Name: Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprende un método derivado de péptidos para transportar genes y proteínas a través de barreras celulares en plantas usando Arabidopsis thaliana. Esta técnica simplifica la transformación vegetal con transfección asistida por jeringa.

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Los autores desean reconocer financiación del Japón Agencia de Ciencia y Tecnología Investigación exploratoria de Tecnología Avanzada (JST-ERATO), la Nueva Energía y Desarrollo de Tecnología Industrial Organización (NEDO), y el Programa de Promoción de la Innovación Estratégica interministerial (SIP), Japón .

1. Preparación de formulaciones a base de péptidos <ol><li> Preparar soluciones madre de cada péptido de la siguiente manera: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml o 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) y (BP100) 2 K 8 (70 M). Pesar la cantidad necesaria de cada péptido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir agua ultrapura esterilizada en autoclave para disolver el péptido. Mezclar bien por pipeteo repetido hasta que se obtiene una solución clara. </li><li> Amplificar y purificar el ADN de plásmido (pDNA), el ADN de doble cadena (dsDNA) y el ARN de doble cadena (dsRNA) de acuerdo con metodologías moleculares estándar. En tubos de 1,5 ml de microcentrífuga, hacer que las soluciones madre con una concentración de 1 mg / ml (pDNA y dsDNA) o 400 nm (dsRNA). </li><li> Preparar la solución de proteína de stock con una concentración de 7 mM, disolviendo 1 mg de proteína (por ejemplo., Alcohol deshidrogenasa, ADH) en polvo en 1 ml de solución de carbonato de sodio (0,1 M, pH 9). Etiqueta de la proteína con fsondas luorescent tales como rodamina B (RhB) de acuerdo con protocolos estándar para permitir la visualización microscópica de la proteína entregado a las células. </li><li> Combine los componentes respectivos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. <ol><li> Para las formulaciones de péptido-pDNA focalización el citoplasma, añadir 6,4 l de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) a 20 l de pDNA (1 mg / ml) y mezclar bien pipeteando. Dejar que la mezcla se estabilice durante 15 minutos a 25 ° C. Añadir 773,6 l de agua ultrapura tratada en autoclave para diluir la solución hasta un volumen final de 800 microlitros. Utilizar la construcción pDNA diseñado para la expresión nuclear (P35S-Rluc-TNOS, Tabla 1). </li><li> Para las formulaciones de péptido-pDNA la orientación de la mitocondria, añadir 6,6 l de Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) a 20 l de pDNA (1 mg / ml) y mezclar bien pipeteando. Dejar que la mezcla se estabilice durante 15 min a 25 ° C y a continuación, añadir 2,4 l de BP100 (1 mg / ml). Dejar que la mezcla se estabilice durante 15 minutos a 256; C durante otros 15 min. Añadir 771 l de agua ultrapura tratada en autoclave para diluir la solución hasta un volumen final de 800 microlitros. Utilizar la construcción pDNA diseñado para la expresión mitocondrial (pDONR-COX2: Rluc, Tabla 1). </li><li> Para formulaciones de péptido-dsDNA, añadir 5,1 l de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) a 8 l de ADN de doble cadena (1 mg / ml) y mezclar bien pipeteando. Dejar que la mezcla se estabilice durante 15 minutos a 25 ° C. Añadir 786,9 l de agua ultrapura tratada en autoclave para diluir la solución hasta un volumen final de 800 microlitros. </li><li> Para formulaciones de péptido-ARN de doble cadena, se añaden 50 l de (KH) 9 -BP100 (800 nm) para 50 l de ARN de doble cadena (400 nm) y mezclar bien con la pipeta. Dejar que la mezcla se estabilice durante 15 minutos a 25 ° C. Añadir 700 l de agua libre de RNasa para diluir la solución hasta un volumen final de 800 microlitros. </li><li> Para formulaciones de péptido-proteína, añadir 16 l de (BP100) 2 K 8 (70 mM) a 16 l de ADH (7 m) y mezclarbien con la pipeta. Dejar que la mezcla se estabilice durante 15 minutos a 25 ° C. Añadir 768 l de agua ultrapura tratada en autoclave para diluir la solución hasta un volumen final de 800 microlitros. </li></ol></li><li> Permitir que las formulaciones que se estabilicen durante 15 minutos a 25 ° C. </li></ol> 2. Caracterización de las formulaciones a base de péptidos <ol><li> Transferir cada solución (800 l) en una cubeta para el análisis de dispersión de luz dinámica (DLS). Determinar el índice de diámetro y la polidispersidad hidrodinámico de complejos formados con un Nanosizer zeta, utilizando un 633 nm láser He-Ne a 25 ° C con un ángulo de detección de retrodispersión de 173 °. </li><li> mediciones de tamaño siguientes, la transferencia de cada solución (800 l) en una célula capilar plegada para mediciones de potencial zeta en los parámetros por defecto de la constante dieléctrica, índice de refracción y viscosidad del agua a 25 ° C. </li><li> Observar un pequeño volumen de solución compleja, que se utiliza para el análisis DLS, por microscopía de fuerza atómica (AFM). Depósito de 10 l de solución compleja sobre la superficie recién expuesta escindido de una hoja de mica y la mica dejar al aire seco durante la noche en una placa petri de plástico cubierto. </li><li> Adquirir una