Name: El análisis del tejido de miocardio entero en 3D del corazón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda un método estandarizado para el procesamiento de tejido miocárdico cardíaco en 3D utilizando resonancia magnética en un modelo porcino de infarto. Esta técnica mejora la precisión en la evaluación de inyecciones intramiocárdicas.

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Los autores desean agradecer a Marlijn Jansen, Joyce Visser, y Martijn van Nieuwburg por su ayuda con los experimentos con animales. Reconocemos en gran medida Martijn Froeling y Anke Wassink por su ayuda en la obtención de imágenes de resonancia magnética.

El experimento in vivo se realizó de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio preparados por el Instituto de Investigación de Animales de Laboratorio. El experimento fue aprobado por el Comité de Experimentación Animal local. 1. Preparación de la solución inyectable e incrustación <ol><li> Preparar el gel inyectable. <ol><li> Preparar 1 ml de ureido-pirimidinona gel (UPY) de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente 12, 13. </li><li> Añadir partículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIOs) a la solución para obtener una concentración de 15 mg / ml y se agita la mezcla durante 5 min para la distribución uniforme. </li><li> Añadir las microperlas fluorescentes a la solución para obtener una concentración de 10.000 cuentas / ml y se agita la mezcla durante 5 min para la distribución uniforme. </li><li> Guarde la mezcla resultante a temperatura ambiente en un ambiente oscuro. Caliente y agitar o remover tque la solución poco antes del procedimiento de inyección. </li></ol></li><li> Preparar la solución de incrustación. <ol><li> Comience con agua del grifo a temperatura ambiente y añadir agarosa (agar) a una concentración de 4% en peso. </li><li> Lentamente calentar la solución hasta el punto de ebullición usando un horno de microondas y se agita con frecuencia durante el calentamiento. Al llegar a la ebullición punto, almacenar y mantener la solución de agar por encima de 70 ° C durante 2 h para permitir que el aire atrapado a la superficie. </li><li> Dejar que el agar se enfríe a temperatura ambiente a una temperatura entre 50 y 60 ° C hasta el momento de la incrustación. </li></ol></li></ol> Procedimiento 2. Inyección <ol><li> Realizar premedicación (agentes anti-arrítmicos, la terapia anti-plaquetas, y medicamentos para el dolor), anestesia, acceso venoso, y la intubación, como se ha descrito previamente 14. </li><li> Realizar inyecciones utilizando un catéter de inyección intramiocárdica (Tabla de Materiales). Para cada inyección, 0.2 ml de la mezcla se inyecta en un bolo a una velocidad constante de aproximadamente 0,3 ml / min usando un dispositivo de inyección. Colocar las inyecciones en diferentes posiciones a lo largo del IBZ 12. </li><li> Administrar 0,2 ml / kg (1,0 mmol / ml) de un agente de contraste a base de gadolinio 15 min antes de la eutanasia de los animales. </li><li> Administrar 20 ml de cloruro de potasio 7,5% por vía intravenosa para la eutanasia del animal. </li><li> Acceso mediastinal Secure siguiente protocolo pasos 8/2 a 8/3, como se describe por Koudstaal et al. 14. Cortar la vena cava inferior a 5 cm de la aurícula derecha y quitar que fluye hacia la sangre con un dispositivo de succión. Escindir el corazón y enjuagarlo con 0,9% de solución salina a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Procedimiento Embedding <ol><li> Preparar el corazón. <ol><li> Retire el pericardio del corazón, manteniendo las aurículas y los ventrículos intacta. Diseccionar la aorta ascendente ± 1 cm por encima de la válvula aórtica usando Klinkenbergtijeras. Cortar la vena cava inferior ± 1 cm desde la aurícula, y hacer lo mismo para las venas pulmonares. </li><li> Suturar el ápice del corazón a la parte inferior de un recipiente de plástico incrustación (17 x 15 x 15 cm, W x D x H) usando una sutura 2-0 para evitar la flotación del corazón durante la incrustación (Figura 1A). </li><li> Suturar la parte restante de la aorta a los bordes del recipiente usando 2-0, asegurándose de que el corazón está centrado y no tocar las paredes del recipiente (Figura 1B). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54974/54974fig1.jpg"> Figura 1: vista general esquemática y Fotografía de la incrustación de Container. (A) Descripción general esquemática del proceso de incrustación. El corazón (rojo) está asegurada en el recipiente (azul) usando suturas. Después de llenar el corazón con la solución de agar, el espacio alrededor del corazón está lleno. Finalmente,dos tubos de plástico rígido (amarillo) se colocan en el recipiente, junto a, pero sin tocar el corazón, para servir como una referencia durante el registro de imagen. (B) Fotografía de un corazón asegurado en el recipiente incrustación. Las suturas se sujetan al borde del recipiente usando abrazaderas de mosquitos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54974/54974fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="2"><li> Incrustar el corazón en una geometría de fin de diástole-similares. NOTA: La prevención de la creación de la burbuja de aire es necesario. Si las burbujas presentes en la solución de agar grande de aire, mantener el agar a 40 ° C, permitiendo que las burbujas de aire a la superficie. <ol><li> Sujetar la vena cava inferior usando pinzas de mosquito. inyectar lentamente el agar líquido usando una jeringa de 50 mL en la aurícula derecha a través de la vena cava superior hasta tanto en la aurícula y el ventrículo derecho están completamente llenos. </li><li> Abrazadera de las venas pulmonares utilizando mosquito abrazaderas. pasar suavemente una jeringa de 50 ml de agar-llenado retrógrada a través de las válvulas aórtica. inyectar lentamente la solución en el ventrículo izquierdo (VI) hasta que la LV y la aurícula izquierda están completamente llenos. Después de llenar el LV, sujetar la aorta para mantener el agar en el VI. </li><li> Vierta el agar que queda en el recipiente hasta que el corazón está totalmente cubierto. Coloque dos tubos rígidos de plástico dentro del contenedor de la incrustación para servir como estructuras de referencia para el registro de imágenes después (Figura 1A). Asegúrese de que los tubos no se toquen las paredes del recipiente o el corazón. </li><li> Deje que el agar solidifique a 2 - 7 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Adquisición de imágenes <ol><li> Realizar transversales ex vivo imágenes por resonancia magnética del corazón que está incrustado en el contenedor. <ol><li> Coloque el recipiente con el corazón incrustado dentro de una bobina de cabeza (Tabla de Materiales). </li><li> Dispuesto en ángulo de las rodajas paralelas a la parte inferior del recipiente. Utilizarla misma orientación y la angulación en cada secuencia ex vivo MRI. </li><li> Para visualizar miocardio, realizar una recuperación inversa fluido atenuada