La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

El objetivo general de este experimento es comprender cómo responden las células inmunitarias a la reperfusión por isquemia a través de imágenes multifotónicas intravitales de la piel del oído del ratón. Este método puede ayudar a abordar algunas de las cuestiones más importantes en el campo de la Inmunología y la Dermatología para comprender el comportamiento dinámico de las células inmunitarias. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un modelo de imagen robusto para estudiar las actividades celulares en la piel inflamada o en estado de reposo.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las lesiones por reperfusión isquémica, también se puede aplicar a otros sistemas, como las reacciones de hipersensibilidad y las infecciones. Para comenzar este procedimiento, coloque el mouse sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 grados centígrados durante todo el procedimiento de preparación. Confirmar la profundidad de la anestesia por la ausencia de reflejo de pellizco de los dedos del pie.

A continuación, aplique lubricante oftálmico en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Después, aplique cuidadosamente la crema depilatoria en los dos tercios superiores de la oreja dorsal y espere de dos a tres minutos. A continuación, retira la crema con aplicadores de punta de algodón húmedo de forma minuciosa pero suave.

Ahora, induzca la isquemia en la piel del oído del ratón utilizando los imanes de neodimio. Para ello, primero coloque los imanes en sus guías de plástico individuales. Coloque un imán de manera que solo el borde haga contacto con un segundo imán ventral, que debe colocarse debajo del lado ventral de la oreja con la oreja apoyada sobre el imán.

Una vez listo, deje que los imanes se junten con cuidado. Después de 1,5 horas de isquemia, retire los imanes girándolos entre sí con las guías de plástico, permitiendo que se produzca la reperfusión. Inmediatamente después de retirar el imán, administre Evans Blue u otro agente marcador de vasos sanguíneos de su elección por vía intravenosa.

En este paso, corta dos trozos de cinta adhesiva. Deje que los lados adhesivos se peguen entre sí dejando aproximadamente un milímetro de adhesivo a lo largo de su ancho. A continuación, corta la cinta adhesiva en dos para adaptarla a la ranura de la plataforma de la oreja.

Inserte esta cinta adhesiva aproximadamente a la mitad de la ranura, de modo que el lado adhesivo quede hacia arriba. Después de eso, coloque el mouse en la almohadilla térmica de modo que la oreja que se va a fotografiar esté al lado de la tira de cinta adhesiva. Mediante el uso de dos aplicadores de punta de algodón humedecido PBS, presione suavemente la oreja contra la tira adhesiva.

Usando la tira como guía, lleve la oreja del ratón a través de la ranura mientras ajusta simultáneamente el ratón más cerca del escenario. Como la piel de la oreja es muy frágil, este paso debe realizarse con mucho cuidado para evitar lesiones inducidas por la preparación. Para quitar la cinta adhesiva, primero agregue una gota de PBS para reducir la adhesividad de la cinta.

Luego, separe la oreja del ratón de la cinta adhesiva lo más suavemente posible con un pincel fino. Aplana la oreja contra la plataforma de la oreja enrollando suavemente un aplicador de punta de algodón húmedo sobre la oreja. A continuación, coloque una gota de PBS debajo del cubreobjetos y colóquela suavemente sobre la oreja.

Luego, inserte la sonda de temperatura rectal y conecte los cables al sistema de calefacción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para obtener imágenes, coloque al animal bajo el microscopio multifotónico. Comience con una región de imagen que esté muy cerca del borde de la isquemia caracterizada por una fuga masiva de azul de Evans.

El diagrama esquemático muestra la posición de los imanes. Estas dos fotos muestran una oreja pre-isquémica y otra post-isquémica después del pinzamiento del imán. En este esquema de la oreja se indica la región fotografiada con respecto a donde se ha colocado el imán.

Esta secuencia de lapso de tiempo de máxima proyección, muestra la infiltración de neutrófilos en respuesta a la reperfusión en la piel de la oreja de ratón albino LysM-eGFPM después de 1,5 horas de isquemia. En puntos de tiempo anteriores, la falta de la señal azul de Evans indica una oclusión temporal del vaso después de la isquemia. Una vez dominado, las preparaciones para el oído isquémico reperfundido para la obtención de imágenes se pueden realizar en menos de 30 minutos si se realizan correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante verificar constantemente la profundidad de la anestesia y la temperatura del ratón. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de la piel de la oreja del ratón en todo el ratón, para tener una visión global de las localizaciones celulares. Tras el desarrollo de este protocolo, allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Inmunología y la Dermatología exploraran la inmunidad innata en la piel del oído del ratón.

Después de ver estos videos, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un modelo de imágenes de la piel del oído de ratón para estudiar la lesión por reperfusión isquémica. No olvide que trabajar con microscopio multifoto puede ser peligroso. Y se deben tomar precauciones, como la capacitación en seguridad con láser.