El análisis del tejido de miocardio entero en 3D del corazón

Narrador}El objetivo general de este protocolo es facilitar un método estructurado y reproducible para el procesamiento 3D de tejido cardíaco entero que pueda utilizarse para evaluar la precisión de la orientación de las inyecciones intramiocárdicas en la zona fronteriza del infarto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina cardioregenerativa, como el desarrollo de la práctica y la optimización de las técnicas de inyección. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece un método estandarizado y reproducible para el procesamiento 3D de tejido de corazón entero.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias regenerativas cardíacas y la validación de la precisión de la inyección de las técnicas de administración normales. El objetivo de esta terapia con células madre cardíacas es inyectar células en la zona del borde del infarto para estimular la vasculogénesis local y la protección de los cardiomiocitos. Capturar el corazón al final de la fase diastólica requiere práctica y paciencia.

Una demostración visual de estos pasos es fundamental. Comience separando el pericardio del corazón inyectado con microperlas, manteniendo intactos las aurículas y los ventrículos. Cuando se haya extraído todo el tejido, use unas tijeras Klinkenberg para diseccionar la aorta ascendente aproximadamente un centímetro por encima de la válvula aórtica y corte las venas cava y pulmonar inferiores aproximadamente un centímetro de la aurícula.

Después de fijar el ápice del corazón al fondo del recipiente de plástico para evitar la flotación, coloque 2-0 suturas a través de la parte restante de la aorta hasta los bordes del recipiente y fije el corazón. Tenga cuidado de que el corazón esté centrado y no toque las paredes del recipiente. Cuando el órgano se haya asegurado en una geometría diastólica final, use pinzas para mosquitos para agarrar la vena cava inferior y use una jeringa de 50 mililitros para inyectar lentamente agar recién preparado de 50 a 60 grados Celsius en la aurícula derecha a través de la vena cava superior hasta que tanto la aurícula derecha como el ventrículo estén completamente llenos.

Para obtener un corazón incrustado que se asemeje lo más posible a la geometría diastólica final, fije el ápice del ventrículo izquierdo al fondo del recipiente y llene el ventrículo derecho con agar mientras se pinzan las venas pulmonares. A continuación, coloque una pinza para mosquitos en las venas pulmonares y pase suavemente una nueva jeringa de 50 mililitros llena de agar en dirección retrógrada a través de las válvulas aórticas. Inyecte lentamente la solución en el ventrículo izquierdo hasta que el ventrículo y la aurícula izquierda estén completamente llenos, pinzando la aorta una vez que se haya llenado el ventrículo izquierdo.

Ahora, vierta el agar restante en el recipiente hasta que el corazón esté completamente cubierto y coloque dos tubos de plástico rígido dentro del recipiente de inclusión para que sirvan como estructuras de referencia durante el registro de la imagen. Luego coloque el corazón a dos a siete grados centígrados durante al menos cuatro horas para solidificar el agar. Después de la resonancia magnética, voltee el recipiente boca abajo y permita que el aire entre el agar y los lados del recipiente elimine la solución sólida de agar y el corazón del recipiente.

Retire las varillas de plástico. A continuación, utilice una cortadora de carne para seccionar el bloque de agar y el corazón en rodajas de cinco milímetros desde el ápice hasta la base del corazón, cortando en paralelo a la parte inferior del bloque de agar para mantener la angulación de las rodajas igual que en las imágenes de resonancia magnética adquiridas. Cuando se hayan obtenido todos los cortes, tiña las muestras de tejido con TTC.

Después de 15 minutos, fotografíe las rodajas de ambos lados en un ángulo perpendicular, luego enjuague cuidadosamente las secciones con solución salina al 0,9%. Para obtener imágenes de las muestras mediante microscopía de fluorescencia, seleccione la imagen en modo fluorescente en el escáner de modo variable y establezca el tamaño de píxel en 100 por 100 micras. Para el primer bloque de filtro, seleccione un filtro de paso de banda que se superponga con la longitud de onda de emisión de la fluorescencia del cordón en el canal uno, luego para filtrar el filtro de paso de banda para el segundo bloque de filtro fuera de la longitud de onda de emisión en el canal dos.

A continuación, seleccione el bloque de filtro adecuado, ajuste el tubo fotomultiplicador al voltaje adecuado y el láser de excitación a la longitud de onda de excitación más cercana a la de las microperlas inyectadas. Una vez obtenidas todas las imágenes, en el software de posprocesamiento adecuado, se segmentará el miocardio y los bordes endocárdicos y epicárdicos del ventrículo izquierdo en las imágenes de resonancia magnética, seguido de una segmentación similar del miocardio y de los sitios de inyección en las imágenes de fluorescencia. A continuación, interpole linealmente los segmentos registrados de la imagen desde ambos lados de los cortes para reconstruir el grosor de la muestra original y crear un modelo 3D de los datos.

Con el corazón asegurado en una geometría diastólica como se acaba de demostrar, en este experimento representativo, el agar se adhirió con éxito al tejido del corazón, lo que permitió que el tejido se cortara en la angulación deseada con espesores de corte iguales. Tanto en las imágenes de fluorescencia 2D como en las de resonancia magnética, los sitios de la cicatriz y la inyección son claramente distintos. El tejido teñido con TTC y las imágenes de resonancia magnética mejorada con gadolinio tardío proporcionan un control para la evaluación de cicatrices en imágenes de fluorescencia.

El posprocesamiento de imágenes permite la reconstrucción de la geometría 3D del corazón ex vivo en función de las segmentaciones y las imágenes de fluorescencia, lo que permite evaluar la precisión de la inyección en 3D. En este estudio, se protegieron las deposiciones de inyección y la zona del borde del infarto en la pared endocárdica, y se midieron las distancias entre las proyecciones en la superficie endocárdica. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como una evaluación quirúrgica, la cuantificación del tamaño del infarto o la validación de otras modalidades de imágenes tridimensionales.

Hemos utilizado esta técnica para evaluar la precisión de la inyección en la zona del borde del infarto. Esta investigación se llevó a cabo para mejorar la terapia cardiorregenerativa para la insuficiencia cardíaca. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar el corazón, cómo incrustar y procesar tejido cardíaco y cómo realizar imágenes de fluorescencia de muestras de tejido cardíaco.