Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas

El objetivo general de este método derivado de péptidos es transportar genes y proteínas a través de barreras celulares y organulares en plantas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave mediante la modificación de plantas a través de conjugados de péptidos diseñados racionalmente que entregan diversos genes y proteínas para mediar la expresión de genes específicos. La ventaja inmediata de esta técnica es que emplea un procedimiento sencillo de transfección asistida por jeringa en hojas de plantas, basado en péptidos que pueden traspasar límites celulares y organulares.

Desarrollamos este método de transformación vegetal simple, eficaz y novedoso porque los métodos convencionales son costosos, no aplicables a algunos tipos de plantas e incapaces de dirigirse a orgánulos intracelulares. Jo-Ann Church demostrará el procedimiento junto con Yoko Horii, una técnica de mi laboratorio. Prepare la formulación de ADN de plasma peptídico según se describe en el protocolo escrito.

Cuando se añade el péptido al ADN plasmático, se formará una solución turbia. La mezcla se vuelve clara tras la dilución con agua ultrapura hasta el volumen final especificado en el protocolo del texto. Transfiera 800 microlitros de la solución diluida a una cubeta para el análisis de dispersión dinámica de la luz.

Determine el diámetro hidrodinámico y el índice de politispersidad de los complejos formados mediante un zetananosizador. Utilice un láser de helio-neón de 633 nanómetros a 25 grados Celsius con un ángulo de detección de retrodispersión de 173 grados. Tras las mediciones de tamaño, transfiera la solución a una celda capilar plegada para mediciones del potencial zeta con los parámetros predeterminados de constante dieléctrica, índice de refracción y viscosidad del agua a 25 grados Celsius.

Para observar la solución compleja mediante microscopía de fuerza atómica, deposite 10 microlitros sobre la superficie recién expuesta y escindida de una lámina de mica y deje que la mica se seque al aire durante la noche en un recipiente de plástico cubierto. Adquiera una imagen de los complejos en aire a 25 grados celsius utilizando un cantiléver de silicio con una constante de resorte de 1,3 newtons por metro en modo de golpeteo. Utilice Arabidopsis thaliana de tres semanas de edad cultivada bajo un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a 22 grados celsius.

Seleccione al menos tres hojas para la transpección, que servirán como triplicado para la cuantificación de la expresión génica. Cargue una jeringa plástica de un mililitro sin aguja con 100 microlitros de solución compleja para la transfección de una hoja. A continuación, coloque la punta de la jeringa sobre la superficie abaxial de la hoja.

Presione ligeramente la punta de la jeringa contra la hoja y empuje lentamente el émbolo de la jeringa mientras ejerce una presión contraria con el dedo índice de una mano enguantada con guante de látex desde el lado opuesto. La infiltración exitosa puede observarse como la expansión de un área empapada por agua en la hoja. Etiquete las hojas infiltradas para facilitar su identificación.

Incube la planta transfectada con ADN plasmídico de péptidos durante 12 horas en una cámara de crecimiento. Para evaluar la eficiencia de transfección, primero excise la hoja transfectada completa. Para experimentos de transfección que utilicen el vector reportero de Renilla luciferasa, determine cuantitativamente la eficiencia de transfección utilizando un kit de ensayo de Renilla luciferasa.

Primero, coloque cada hoja resecada en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada 100 microlitros de tampón de lisis 1X por tubo. De la misma manera, prepare lisados de hojas control no transfectadas por triplicado.

Muela la hoja utilizando un pistilo de homogenización e incuba el lisado resultante a 25 grados Celsius durante seis a 10 horas. Tras la incubación, centrifuga el lisado a 12.470 × g en una microcentrífuga durante un minuto. Transfiere 20 microlitros del lisado clarificado a un pocillo de una microplaca de 96 pocillos.

Utilice el volumen restante para la cuantificación de la concentración total de proteína mediante un kit de ensayo de proteína BCA según el protocolo del fabricante. A continuación, agregue 100 microlitros de sustrato de ensayo de Renilla Luciferasa al pozo y mezcle mediante pipeteo lento. Coloque la microplaca en un lector de microplacas multimodal e inicie la medición.

Para experimentos de transfección utilizando un vector reportero de proteína verde fluorescente, observe la fluorescencia mediante un microscopio confocal de barrido láser. Primero, corte los bordes de una hoja completa para facilitar la eliminación de los espacios aéreos. Luego, retire el émbolo de una jeringa de 10 milileter y coloque cada hoja o sección de hoja excisa en la jeringa.

Sustituya el émbolo y presiónelo suavemente hasta el fondo de la jeringa sin aplastar la hoja. Introduzca agua en la jeringa hasta que esté aproximadamente a la mitad. Coloque la jeringa con la punta hacia arriba y presione el émbolo para expulsar el aire a través de la punta.

Luego, cubra la punta de la jeringa y tire lentamente del émbolo hacia abajo para expulsar el aire de la hoja. Repita este proceso varias veces hasta que la hoja parezca translúcida. A continuación, cubra la superficie de un portaobjetos con cinta adhesiva.

Corte un área cuadrada en la cinta lo suficientemente grande como para acomodar la muestra de hoja usando una cuchilla, y retire el trozo cuadrado de cinta con pinzas para crear una cámara de muestra. La cinta servirá como espaciador entre la placa y la cubreobjetivo. Coloque la hoja en la cámara con la superficie abaxial hacia arriba y llene el área restante de la cámara con agua.

Selle la hoja dentro de la cámara con una cubierta de vidrio y asegure los bordes de la cubierta con cinta adhesiva. Examine la muestra de hoja utilizando un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de 40x o un objetivo de inmersión en agua de 63x. La fluorescencia de GFP puede visualizarse a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros.

Una preparación óptima de la formulación de ADN plasmídico con péptido en una relación péptido:ADN de 0,5 debe tener un diámetro medio de aproximadamente 290 nanómetros y un bajo índice de polidispersidad de aproximadamente 0,3, lo que indica una distribución uniforme de tamaños. Además, los complejos deben exhibir un potencial zeta de aproximadamente 30 milivoltios. Aquí se muestra una imagen representativa obtenida por microscopía de fuerza atómica de los complejos de péptido, plásmido y ADN.

Se observaron complejos globulares homogéneos. Mediante la formulación de ADN plasmídico con péptido en plasma, se puede lograr la entrega y expresión dirigida al núcleo del ADN plasmídico en Arabidopsis thaliana con un valor estimado de Renilla luciferasa por miligramo de aproximadamente 100.000. Se realizó observación microscópica en hojas tratadas con complejos preparados con ADN plasmídico, que codifica el reportero GFP, para evaluar la expresión génica.

Las imágenes revelaron que en células transfectadas con complejos de ADN plasmídico y péptido no dirigidos, se observó claramente una fluorescencia verde difusa correspondiente a la expresión de GFP, la cual se localizó en el citosol. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en el campo de la biotecnología vegetal pudieran entregar diversas cargas basadas en proteínas y ácidos nucleicos a plantas vivas. Después de ver este video y leer el protocolo escrito, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, caracterizar y aplicar diversas formulaciones optimizadas para cada tipo de carga, que incluyen el ADN plasmídico, el ADN de doble cadena o ARN, y proteínas.