secuencia (FLAIR) con los siguientes parámetros: tiempo de repetición [TR] / tiempo de eco [TE] = 10 s / 140 ms, ángulo flip = 90 °, tamaño de píxel = 0,5 x 0,5 mm, campo de visión [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 de matriz, y grosor de corte 3-mm. </li><li> Para visualizar el infarto de miocardio, realice una tarde-gadolinio mejorado (LGE) de secuencia con los siguientes parámetros: [TR] / [TE] = 5,53 ms / 1,69 ms, ángulo flip = 25 °, tamaño de píxel = 1,0 x 1,0 mm, [ FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 de matriz, y grosor de corte 3-mm. </li><li> Para visualizar SPIOs, realizar una T2 * gradient-ponderada secuencia de eco con los siguientes parámetros: [TR] / [TE] = 88,7 ms / 15 TEs distribuidos igualmente con un rango de 1.9 - 24.6 ms, ángulo flip = 15 °, pixel size = 0,5 x 0,5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 de matriz, y grosor de corte 3-mm. </li></ol></li><li> proces de tejidocanta <ol><li> Girar el recipiente boca abajo y permitir que el aire entre el agar y los lados del recipiente para eliminar la solución de agar sólido, incluyendo el corazón, desde el recipiente. Retire las varillas de plástico del agar sólido. </li><li> Sección del bloque de agar que contiene el corazón en rebanadas de 5 mm desde el vértice hasta la base del corazón usando una máquina de cortar carne. Mantener la angulación de las rodajas cortadas las mismas que en las imágenes de RM adquiridos por el corte paralelo a la parte inferior del bloque de agar. </li><li> Tinción de las rodajas de agar (incluyendo el corazón) durante 15 min en 1% en peso de 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) disuelto en 0,9% de solución salina a 37 ° C, y fotografiar las rodajas en ambos lados desde una vista perpendicular (figura 2A). A continuación, enjuagar cuidadosamente las rodajas en 0,9% de solución salina. NOTA: En este estudio, se utilizó una configuración de DSLR con una lente / objetivo apropiado, un trípode, y la iluminación uniforme. Sin embargo, las fotografías sólo sirvieron como control para la evaluación de la región de la cicatriz,así que podría haber utilizado una configuración diferente. </li></ol></li><li> imágenes de fluorescencia NOTA: Dependiendo de la excitación y de emisión de longitudes de onda de las microperlas fluorescentes, seleccionar los láseres de bloque de filtro y de excitación apropiada (por ejemplo, las microperlas rojos utilizados aquí tienen excitación y emisión longitudes de onda de 580 nm y 605 nm, respectivamente, por lo tanto, el láser de excitación seleccionado y los filtros de paso de banda se fijaron a 532 nm, 580/30 nm y 610/30 nm, respectivamente). <ol><li> Seleccionar las imágenes en modo de fluorescencia en el escáner en modo variable. Ajuste el tubo fotomultiplicador a 430 V o equivalente y el tamaño de píxel de 100 x 100 m. Seleccionar un láser de excitación (532 nm) más cercana a la longitud de onda de excitación de las microperlas fluorescentes. </li><li> Para el primer bloque de filtro, seleccione un filtro de paso de banda (580/30 nm) que se superpone con la longitud de onda de emisión de las perlas de fluorescencia inyectados (canal 1). Selecciona un filtro de paso de banda para el bloque segundo filtro (610/30) fuera del correolongitud de onda de misión (canal 2). NOTA: El segundo bloque de filtro sirve como un control negativo y para eliminar auto-fluorescencia, manteniendo intactos los sitios de inyección. </li><li> Escanear ambos lados de las rodajas de agar en el modo de fluorescencia del escáner láser de modo variable usando los dos canales. Asegúrese de que cada rodaja se escanea completamente, incluyendo los agujeros de referencia. </li></ol></li></ol> 5. Post-procesamiento NOTA: El primer paso en la imagen post-procesamiento es la segmentación manual del miocardio mediante scripts desarrollados internamente para trazar la endo y epicárdicos fronteras, así como los sitios de inyección. Este es el mismo tanto para las exploraciones de resonancia magnética y de fluorescencia. <ol><li> Segmento del miocardio en las imágenes por resonancia magnética. <ol><li> Segmento del endocardio y de LV borders epicardio en la secuencia de imágenes de resonancia magnética FLAIR. </li><li> Copiar la segmentación LV desde el paso 5.1.1 al conjunto de datos LGE-RM y el segmento de la cicatriz en la secuencia de LGE MRI. </li><li> Copiar la segmentación miocardio desde el paso 5.1.1 a la T2 * de conjunto de datos-ponderada y segmentar las deposiciones SPIO en el miocardio LV. </li></ol></li><li> Procesar las imágenes de fluorescencia y realizar segmentaciones. <ol><li> Cargar los archivos obtenidos desde el escáner en modo variable y hacer una imagen separada de cada rebanada corazón de la sección transversal. </li><li> Voltear las rebanadas que fueron escaneados en la base al ápice orientación y ordenar las imágenes de fluorescencia en una pila para ambos canales que está orientado desde el vértice a la base. </li><li> Segmento del endocardio y de LV borders epicardio en las imágenes de fluorescencia. </li><li> Segmento de la cicatriz de forma manual en las imágenes de fluorescencia y el uso de la LGE-resonancia magnética y las fotografías para confirmar la morfología de la cicatriz. </li><li> Restar la pila de imágenes del canal 2 de la pila de imagen del canal 1 para excluir auto-fluorescencia. segmento manualmente las deposiciones de microesferas fluorescentes y usar el T2 * imágenes para su confirmación. </li></ol></li><li> Crearuna geometría 3D anatómicamente correcta, se realiza un registro rígida de las rebanadas en la pila de imagen basada en las estructuras de referencia (los agujeros creados por los tubos rígidos). Calcular y almacenar la traslación y rotación aplicada de cada imagen. </li><li> Aplicar las transformaciones almacenados para las pilas de imágenes y las segmentaciones. Linealmente interpolar las segmentaciones de ambos lados de las rebanadas de reconstruir el grosor del corte original y para crear un modelo 3D de los datos. </li></ol> 6. Análisis <ol><li> Realizar mediciones 2D y / o 3D de la distancia entre los centros de los sitios de inyección y la IBZ para evaluar la precisión de la inyección. Medir la distancia a lo largo del borde endocárdico de la segmentación del ventrículo izquierdo. En la Figura 2C y 2F, un ejemplo de las mediciones 2D y 3D se indica por la línea roja. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Whole-corazón de procesamiento del tejido de miocardio en 3D de acuerdo con este protocolo proporciona un método estructurado que permite el análisis en 3D del infarto, la IBZ, y las inyecciones realizadas con respecto a la anatomía cardiaca. El volumen de llenado del corazón depende del análisis deseado. En este estudio, para evaluar la exactitud de la inyección, que tuvo como objetivo llenar el corazón para parecerse a la geometría de fin de diástole lo más cerca posible. Para cumplir esto, el ápice LV se fija a la pa...