imagen de los complejos en el aire a 25 ° C usando un voladizo de silicio con una constante de elasticidad de 1,3 N / m en el modo de 27,28 tapping. </li></ol> 3. La infiltración de hojas de la planta <ol><li> Utilice 3 semanas las plantas del suelo cultivado de edad (24 de Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana 24 o álamo 26). Transfectar al menos 3 hojas para servir como triplicado para la cuantificación de la expresión génica o la entrega de proteínas. </li><li> Cargar una jeringa de plástico sin aguja 1 ml con 100 l de solución de complejo para la transfección de una hoja. Coloque la punta de la jeringa en la superficie abaxial de la hoja. </li><li> Pulsar la punta de la jeringa contra la hoja ligeramente y presione el émbolo de la jeringa lentamente mientras se ejerce una contra-presión con la idedo ndice de una mano enguantada de látex desde el lado opuesto. El éxito de la infiltración se puede observar como la difusión de una zona bañada por el agua en la hoja. Etiqueta de las hojas infiltradas para facilitar su identificación. </li><li> Incubar la hoja transfectadas para duraciones optimizados siguiente infiltración con el péptido-pDNA (12 hr), péptido-dsDNA (12 hr), péptido-dsRNA - formulaciones (9 48 hr) y el péptido-proteína (6 hr) en las siguientes condiciones: 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad a 22 ° C durante A. thaliana y el álamo, o luz constante de 24 horas a 29 ° C durante N. benthamiana. </li></ol> 4. Evaluación de la eficacia de transfección <ol><li> Extirpar toda la hoja transfectadas de las plantas más pequeñas (por ejemplo., A. thaliana) o una sección de 1 cm 2 de la región infiltrado para plantas más grandes (por ejemplo., N. benthamiana). </li><li> Para los experimentos de transfección utilizando luciferasa de Renilla (Rluc) vector indicador, determinar la transfection eficiencia cuantitativamente usando un kit de ensayo Rluc. <ol><li> Coloque cada sección de la hoja de la hoja o eliminado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 100 l de 1 × Rluc Ensayo de tampón de lisis por tubo. De la misma manera, se preparan lisados ​​de las hojas de control no transfectadas (por triplicado). </li><li> Triturar la hoja usando una mano de mortero de homogeneización y se incuba el lisado resultante a 25 ° C durante 6-10 h. </li><li> Se centrifuga el lisado a 12.470 xg en una microcentrífuga durante 1 min. Transferencia de 20 l de lisado aclarado a un pozo en una microplaca de 96 pocillos, y utilizar el volumen restante para la cuantificación de la concentración de proteína total usando un kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Añadir 100 l de 1 × Rluc ensayo de sustrato (diluido con el tampón de Rluc Assay) en el pozo y se mezcla mediante pipeteo lento. Coloque la microplaca en un lector de microplacas multimodo e iniciar la medición. </li><li> Restar la luminiscencia de fondo (media de la non-transfectadas por triplicado) de la luminiscencia de cada muestra experimental. Se calcula la relación de fotoluminiscencia (unidades relativas de luz, RLU) a la cantidad de proteína (mg). </li></ol></li><li> Para los experimentos de transfección utilizando proteína verde fluorescente (GFP) vector reportero o proteína marcada con fluorescencia (por ejemplo., ADH-RhB), observar la fluorescencia utilizando un microscopio de escaneo láser confocal. <ol><li> Cortar los bordes de una hoja entera (para ayudar a la eliminación de los espacios de aire), mientras que una hoja de seccionado se puede utilizar como es. Retire el émbolo de una jeringa de 10 ml y colocar cada sección de la hoja o la hoja extirpada en la jeringa. </li><li> Vuelva a colocar el émbolo y empuje suavemente hacia la parte inferior de la jeringa sin aplastar la hoja. Sacar agua en la jeringa hasta que es aproximadamente la mitad llena. </li><li> Señalar la jeringa hacia arriba y empuje el émbolo para eliminar el aire de la jeringa a través de la punta. Cubrir la punta de la jeringa y tire del émbolo hacia abajo lentamente para expulsar el aire de la LEAF. Repita este proceso varias veces hasta que aparezca la hoja translúcida. </li><li> Cubrir la superficie de un portaobjetos de microscopio con cinta adhesiva. Cortar un área cuadrada en la cinta lo suficientemente grande para acomodar la muestra de la hoja usando una cuchilla, y la cáscara de la pieza cuadrada de cinta con fórceps para crear una cámara de muestra. La cinta servirá como un espaciador entre la corredera y cubreobjetos. </li><li> Coloque la hoja en la cámara con la superficie abaxial hacia arriba y llenar el área de la cámara restante con agua. Sellar la hoja dentro de la cámara con un cubreobjetos de vidrio y asegurar los bordes del cubreobjetos con cinta adhesiva. </li><li> Examinar la muestra de hojas usando el microscopio láser confocal de barrido bajo un objetivo de 40X o 63X un objetivo de inmersión en agua. GFP o fluorescencia RhB pueden ser visualizados en longitudes de onda de excitación de 488 nm o 555 nm, respectivamente. </li></ol></li></ol>

