Estudio comparativo de los métodos de entrega de fármacos dirigidos a la oreja del ratón interno: Bullostomy vs. Inyección transtimpánicos

El objetivo general de este trabajo es describir y comparar dos enfoques de microcirugía para la administración local de fármacos al oído interno en términos de impacto en los parámetros auditivos y los marcadores de citoarquitectura coclear. Estos procedimientos pueden ayudarnos a responder preguntas clave en el campo auditivo, especialmente en el desarrollo de estudios proquímicos en animales. La principal ventaja de estas técnicas es que son mínimamente invasivas.

Y esto permite que la sustancia llegue didácticamente al oído interno. La aplicación de estas técnicas se extiende hacia la terapia de la hipoacusia, ya que sus procedimientos microquirúrgicos son adecuados para el parto seco en el oído medio. La demostración pacífica de este método es fundamental, ya que la bullostomía y la inyección transtimpánica son difíciles de aprender y requieren un conocimiento anatómico y formación quirúrgica.

Para empezar, coloque un tapón en el oído contralateral de un ratón anestesiado para obtener respuestas predominantemente monoaurales. Luego, coloque el mouse en posición prona sobre una almohadilla térmica dentro de una cámara atenuadora del sonido. Coloque el electrodo de aguja subdérmica positivo de acero inoxidable en el cuero cabelludo entre las orejas sobre el vértice del cráneo.

Coloque el electrodo de referencia en la región parótida debajo del pabellón auricular. A continuación, coloque el electrodo de tierra en la región de la parte posterior, la cola o la extremidad trasera. Compruebe la impedancia eléctrica en los electrodos positivo y negativo.

Asegúrese de que la impedancia sea inferior a tres kiloohmios. Coloque el altavoz precargado a una distancia fija frente al oído seleccionado, con el centro del altavoz alineado con el canal auditivo externo. Asegúrese de que no haya obstáculos entre el altavoz y el oído, y que el pabellón auricular esté completamente abierto.

Conecte la salida de la estación de trabajo digital a analógica al altavoz seleccionado. Aquí se utilizan altavoces de campo libre. Conecte un amplificador con poco ruido y una buena relación señal-ruido a la entrada analógica a digital.

A continuación, comience el proceso para introducir estímulos acústicos en el canal auditivo externo mediante estímulos preestablecidos o nuevas señales diseñadas con el software adecuado. Presente los estímulos comenzando con alta intensidad y disminuyendo la intensidad en pasos de cinco a 10 decibelios de nivel de presión sonora. Registre la respuesta eléctrica en los primeros 10 milisegundos después de la estimulación, ya que las respuestas ABR evocadas aparecen a los seis a ocho milisegundos.

Utilice el software para determinar el umbral ABR como se describe en la parte escrita del protocolo. Después de administrar la anestesia de acuerdo con los protocolos aprobados, verifique que se haya alcanzado un plano quirúrgico de anestesia por la ausencia de una reacción a un pinzamiento del dedo del pie y la presentación de una respiración regular. Use maquinillas para eliminar el pelo en la superficie ventral del cuello y proteger los ojos de la queratitis corneal con un gel a base de hidroxi-propil-metilcelulosa.

Coloque el ratón en el área quirúrgica estéril en decúbito supino. Limpie la piel con una solución antiséptica a base de povidona yodada y cúbrala con un paño estéril. Después de usar un bisturí para hacer una incisión longitudinal de dos centímetros desde la mandíbula hasta la clavícula, observe a través del microscopio quirúrgico e identifique las glándulas submandibulares.

Separe ambas glándulas submandibulares con fórceps, retírelas y localice el origen del músculo digástrico en el nervio facial. A continuación, haga una incisión en el origen del músculo digástrico con una tijera y retírela ventralmente, exponiendo la cara medial inferior subyacente de la bulla timpánica. Luego, usa una aguja de calibre 27 para perforar la bulla y crear una abertura.

Limpie la sangre del área perforada con una esponja de gelatina absorbible. Localiza la arteria estapedial en la membrana redonda de la ventana que está unida a ella. Usando un catéter de calibre 34 y una microjeringa de vidrio, inyecte lentamente de tres a cinco microlitros de solución para vehículos a través de la bullostomía y directamente sobre el nicho de la ventana redonda para llenarla.

Selle la bullostomía con una o dos gotas de adhesivo para tejidos. Regrese las glándulas submandibulares a su posición inicial y cierre las incisiones de la piel con sutura quirúrgica de seda 5-0. Aplique povidona yodada o un antiséptico a base de clorhexidina alrededor de la incisión para evitar la infección de la herida.

Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese al animal a la jaula de la casa solo después de que se haya recuperado por completo. Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral y prepárelo en un área quirúrgica séptica debajo del meato auditivo externo como se muestra anteriormente.

Después de realizar una incisión longitudinal de 0,5 centímetros en la parte vertical del conducto auditivo externo, localice la membrana timpánica con la ayuda del microscopio quirúrgico. Identifica la pars flacida superior en la pars tensa inferior, que está dividida en secciones anterior y posterior por el mango del martillo. A continuación, se realiza una pequeña miringostomía en la porción caudal de la pars flácida y una incisión adicional en la pars tensa de la membrana timpánica para permitir la evacuación del aire durante la inyección.

Use una microjeringa de vidrio conectada a un catéter de calibre 34 para inyectar suavemente de 10 a 15 microlitros de vehículo a través de la pars flaccida, cerca del nicho redondo de la ventana, hasta que el oído medio esté claramente lleno. Cierre las incisiones de la piel con una sutura quirúrgica de seda 5-0 y limpie como se ha descrito anteriormente. Este gráfico muestra los umbrales de ABR en ratones machos C57BL/6J de 8 semanas de edad en respuesta a estímulos de clic antes de la cirugía y a los siete, 14 y 28 días después de la microcirugía.

Los datos de bullostomía se muestran en naranja, los datos de inyección transtimpánica se muestran en azul y los datos de animales no operados se muestran en gris. Este gráfico muestra los umbrales ABR en respuesta a estímulos de ráfaga de tono en el rango de ocho a 40 kilohercios durante el mismo período de tiempo después de la microcirugía. Una vez más, no se observaron diferencias significativas entre la bullostomía y el abordaje transtimppánico.

Los estudios morfológicos demuestran que la rampa media no presenta alteraciones tras el parto del vehículo por bullostomía o inyección transtimpánica, lo que indica que ninguno de los dos procedimientos por sí solo produce daños. Al intentar el procedimiento de bullostomía, es importante recordar revisar la estructura crítica y anatómica que rodea el oído medio e interno de los roedores. Siguiendo estos procedimientos, se podrían realizar otras técnicas.

Por ejemplo, el muestreo de Berlín para estudios farmacocinéticos Después de su desarrollo, estas técnicas allanan el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia auditiva exploren posibles terapias locales en modelos animales, principalmente en roedores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo administrar medicamentos en el oído medio y cómo evaluar la audición en roedores.