La cardiopatía isquémica ha sido la principal causa mundial de muerte en las últimas décadas 1. El tratamiento agudo después de infarto de miocardio tiene como objetivo restablecer el flujo de sangre al miocardio a través de la intervención coronaria percutánea o cirugía de revascularización coronaria. En infartos graves, una gran zona del miocardio está marcada, y estos casos a menudo resultan en la insuficiencia cardiaca isquémica (HF) 2. Las opciones terapéuticas actuales para el enfoque de HF en la prevención y la preservación de la función cardiaca de los pacientes con IC, pero no en la regeneración. En la última década, las terapias regenerativas cardiacos se han investigado como una opción de tratamiento de la IC 3. Esta terapia tiene como objetivo ofrecer productos biológicos, tales como células madre o factores de crecimiento, directamente al miocardio lesionado para inducir la revascularización, la protección de los cardiomiocitos, la diferenciación y el crecimiento 4. para una óptimaefecto terapéutico, se plantea la hipótesis de que la biológica se debe inyectar en la zona fronteriza del infarto (IBZ) para facilitar una buena perfusión tisular para la supervivencia de la biológica y para un efecto óptimo a la zona objetivo 5, 6. Múltiples técnicas se han desarrollado para llevar a cabo la identificación y la visualización de la IBZ para guiar las inyecciones intramiocárdicas 7, 8, 9, 10, 11. Además de la identificación y la visualización de la IBZ, la entrega también se basa en los biomateriales y catéteres de inyección utilizados. Para validar la precisión de la inyección de las técnicas de administración, se requiere un método de cuantificación precisa y reproducible. Hemos desarrollado un protocolo para el procesamiento de todo el corazón infarto de tejido que se ofrece en dos dimensiones (2D) y tres dimensional (3D) de imágenes, que puede ser utilizado para el estudio cualitativo y cuantitativo objetivo. El protocolo cubre el proceso de incorporación y el análisis de imagen digital. En este trabajo, se demuestra un protocolo para la evaluación de la precisión de la focalización de las inyecciones intramiocárdicas en el IBZ en un gran modelo porcino de infarto de miocardio crónico.