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<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se discuten Los pasos críticos en el protocolo que han sido identificadas empíricamente. Por la infiltración de la jeringa, las formulaciones a base de péptidos se introducen en los espacios aéreos dentro de la hoja de la planta a través de los estomas. Para garantizar el máximo consumo de la solución, el proceso de infiltración debe llevarse a cabo cuando las plantas están en condiciones propicias para la apertura de los estomas es decir., Provistos de agua suficiente y durante el período de luz. Con respecto a la preparación de complejos de transfección, para formulaciones que implican una combinación de dos péptidos (para la entrega de ADN mitocondrial de orientación), la secuencia para la adición de cada componente es crucial y no debe ser invertida. Hay muchas modificaciones posibles en el procedimiento. Otra opción para la infiltración de células de plantas es el uso de infiltración al vacío, que es capaz de introducir la solución del complejo en plantas completas y / o parciales tejidos incluidosmeristemos apicales. Para este procedimiento alternativo, las plantas de semillero se sumergen en la solución de transfección, y en base a la presión generada por el vacío, los complejos de péptido-carga son forzados a través de los estomas y en las células vegetales (Yoshizumi, T., datos no publicados). La expresión génica transitoria, basado en estudios que utilizan células animales, se ha demostrado que aumenta con concentraciones de ADN superiores 29-31. Es importante tener en cuenta que la relación de péptido a ADN afecta las propiedades biofísicas (tamaño, carga superficial) de los complejos (Figura 4), que influye en la eficiencia de transfección; Por lo tanto, la relación óptima necesita ser mantenida incluso con un aumento de la concentración de ADN. Una de las principales ventajas en el uso de péptidos como un agente de administración de genes / proteínas es que su secuencia es susceptible de sintonización para cumplir una función deseada. Por ejemplo, el dominio mitocondrial de segmentación del péptido portador describe en este pernoy se pueden sustituir con secuencias cloroplásticos o segmentación para la localización peroxisomal de estos orgánulos. Si bien la transformación de cloroplastos es posible en varias plantas usando biolística 32-34, ni el Agrobacterium ni el método biolístico podrían introducir genes en las mitocondrias o otros orgánulos además del núcleo (Tabla 2). No hay limitaciones anfitrión de rango rígidos para la transfección a base de péptidos, a diferencia del método basado en Agrobacterium (Tabla 2). Hasta el momento, las formulaciones para la transfección de A. thaliana, N. benthamiana y el álamo se han optimizado (Tabla 1), pero el procedimiento también se pueden aplicar para Nicotiana tabacum, tomate cultivar Micro-Tom, arroz (en base a experimentos preliminares), y otras plantas mono- y dicotiledóneas. Hasta el momento, no existe ninguna limitación conocida de tamaño transgén cuando se utilizan péptidos unavectores s transfección. Por el contrario, se han encontrado grandes moléculas de ADN para reducir la eficiencia de transformación de Agrobacterium métodos mediados por 35,36, y un límite de tamaño superior para transgenes de aproximadamente 200 kb se ha informado 37-39. Usando biolística, por otra parte, los grandes fragmentos de ADN pueden ser de desgarre durante la preparación o entrega en las plantas 38. Aunque no hay límite superior se ha determinado para la transformación biolística hasta ahora, se han encontrado limitaciones físicas para restringir el tamaño del ADN que se pueden transferir a mucho menos de 150 kb 40. Los principales beneficios de utilizar el sistema basado en el péptido para la transferencia génica en comparación con los enfoques existentes que funcionen de Agrobacterium o bombardeo con microproyectiles, discutidas anteriormente, se resumen en la Tabla 2. Existen unas pocas limitaciones para este método en su forma actual. En primer lugar, dirigido entrega de pDNA a orgánulos específicos, tales como el MITochondria, se ha demostrado que es posible mediante una combinación de secuencias, de células de penetración y orgánulo-tránsito de unión al ADN, aunque la eficacia fue baja. La expresión del transgen se pudo detectar, por microscopía confocal, sólo en una pequeña población de mitocondrias dentro de las células. Por lo tanto, otras modificaciones son necesarias para: (i) mejorar la translocación de más complejos a través de la membrana celular / organoides, y (ii) mejorar la disociación y la transferencia de pDNA a partir del péptido portador en el orgánulo diana para la expresión. En segundo lugar, el uso de este sistema de entrega de ADN, la expresión transitoria de genes exógenos reportero se consiguió con éxito en el compartimento citosólico y mitocondrial de las células. incorporación estable y la expresión de los genes introducidos en el / genoma de orgánulos central nuclear no se han establecido todavía, sin embargo, debido a la ausencia de estrategias de selección adecuados. Si bien se reconoce que existen áreas de mejora o más desarrollo, la estrategia péptido derivado descrito aquí sigue siendo una técnica sencilla y versátil que ha allanado el camino para la entrega de carga diversa en diversos tipos de plantas.

