El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una In Vitro Sistema

El objetivo general de este experimento es detectar el daño cromosómico inducido por la exposición de las células a material particulado, extraído del aire ambiente. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la materia particulada, y es si la exposición a la materia particulada induce daño cromosómico. La principal ventaja de esta técnica, es que permite la visualización directa del daño inducido en el material genético.

Después de recolectar y analizar partículas de acuerdo con el protocolo de texto, lleve a cabo la exposición a las partículas calentando el medio de crecimiento completo, tripsina al 0,25% y PBS en un baño de agua a 37 grados centígrados, durante al menos 30 minutos antes del inicio del cultivo. Después de lavar 264,7 células crudas, agregue un mililitro de la solución tibia de tripsina a la placa y desaloje las células del fondo del recipiente de cultivo de tejidos raspando. A continuación, recoja las células y haga una suspensión unicelular mediante pipeteo repetido.

Con azul de tripán, cuente el número de células, luego use un medio completo precalentado para colocarlas en una placa a una densidad de 8000 por centímetro cuadrado en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros. Luego use medio completo para ajustar el volumen a 10 mililitros para una concentración final de 50, 000 células por mililitro. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 horas para permitir que se adhieran.

En una cabina de bioseguridad, utilice PBS estéril para diluir las partículas filtradas a una concentración de 0,5 miligramos por mililitro, para una dosis de tratamiento de 5 microgramos por mililitro, y a 5 miligramos por mililitro, para una dosis de tratamiento de 50 microgramos por mililitro. Para tratar las células con material particulado, revise las células cultivadas bajo un microscopio con un aumento de 10x para determinar el crecimiento celular, la morfología celular, la condición del cultivo y la contaminación. Las células deben tener al menos un 30% de confluentes en esta etapa.

Con una pipeta estéril, aspire asépticamente el medio y use dos mililitros de PBS a 37 grados centígrados para lavar el recipiente de cultivo dos veces. Agregue una dosis predeterminada de material particulado con medio fresco e incube los cultivos a 37 grados centígrados y 5% de CO2 para que sean paralelos a la exposición utilizada para los análisis genotóxicos y epigenotóxicos concurrentes. Para detener las células en la metafase, después de lavar las células, agregue dos mililitros de medio precalentado con cinco microlitros por mililitro de solución de colcemida al cultivo, e incube a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante dos horas.

Después de la incubación, retire completamente el medio y use PBS tibio para lavar las células dos veces. Luego agregue la solución de tripsina e incube los cultivos a 37 grados centígrados durante un minuto. Con un raspador de células, separe las células y agregue 10 mililitros de PBS para inactivar la tripsina.

A continuación, pipetea las células hacia arriba y hacia abajo al menos diez veces para crear una suspensión de una sola célula y transfiere las células a un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros. Coloque los tubos en una centrífuga abatible y haga girar la suspensión celular a 400 veces g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Para llevar a cabo el tratamiento hipotónico, retire el sobrenadante de los tubos sin alterar la pastilla celular y deje aproximadamente 0,5 mililitros de PBS.

Rompa suavemente el pellet de celda y use una pipeta P200 para hacer una suspensión de una sola celda. Luego agregue cuatro mililitros de solución de cloruro de potasio precalentada gota a gota agitando suavemente. Incubar la suspensión celular en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos.

Después del tratamiento hipotónico, fije las células agregando un volumen igual de fijador al tubo y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Centrifugar los tubos a 400 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos y retirar el sobrenadante. En esta etapa, la célula habrá aumentado de tamaño y se volverá de color blanquecino y más visible.

Retire el sobrenadante. Agregue cuatro mililitros de fijador fresco e incube los tubos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego centrifugue los tubos, retire el sobrenadante y use cuatro mililitros de fijador para lavar las células dos veces más.

Sumerja completamente los portaobjetos de vidrio en detergente líquido al 10% durante 30 minutos. A continuación, enjuague bien los portaobjetos con agua corriente fría del grifo durante 30 minutos. Use agua destilada para enjuagar los portaobjetos tres veces para eliminar completamente el detergente.

Luego sumérjalos en agua destilada y guarde los portaobjetos en el refrigerador durante la noche. Deje caer diez microlitros de suspensión celular en un portaobjetos húmedo frío y deje que se seque durante la noche a temperatura ambiente. Para teñir y montar las muestras, prepare 50 milímetros de solución de tinción de giemsa mezclando una parte de la solución de tinción de giemsa, con una parte de PBS, y vierta en un frasco de coplin.

Sumerja los portaobjetos en una solución para tintar durante 20 minutos, luego enjuague los portaobjetos en agua destilada para eliminar el exceso de mancha e inmediatamente use un secador de pelo para secar los portaobjetos. Deje los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, aplique una sola gota de medio de montaje en el portaobjetos.

Coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior y permita que el medio de montaje se extienda lentamente sobre la corredera. Luego use una toalla de papel para eliminar el exceso de medio. Por último, utilice un microscopio de campo claro con un aumento de 100x para examinar las aberraciones cromosómicas estructurales en las propagaciones de la metafase.

Esta imagen muestra que una propagación normal de la metafase del ratón, tendrá 40 cromosomas acéntricos. El tratamiento con material particulado induce varias aberraciones cromosómicas, como una rotura de cromátida, un fragmento acéntrico, un cromosoma anillo, un cromosoma discéntrico, minutos dobles, una translocación robertsoniana y una endorreduplicación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo se deben usar células proliferantes.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como M-FISH y SKY, para responder preguntas adicionales. Al igual que si hay aberraciones intercromosómicas y estables. No olvide las precauciones y los carcinógenos, y las precauciones como el uso de guantes, que siempre se deben tomar al realizar este procedimiento.