<table><tbody><tr><td>0.9% Solución salina</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Roche Diagnostics</td><td></td><td>Agar multipropósito de grado científico</td></tr><tr><td>Escáner de fluorescencia biomolecular Typhoon 9410&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenedor</td><td></td><td></td> de incrustación <td>Plástico, dimensiones 17 x 14,5 x 14 cm</td></tr><tr><td>FluoSpheres Microesferas de poliestireno</td><td>Invitrogen</td><td>F8834</td><td>rojo, 10 y micro; m</td></tr><tr><td>Gadolinio</td><td>Gadovist</td><td></td><td>1.0 mmol/mL</td></tr><tr><td>dS Bobina de cabezal de 32 canales</td><td>Philips</td><td></td><td>O similar</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Para asegurar la compatibilidad 2015a o más reciente</td></tr><tr><td>Cortadora de carne</td><td>Berkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myostar catéter de inyección</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super partículas paramagnéticas de óxido de hierro</td><td>Sinerem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de trifenil-tetrazolio</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPy-PEG10k</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2-0</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis del tejido de miocardio entero en 3d del corazón

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

terapias regenerativas cardíacos tienen como objetivo proteger y reparar el corazón dañado en pacientes con cardiopatía isquémica. Mediante la inyección de células madre u otras sustancias biológicas que mejoran la angio- o vasculogénesis en la zona fronteriza del infarto (IBZ), la perfusión del tejido se mejora, y el miocardio puede ser protegido de daños mayores. Para el efecto terapéutico máximo, es la hipótesis de que la sustancia regenerativa se entrega mejor a la IBZ. Esto requiere inyecciones precisas y ha llevado al desarrollo de nuevas técnicas de inyección. Para validar estas nuevas técnicas, hemos diseñado un protocolo de validación basado en un análisis del tejido de miocardio. Este protocolo incluye el procesamiento de tejido de miocardio de todo el corazón que permite detallada de dos dimensiones (2D) y el análisis tridimensional (3D) de la anatomía cardiaca y las inyecciones intramiocárdicas. En un cerdo, infarto de miocardio fue creado por un 90-min la oclusión de la arteria descendente anterior izquierda coronaria. Cuatro semanas más tarde, un mixtoure de un hidrogel con partículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPIOs) y perlas fluorescentes se inyectó en el IBZ utilizando un enfoque endocardial mínimamente invasiva. 1 h después del procedimiento de inyección, el cerdo fue sacrificado, y el corazón se extirpó y se incrusta en agarosa (agar). Después de la solidificación del agar, se realizaron imágenes de resonancia magnética (MRI), el corte en lonchas del corazón, y de imágenes de fluorescencia. Después de imagen post-procesamiento, se realizó un análisis 3D para evaluar la precisión de la focalización IBZ. Este protocolo proporciona un método estructurado y reproducible para la evaluación de la precisión de la focalización de las inyecciones intramiocárdicas en el IBZ. El protocolo puede ser utilizado fácilmente cuando se desea el tratamiento de tejido cicatricial y / o validación de la precisión de la inyección de todo el corazón.