La ingeniería genética de plantas se utiliza convencionalmente para transferir rasgos beneficiosos a las plantas. En los últimos años, esta tecnología se ha aplicado para convertir las plantas en biofábricas para la producción de proteínas de importancia farmacéutica y valor comercial, muchas de las cuales no se pueden sintetizar químicamente y son muy costosas de producir utilizando sistemas animales o microbianos1. Mediante la introducción de nuevos genes, el propio metabolismo de la planta puede ser manipulado para la producción de diversos productos biofarmacéuticos como anticuerpos, enzimas metabólicas, hormonas, antígenos o vacunas2.
Las tecnologías de transferencia de genes establecidas para plantas son la entrega mediada por agrobacterias 3, el bombardeo con microproyectiles recubiertos de ADN (biolística)4 y la electroporación5 o el tratamiento con polietilenglicol6 de protoplastos. Por lo general, se evitan las técnicas que requieren protoplastos porque requieren mucho tiempo, son engorrosas y producen resultados inconsistentes7. Como resultado, prácticamente todos los trabajos de modificación de plantas en la actualidad utilizan Agrobacterium o microproyectiles para la transferencia de genes. El método Agrobacterium es más utilizado, pero no es aplicable a muchas especies de plantas económicamente importantes. Mientras tanto, el bombardeo con microproyectiles es más versátil debido a una amplia gama de plantas susceptibles, pero requiere equipo especializado y, a menudo, causa graves daños en los tejidos. Además, estos métodos involucran un mecanismo de administración aleatorio (biolístico) o complejo (Agrobacterium) y tienen tasas de transformación variables8. Por lo tanto, se requiere una nueva tecnología de transformación de plantas que sea simple pero efectiva y aplicable a diferentes tipos de plantas.
Actualmente, las plantas están sujetas a modificación genética principalmente por la entrega de ADN exógeno que codifica un rasgo deseado, en lugar de por la entrega directa de una proteína objetivo. La mayor estabilidad del ADN sobre las proteínas es una gran ventaja; sin embargo, los problemas potenciales asociados con la entrega de ADN incluyen la inserción aleatoria de ADN exógeno en el genoma de la planta y la transmisión no intencional de genes de resistencia a antibióticos a bacterias patógenas a través de la transferencia horizontal de genes9. Para fines de edición del genoma, la capacidad de editar genomas de plantas sin introducir ADN extraño en las células puede eludir las preocupaciones regulatorias relacionadas con las plantas modificadas genéticamente. Por lo tanto, una estrategia alternativa sin ADN para la modificación de plantas mediante la administración directa de proteínas podrá satisfacer estas necesidades.
Aquí presentamos un sistema basado en péptidos, desarrollado originalmente para la terapia génica humana10-14, para la administración dirigida de genes o proteínas exógenas en plantas intactas. Los péptidos son capaces de proteger el ADN de la degradación de la nucleasa y pueden mediar la transferenciade genes a través de las membranas celulares y organelares. También tienen propiedades diversas y sintonizables, además de ser no citotóxicos18-20. Más importante aún, con el uso de péptidos, los genes pueden dirigirse con precisión a orgánulos intracelulares como las mitocondrias21 o los plastos (cloroplastos) 22 para su expresión, una tarea que no se puede lograr mediante la transformación mediada por biobacterias o agrobacterias. Dependiendo del tipo de carga, esta nueva tecnología de modificación de plantas puede explotarse para entregar proteínas23 y expresar (plásmido21,24 o ADN bicatenario25) o regular a la baja (ARN bicatenario26) genes específicos dentro de la planta, a lo largo de su espacio citosólico24-26 o dentro de un compartimento organélico específico21. Los péptidos portadores diseñados consisten en un dominio catiónico en forma de polilisina (K8) o polilisina-cohistidina (KH)9 para la unión y/o condensación de cargas cargadas negativamente, que se conjuga con secuencias de penetración celular (péptido BP100) o de tránsito de mitocondrias (péptido Cytcox).

