><td>Serie 25 Incubadora Shaker</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; m filtros</td><td>Falcon</td><td>7352350</td><td></td></tr><tr><td>bisturíes</td><td>Fisher 22079690</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidina desinfectante</td><td>Durvet&nbsp;</td><td>NDC# 30798-624-35</td><td></td></tr><tr><td>Sangre roja&nbsp; reactivo de lisis celular</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Neuraminidasa</td><td>Sigma</td><td>N7885-1UN</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326+) microperlas*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-061-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit de depleción de células de linaje, ratón*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separador&nbsp;</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mini MACS Soporte magnético</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS Se</td> pueden utilizar columnas <td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>MS o LS, ajustar al número de celdas.</td></tr><tr><td>Illumatool Sistema de luz sintonizable</td><td>Investigación de Lightools</td><td>Varios</td><td>Para imágenes de fluorescencia in vivo</td></tr><tr><td>Dispositivo de imagen de IVIS200 Xenogen</td><td></td><td>Varios</td><td>Para imágenes de luminiscencia in vivo</td></tr><tr><td>Clon de citoqueratina humana MNF116 Anticuerpo monoclonal</td><td>DAKO</td><td>M0821</td><td>Pan-citoqueratina&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmico</td><td>Señalización celular</td><td>4267S</td><td>EGFR</td></tr></tbody></table>

etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama trazables reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis estudios

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

El uso de modelos preclínicos para estudiar la biología tumoral y la respuesta al tratamiento es fundamental para la investigación del cáncer. Las líneas celulares humanas establecidas desde hace mucho tiempo, y muchos modelos de ratones transgénicos, a menudo no logran recapitular los aspectos clave de las neoplasias malignas humanas. Así, se están desarrollando modelos alternativos que representan mejor la heterogeneidad de los tumores de los pacientes y sus metástasis. Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente (PDX) en los que las muestras tumorales resecadas quirúrgicamente se injertan en ratones inmunocomprometidos se han convertido en una alternativa atractiva, ya que pueden trasplantarse a través de múltiples generaciones y reflejan de manera más eficiente la heterogeneidad tumoral que los xenoinjertos derivados de líneas celulares de cáncer humano. Una limitación para el uso de PDX es que son difíciles de transfectar o transducir para introducir reporteros rastreables o para manipular la expresión génica. El protocolo actual describe métodos para transducir células tumorales disociadas de PDX con alta eficiencia de transducción, y el uso de PDX marcadas para modelos experimentales de metástasis de cáncer de mama. El protocolo también demuestra el uso de PDX marcadas en modelos experimentales de metástasis para estudiar el proceso de colonización de órganos de la cascada metastásica. Las metástasis en diferentes órganos pueden visualizarse y cuantificarse fácilmente mediante imágenes bioluminiscentes en animales vivos, o la expresión de GFP durante la disección y en órganos extirpados. Estos métodos proporcionan una herramienta poderosa para extender el uso de múltiples tipos de PDX a la investigación de la metástasis.

Este método describe la transducción de las células del cáncer de mama disociadas-PDX utilizando vectores lentivirales de alto título pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro y el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W. Estos vectores expresan un marcador fluorescente que permite la estimación de la eficacia de la transducción in vitro, tan pronto como 24 horas después de la infección (Figura 1a). Para la mayoría de PDXs, la expresión de GFP se retrasará hasta 72 hr después de la infe...

Se describe un método para el marcaje estable de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) con partículas lentivirales que expresan la proteína y luciferasa indicadores verdes fluorescentes. Este método permite el seguimiento del crecimiento de PDXs en el sitio principal, así como la detección de metástasis espontáneas y experimentales utilizando en sistemas de imágenes in vivo.

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

El objetivo general de este protocolo de transducción es introducir de manera estable genes reporteros en xenoinjertos derivados de pacientes, o PDX, para facilitar su uso en modelos experimentales y de metástasis espontánea. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación del cáncer, como el grado de metástasis extracutánea proveniente de xenoinjertos derivados de pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que los PDX marcados pueden rastrearse mediante imágenes in vivo, lo que facilita la evaluación de metástasis específicas y organizadas sin necesidad de un análisis histológico extenso post mortem.Este protocolo será demostrado por Jessica Finlay-Schultz, una investigadora posdoctoral, quien aplica rutinariamente este procedimiento para el etiquetado de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama. Utilizando técnica aséptica, comience cortando la piel alrededor del tumor con un escalpelo. Luego, tire de la piel con pinzas y use un escalpelo limpio para separar la piel del tumor.Cuando el tumor esté completamente expuesto, utilice un juego limpio de pinzas y bisturí para transferir el tejido a cinco mililitros de medio de lavado sobre h

labeling-breast-cancer-patient-derived-xenografts-with-traceable

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La tomografía de fluorescencia difusa ofrece un enfoque relativamente de bajo costo y alto potencial de toda la...

Guiada por tomografía computarizada dominio del tiempo de fluorescencia difusa tomografía en pequeños animales para la localización de biomarcadores de cáncer

El siguiente video describe una técnica de transducción para marcar (xenoinjertos derivados del paciente) células tumorales PDX, que se utiliza para introducir lentivirus que expresan proteína verde fluorescente y reporteros de luciferasa en la célula tumoral in vitro.

Transducción para marcar células tumorales PDX: introducción de un marcador fluorescente que expresa lentivirus en la célula tumoral in vitro

Este manuscrito detalla un método utilizado para generar xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de próstata (PDX) a partir de células tumorales circulantes (CTC). La generación de modelos PDX a partir de CTCs proporciona un modelo experimental alternativo para estudiar el cáncer de próstata; Es el tumor más comúnmente diagnosticado y una causa frecuente de muerte por cáncer en los hombres.

Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

La metástasis del cáncer de ovario se caracteriza por numerosas lesiones intraperitoneales difusas, por lo que la cuantificación visual precisa de la carga tumoral es un desafío.  En este trabajo describimos un método para la cuantificación in situ y ex vivo de la carga tumoral metastásica utilizando células tumorales marcadas con proteína fluorescente roja (RFP) e imágenes ópticas.

La cuantificación de la intra-peritoneal del cáncer ovárico Metástasis

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

Se describe un protocolo para la preclínica en vivo rastreo de metástasis del cáncer. Se basa en un reportero con radionúclidos-fluorescencia combina el sodio yoduro symporter, detectado por tetrafluoroborato de no invasivo [18F]-PET y una proteína fluorescente para la confirmación de racionalización ex vivo . El método es aplicable para la preclínica en vivo de la célula de seguimiento más allá de la biología del tumor.

Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Este trabajo preestablece un protocolo avanzado para evaluar con precisión la carga del tumor mediante la detección de señales de proteína fluorescente verde y bioluminiscencia, así como la integración de la técnica de detección molecular cuantitativa.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Este protocolo describe un método eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama en ratones. La técnica consiste en la disociación enzimática del tumor seguida de una inyección directa en las almohadillas de grasa mamaria, lo que permite una implantación de alto rendimiento. La validación exhaustiva garantiza la fidelidad del modelo, lo que facilita estudios rigurosos en varios subtipos de cáncer de mama.

Disociación de alto rendimiento e implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama

Aprende a etiquetar xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama usando partículas lentivirales con reporteros GFP y luciferasa. Este método permite el seguimiento del crecimiento tumoral y la detección de metástasis mediante imágenes in vivo.

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios (Video) | JoVE Journal

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

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