incrustación de tejidos A través del proceso de incrustación, se estableció una geometría telediastólico-similares. El agar adherido con éxito para el tejido del corazón, lo que permite que el tejido a cortar en la angulación deseada con espesores rebanada iguales (Figura 2A y 2C). Evaluación del SCAR y el lugar de inyección <p class=...

Este protocolo describe un nuevo método para la comparación 3D de tejido de miocardio de todo el corazón con MRI. Esto está diseñado para la evaluación precisa de inyecciones intramiocárdicas en la zona fronteriza del infarto de un modelo porcino crónica de un infarto de miocardio.

El análisis del tejido de miocardio entero en 3D del corazón

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Narrador}El objetivo general de este protocolo es facilitar un método estructurado y reproducible para el procesamiento 3D de tejido cardíaco entero que pueda utilizarse para evaluar la precisión de la orientación de las inyecciones intramiocárdicas en la zona fronteriza del infarto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina cardioregenerativa, como el desarrollo de la práctica y la optimización de las técnicas de inyección. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece un método estandarizado y reproducible para el procesamiento 3D de tejido de corazón entero.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias regenerativas cardíacas y la validación de la precisión de la inyección de las técnicas de administración normales. El objetivo de esta terapia con células madre cardíacas es inyectar células en la zona del borde del infarto para estimular la vasculogénesis local y la protección de los cardiomiocitos. Capturar el corazón al final de la fase diastólica requiere práctica y paciencia.Una demostración visual de estos pasos es fundamental. Comience separando el pericardio del corazón inyectado con microperlas,

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Evaluación ultrasónica de la microestructura miocárdica

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Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.

Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes de micro tomografía computarizada de alta resolución de corazones enteros de mamíferos grandes sanos y patológicos con mejora de contraste selectivo de colágeno.

Técnicas de preparación de tejidos para imágenes de microtomografía computarizada mejoradas con contraste de modelos cardíacos de mamíferos grandes con enfermedades crónicas

Este protocolo presenta una línea completa para analizar muestras obtenidas de corazones humanos que abarcan las escalas microscópica y macroscópica.

Pipeline para el estudio anatómico tridimensional multiescala del corazón humano

En este artículo, describimos un protocolo para utilizar la ecografía cuatridimensional in vivo y la espectrometría de masas ex vivo para evaluar las alteraciones biomecánicas y biomoleculares en el sistema cardiovascular murino. Esta técnica se aplica para analizar el remodelado cardíaco en el infarto de miocardio inducido quirúrgicamente y los cambios vasculares en animales envejecidos.

Estudio multimodal de la remodelación cardiovascular murina: ecografía cuatridimensional y espectrometría de masas

La reconstrucción tridimensional (3D) del daño cardíaco en el infarto agudo de miocardio reperfundido (repAMI) permite la cuantificación fiel y la colocalización de los patrones asociados que afectan a la enfermedad. Aquí, se proporciona un enfoque de imágenes automatizado guiado por hojas de luz para la medición contemporánea del daño cardíaco, el área en riesgo y la respuesta de las células inmunitarias.

Análisis 3D simultáneo del daño cardíaco y la respuesta inmune en el infarto agudo de miocardio reperfundido mediante microscopía de fluorescencia de hoja de luz

El presente ensayo de cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) introduce un protocolo de tinción TTC refinado que permite el análisis de lesiones miocárdicas a resolución microscópica, produciendo imágenes de alta calidad que permiten una evaluación precisa y fiable del tamaño del infarto y la viabilidad del cardiomiocito a nivel celular.

Un ensayo microscópico de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio para un análisis preciso y fiable de la lesión miocárdica

Aprenda un método estandarizado para el procesamiento de tejido miocárdico cardíaco en 3D utilizando resonancia magnética en un modelo porcino de infarto. Esta técnica mejora la precisión en la evaluación de inyecciones intramiocárdicas.

El análisis del tejido de miocardio entero en 3D del corazón

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