<table><tbody><tr><td>(KH)9-BP100 péptido</td><td>sintetizado a medida por el Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN</td> N<td>/A</td><td>Secuencia: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)2-K8 péptido</td><td>Sintetizado a medida por el Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN</td> Secuencia <td>N/A</td><td>: KKLFKKILKKKLFKKIL- KYLKKKKKKKKKK</td></tr><tr><td>Péptido</td> <td>BP100Sintetizado a medida por el Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN</td> Secuencia <td>N/</td>A<td>: Péptido KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)9</td><td>Sintetizado a medida por el Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN</td> N<td>/A</td><td>Secuencia: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS y P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codifica los genes de la proteína verde fluorescente y la Renilla luciferasa, respectivamente, bajo el control del promotor constitutivo CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp y pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codifica los genes de la proteína verde fluorescente y la Renilla luciferasa, respectivamente, bajo el control del promotor específico mitocondrial cox2 (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (amplificado por PCR a partir de pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Codifica genes de proteína fluorescente verde y Renilla luciferasa, respectivamente, bajo el control del promotor constitutivo CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para el silenciamiento mediado por interferencia de ARN de la proteína fluorescente verde (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para el silenciamiento mediado por interferencia de ARN de la chalcona sintasa (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>Jeringas de plástico de 1 ml y 10 ml</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Deshidrogenasa</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de Fuerza Atómica</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, Microscopio de fuerza atómica SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de escaneo láser confocal</td><td></td> Cantiléver Hitachi High-Tech Science Corporation K-A102001593 <td></td> Carl Zeiss LSM700 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Barrenador de corcho Sigma-Aldrich Co., LLC.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Z165220</td><td>Para la escisión de hojas en discos de 1 cm de diámetro</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>célula capilar plegada</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>de DTS1070 Shimizu Akira Inc.</td><td>Pinza de acero inoxidable 150</td><td></td></tr><tr><td>Mortero de homogeneización</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>Microcentrífuga LC23Z</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>S011120</tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf Research&reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de luciferasa Renilla</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato</td> <td>de rodamina BSigma-Aldrich Co., LLC.</td><td></td><td></td>283924</tr><tr><td>Qiagen</td><td>de agua libre de RNasa</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>carbonato de sodio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla y mango quirúrgicos FEATHER</td><td>Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Acero inoxidable Nº 14 (hoja), Nº 3L (mango)</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de la punta de la jeringa</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>Balanza de pesaje NC-3E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potenciómetro</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

péptido derivado método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y barreras organellar en plantas

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

La capacidad de introducir proteínas exógenas y expresar (o regular a la baja) genes específicos en las plantas proporciona una poderosa herramienta para la investigación fundamental, así como para nuevas aplicaciones en el campo de la biotecnología vegetal. Los métodos viables que existen actualmente para la transferencia de proteínas o genes a las células vegetales, a saber, Agrobacterium y el bombardeo de microproyectiles, tienen las desventajas de la baja frecuencia de transformación, el rango limitado del huésped o el alto costo del equipo y los microportadores. El siguiente protocolo describe un método simple y versátil, que emplea péptidos diseñados racionalmente como agentes de administración para una variedad de cargas basadas en ácidos nucleicos y proteínas en las plantas. Los péptidos se seleccionan como herramientas para el desarrollo del sistema debido a su biodegradabilidad, tamaño reducido, propiedades diversas y sintonizables, así como la capacidad de obtener acceso intracelular/orgonelar. Se describe la preparación, caracterización y aplicación de formulaciones optimizadas para cada tipo de la amplia gama de cargas entregadas (ADN plasmídico, ADN bicatenario o ARN y proteína). También se discuten los pasos críticos dentro del protocolo, las posibles modificaciones y las limitaciones existentes del método.

Una serie de ácidos nucleicos y proteínas cargas se introdujeron con éxito en diversas plantas que utilizan los péptidos diseñados como vectores de suministro. Interacciones electrostáticas entre péptidos catiónicos y cargamentos cargados negativamente como resultado la formación de complejos de transfección que puede ser infiltrada directamente en hojas de las plantas utilizando una jeringa sin aguja (Figura 1). Formulaciones optimizadas (determinado empíricamente en estos estudios 21,23-26) para la transfección de células de plantas se enumeran en la Tabla 1, donde se representa cada tipo de la amplia gama de cargas entregadas (pDNA, dsDNA, ARN de doble cadena y proteína). Los diámetros medios de todas las formulaciones a base de péptidos estaban en el intervalo aproximado de 150 a 300 nm. Basado en el análisis DLS, todas las formulaciones muestran polidispersidades relativamente baja capacidad, lo que indica que los agregados péptido de carga formados tienen una distribución uniforme de tamaño. Las morfologías decomplejos entre péptido y pDNA (Figura 2A) o proteína (Figura 2B), en mica, se obtuvieron imágenes por AFM. Se observaron complejos globulares homogéneos para ambas combinaciones de péptido-pDNA y el péptido-proteína, de acuerdo con los datos de las mediciones DLS. En términos del potencial zeta de los complejos (Tabla 1), pDNA- y complejos de derivados de ADN de doble cadena tenía cargas superficiales negativas netas mientras que los complejos basados en ARN de doble cadena tenían una carga superficial casi neutro. complejos de péptido-proteína, por otro lado, se carga positiva. Las eficiencias de péptido-pDNA y formulaciones de péptido-ADN de doble cadena en la mediación de la transfección de A. thaliana o N. benthamiana como sistemas modelo de plantas se evaluaron cuantitativamente y cualitativamente. El ensayo de la expresión de genes Rluc se empleó para la cuantificación de los niveles de expresión de genes (Tabla 1), por lo tanto, para este experimento o pDNAdsDNA que codifica el gen Rluc debe ser utilizado para la formación de complejos con los respectivos péptidos portadores. Uso de la (KH) 9 -BP100 / formulación de pDNA, la entrega y la expresión de pDNA dirigido al núcleo se puede conseguir, después de un período de incubación de 12 horas, con un valor estimado RLU / mg de aproximadamente 1 × 10 5. Para la entrega mitocondrial de orientación y expresión de pDNA, una combinación de péptidos, Cytcox- (KH) 9 y BP100, se requiere para la formación del complejo. Con el mismo período de incubación optimizada de 12 horas, sin embargo, se alcanzó un nivel mucho más bajo de la transfección (aproximadamente 1 × 10 3 RLU / mg). Mientras tanto, se requería similar período de incubación (12 h) y el nivel de la expresión génica (aproximadamente 1 × 10 3 RLU / mg) / registrado para los complejos basados en ADN de doble cadena, también formuló usando el (KH) 9 -BP100 péptido. Las evaluaciones cualitativas de la expresión génica se llevaron a cabo mediante observación microscópica directa de hojas tratadas con prepar complejosed usando pADN o ADN de doble cadena que codifica el gen reportero GFP. En las células transfectadas con complejos que no son objeto de péptido-pDNA, la fluorescencia verde correspondiente con la expresión de GFP se observó claramente y se encontró que localizar en el citosol (Figura 3A) difusa. claras diferencias en el patrón de localización de la fluorescencia de GFP fueron evidentes en las células infiltradas con complejos péptido-pDNA mitocondriales de orientación. Aquí, punteada fluorescencia verde que colocalize con la tinción mitocondrial era visible, lo que confirma la especificidad de la expresión génica exclusivamente en el compartimento mitocondrial de las células (Figura 3B). En el caso de formulaciones de péptido-proteína, la conjugación de la carga de proteínas (ADH) a un fluoróforo (RhB) permitirá la visualización de la proteína suministrada en el compartimiento intracelular. Dentro de un corto período de incubación de 6 horas, se encontró que la proteína ADH-RhB (azul) para ser distribuidos a lo largoel citosol y vacuola de las células infiltradas (Figura 3C). Mientras tanto, rápida y eficaz la baja regulación de la expresión génica podría lograrse de varias plantas usando formulaciones de péptido-ARN de doble cadena. En el primer experimento, la hoja de A. thaliana se infiltra con péptido-ARN de doble cadena complejos para silenciar el gen chalcona sintasa (CHS) responsable de antocianina (pigmento rojo) la biosíntesis en condiciones de sequía. La diferencia en la apariencia de las hojas de A. thaliana en condiciones normales (Figura 3D, a), y las condiciones de sequía (Figura 3D, b) proporcionan un medio fácil para evaluar CHS silenciamiento utilizando la formulación de péptido-ARN de doble cadena optimizado (flecha 1 indica la región infiltrado). En el segundo experimento, los complejos de péptido-ARN de doble cadena se infiltraron en las hojas de A. thaliana transgénica que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP). Una reducción aparente en la expresión de YFP se podía ver en las células epidérmicas 9 hr post-transfección (Figura 3E, F). La eficacia de la formulación en la expresión de genes abajo de la regulación en un sistema de planta diferente (álamo, 12 horas después de la transfección) también se verificó (Figura 3G, H). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Figura 1: Las formulaciones a base de péptidos para la entrega de ácido nucleico y las cargas de proteínas en plantas vivas. Los péptidos portadores diseñados consisten en policationes conjugados con penetrante en las células o secuencias de tránsito organellar. Los policationes permiten la unión y / o condensación de los cargamentos con carga negativa, así como de escape del compartimento endosomal siguiente internalización en las células. Entrega de las cargas en las células y, posteriormente, a orgánulos específicos está mediada por secuencias celulares penetrante y secuencias de tránsito organellar, respectivamente. Varias cargas que podrían ser successfuLLY entregado en la planta incluyen ácidos nucleicos tales como pDNA, dsDNA y dsRNA, así como proteínas modelo como la albúmina de suero bovino (BSA), alcohol deshidrogenasa (ADH) y citrino (una variante de la proteína fluorescente amarilla). Moléculas bioactivas son capaces de formar complejos de transfección con péptidos conjugados a través de interacciones electrostáticas, que se introducen en hojas de las plantas por la infiltración de la jeringa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Figura 2: morfologías de las formulaciones a base de péptidos. (A) AFM amplitud imagen de (KH) 9 -BP100 formulación / pDNA en N / P 0,5. Altura de imagen AFM de (BP100) 2 K 8 / formulación de ADH en rati molar (B)o 10. Reproducido con permiso de fuentes publicadas 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Figura 3: Evaluación microscópica de transfección eficiencias usando formulaciones basadas en péptidos optimizados. (A) expresión citosólica de GFP (verde), distingue claramente de la autofluorescencia del cloroplasto (rojo), se observó en las células mesófilas esponjosos de A. thaliana hojas infiltra con (KH) 9 formulación -BP100 / pDNA (N / P 0,5; 12 hr ). (B) la expresión de GFP (verde) se detectó en la mitocondria (roja) en las células epidérmicas de la hoja de A. thaliana infiltrado con Cytcox- (KH) 9 / BP100 formulación / pDNA (N / P 0,5 para cada Peptidmi; 12 h). imágenes ampliadas de las mitocondrias con la expresión de GFP se muestran en el panel de la derecha extrema. (C) de entrega de ADH-RhB (azul) en las células del mesofilo esponjoso de A. thaliana hojas mediada por (BP100) 2 K 8 en una relación molar de péptido / proteína de 10, visualiza 6 horas después de la infiltración. (D) de la hoja A. thaliana antes (a) y después (b) de tratamiento con (KH) 9 formulación -BP100 / dsRNA (relación molar 2; 48 h), lo que resultó en la supresión de la ruta de biosíntesis de antocianina. Una formulación similar que contiene GFP5 dsRNA se infiltra en la hoja como control negativo (c). Las flechas 1 y 3 indican el área infiltrada mientras que las flechas 2 y 4 indican el área no infiltrada dentro de la hoja. (E) A. thaliana deja que expresa la proteína amarilla fluorescente (YFP) y (F) la disminución de la fluorescencia YFP siguiente infiltración con<html> (KH) 9 -BP100 / formulación de dsRNA (relación molar 2; 9 h). (G) hojas de chopo transgénicos que expresan la proteína amarilla fluorescente (YFP) y (H) la disminución de la fluorescencia YFP siguiente infiltración con (KH) 9 formulación -BP100 / dsRNA (relación molar 2; 12 h). Reproducido con permiso de fuentes publicadas 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Figura 4: Variación de péptido-a-DNA (N / P) y el efecto sobre las propiedades biofísicas de los complejos. Con el aumento de relación de péptido a ADN, las formulaciones a base de péptidos disminuyen de tamaño, mientras que su potencial zeta transición de los valores de negativo a positivo./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tabla 1: Caracterización y evaluación de diversas formulaciones basadas en péptidos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.</a> <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tabla 2: Comparación de las tecnologías existentes de entrega de ADN basados en péptidos y de otro tipo para plantas intactas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.</a>

Los métodos existentes para la modificación de plantas tienen una aplicabilidad limitada. La novedosa tecnología derivada de péptidos propuesta aquí promete simplicidad y eficiencia en la introducción de proteínas o genes exógenos en los compartimentos intracelulares deseados de plantas intactas.

Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

El objetivo general de este método derivado de péptidos es transportar genes y proteínas a través de barreras celulares y organulares en plantas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave mediante la modificación de plantas a través de conjugados de péptidos diseñados racionalmente que entregan diversos genes y proteínas para mediar la expresión de genes específicos. La ventaja inmediata de esta técnica es que emplea un procedimiento sencillo de transfección asistida por jeringa en hojas de plantas, basado en péptidos que pueden traspasar límites celulares y organulares.Desarrollamos este método de transformación vegetal simple, eficaz y novedoso porque los métodos convencionales son costosos, no aplicables a algunos tipos de plantas e incapaces de dirigirse a orgánulos intracelulares. Jo-Ann Church demostrará el procedimiento junto con Yoko Horii, una técnica de mi laboratorio. Prepare la formulación de ADN de plasma peptídico según se describe en el protocolo escrito.Cuando se añade el péptido al ADN plasmático, se formará una solución turbia. La mezcla se vuelve clara tras la dilución con agua ultrapura hasta el volumen final especificado en el protocolo del texto. Transfiera 800 microlitros de la solución diluida a una cubeta para el análisis de dispersión dinámica de la luz.Determine el diámetro hidrodinámico y el índice de politispersidad de los complejos formados mediante un zetananosizador. Utilice un láser de helio-neón de 633 nanómetros a 25 grados Celsius con un ángulo de detección de retrodispersión de 173 grados. Tras las mediciones de tamaño, transfiera la solución a una celda capilar plegada para mediciones del potencial zeta con los parámetros predeterminados de constante dieléctrica, índice de refracción y viscosidad del agua a 25 grados Celsius.Para observar la solución compleja mediante microscopía de fuerza atómica, deposite 10 microlitros sobre la superficie recién expuesta y escindida de una lámina de mica y deje que la mica se seque al aire durante la noche en un recipiente de plástico cubierto. Adquiera una imagen de los complejos en aire a 25 grados celsius utilizando un cantiléver de silicio con una constante de resorte de 1,3 newtons por metro en modo de golpeteo. Utilice Arabidopsis thaliana de tres semanas de edad cultivada bajo un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a 22 grados celsius.Seleccione al menos tres hojas para la transpección, que servirán como triplicado para la cuantificación de la expresión génica. Cargue una jeringa plástica de un mililitro sin aguja con 100 microlitros de solución compleja para la transfección de una hoja. A continuación, coloque la punta de la jeringa sobre la superficie abaxial de la hoja.Presione ligeramente la punta de la jeringa contra la hoja y empuje lentamente el émbolo de la jeringa mientras ejerce una presión contraria con el dedo índice de una mano enguantada con guante de látex desde el lado opuesto. La infiltración exitosa puede observarse como la expansión de un área empapada por agua en la hoja. Etiquete las hojas infiltradas para facilitar su identificación.Incube la planta transfectada con ADN plasmídico de péptidos durante 12 horas en una cámara de crecimiento. Para evaluar la eficiencia de transfección, primero excise la hoja transfectada completa. Para experimentos de transfección que utilicen el vector reportero de Renilla luciferasa, determine cuantitativamente la eficiencia de transfección utilizando un kit de ensayo de Renilla luciferasa.Primero, coloque cada hoja resecada en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada 100 microlitros de tampón de lisis 1X por tubo. De la misma manera, prepare lisados de hojas control no transfectadas por triplicado.Muela la hoja utilizando un pistilo de homogenización e incuba el lisado resultante a 25 grados Celsius durante seis a 10 horas. Tras la incubación, centrifuga el lisado a 12.470 × g en una microcentrífuga durante un minuto. Transfiere 20 microlitros del lisado clarificado a un pocillo de una microplaca de 96 pocillos.Utilice el volumen restante para la cuantificación de la concentración total de proteína mediante un kit de ensayo de proteína BCA según el protocolo del fabricante. A continuación, agregue 100 microlitros de sustrato de ensayo de Renilla Luciferasa al pozo y mezcle mediante pipeteo lento. Coloque la microplaca en un lector de microplacas multimodal e inicie la medición.Para experimentos de transfección utilizando un vector reportero de proteína verde fluorescente, observe la fluorescencia mediante un microscopio confocal de barrido láser. Primero, corte los bordes de una hoja completa para facilitar la eliminación de los espacios aéreos. Luego, retire el émbolo de una jeringa de 10 milileter y coloque cada hoja o sección de hoja excisa en la jeringa.Sustituya el émbolo y presiónelo suavemente hasta el fondo de la jeringa sin aplastar la hoja. Introduzca agua en la jeringa hasta que esté aproximadamente a la mitad. Coloque la jeringa con la punta hacia arriba y presione el émbolo para expulsar el aire a través de la punta.Luego, cubra la punta de la jeringa y tire lentamente del émbolo hacia abajo para expulsar el aire de la hoja. Repita este proceso varias veces hasta que la hoja parezca translúcida. A continuación, cubra la superficie de un portaobjetos con cinta adhesiva.Corte un área cuadrada en la cinta lo suficientemente grande como para acomodar la muestra de hoja usando una cuchilla, y retire el trozo cuadrado de cinta con pinzas para crear una cámara de muestra. La cinta servirá como espaciador entre la placa y la cubreobjetivo. Coloque la hoja en la cámara con la superficie abaxial hacia arriba y llene el área restante de la cámara con agua.Selle la hoja dentro de la cámara con una cubierta de vidrio y asegure los bordes de la cubierta con cinta adhesiva. Examine la muestra de hoja utilizando un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de 40x o un objetivo de inmersión en agua de 63x. La fluorescencia de GFP puede visualizarse a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros.Una preparación óptima de la formulación de ADN plasmídico con péptido en una relación péptido:ADN de 0,5 debe tener un diámetro medio de aproximadamente 290 nanómetros y un bajo índice de polidispersidad de aproximadamente 0,3, lo que indica una distribución uniforme de tamaños. Además, los complejos deben exhibir un potencial zeta de aproximadamente 30 milivoltios. Aquí se muestra una imagen representativa obtenida por microscopía de fuerza atómica de los complejos de péptido, plásmido y ADN.Se observaron complejos globulares homogéneos. Mediante la formulación de ADN plasmídico con péptido en plasma, se puede lograr la entrega y expresión dirigida al núcleo del ADN plasmídico en Arabidopsis thaliana con un valor estimado de Renilla luciferasa por miligramo de aproximadamente 100.000. Se realizó observación microscópica en hojas tratadas con complejos preparados con ADN plasmídico, que codifica el reportero GFP, para evaluar la expresión génica.Las imágenes revelaron que en células transfectadas con complejos de ADN plasmídico y péptido no dirigidos, se observó claramente una fluorescencia verde difusa correspondiente a la expresión de GFP, la cual se localizó en el citosol. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en el campo de la biotecnología vegetal pudieran entregar diversas cargas basadas en proteínas y ácidos nucleicos a plantas vivas. Después de ver este video y leer el protocolo escrito, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, caracterizar y aplicar diversas formulaciones optimizadas para cada tipo de carga, que incluyen el ADN plasmídico, el ADN de doble cadena o ARN, y proteínas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas

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