Name: El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir En Vivo Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a medir la capacidad de fosforilación oxidativa mitocondrial en músculo esquelético humano mediante espectroscopía de resonancia magnética de fósforo-31 in vivo. Esta técnica no invasiva permite evaluaciones seriadas.

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Este trabajo fue apoyado en parte por un Premio Trifit del Instituto de Investigación del Corazón y los Pulmones de Davis, así como por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los NIH.

Este protocolo se aprobó por y sigue las directrices de la Junta de Revisión Institucional Universidad Estatal de Ohio para la investigación con sujetos humanos. Es de vital importancia que todos los procedimientos que implican equipos de RM son realizadas por personal debidamente capacitado que se adhieren a los más altos estándares de seguridad MR 59. 1. Materiales y Preparación <ol><li> Asegúrese de que todos los materiales necesarios están disponibles antes del experimento (Figura 2). </li><li> Conecte la bobina de 31P en el conector de la bobina en la tabla al final de la mesa de examen más cercano al agujero. Colocar un cojín de espuma triángulo grande cerca de la cabecera de la mesa examen de RM, pero no directamente sobre la bobina 31P. Coloque una almohada la cabeza en el otro extremo de la mesa de examen de RM, más alejada del orificio, para la comodidad del asunto. </li></ol> 2. Sin perjuicio de la posición (Figura 3a) <ol><li> Instruir al objeto de estar en posición supina, piesen primer lugar en la tabla de MR. Colocar un cojín de espuma debajo de las rodillas para apoyar la pierna en una posición parcialmente flexionada. </li><li> Coloque el sujeto cerca de la parte derecha de la tabla (a la derecha del sujeto) con el fin de centrar el muslo izquierdo como de cerca para el isocentro imán como sea posible, asegurando así la homogeneidad B0 óptima en el músculo del muslo bajo examen. Proporcionar al sujeto con tapones para los oídos y / o auriculares. </li><li> Coloque la bobina de RF 31 P en los cuádriceps izquierdo en aproximadamente el punto medio entre la rótula y la cabeza del fémur, y asegure a la pierna mediante correas. Coloca la bobina sobre la parte lateral de la pierna, sobre el vasto lateral. </li><li> Asegure el aceite de bebé a la cara medial del muslo con las mismas correas usadas para asegurar la bobina a la pierna. Esto facilita la localización de exploración. </li><li> Enlazar piernas del sujeto junto con una correa colocada debajo de la bobina y por encima de la rodilla. Asegurar las patas del sujeto a la mesa de MR con estra adicionalps, una encima de la rodilla y una mitad de camino entre la rodilla y el tobillo. </li><li> Utilice la guía de luz láser para delinear el centro de la bobina y mover la mesa para el isocentro del imán usando este punto de referencia de centrado. </li></ol> Protocolo 3. Ejercicio <ol><li> Explicar al objeto de que el protocolo de ejercicio consta de tres fases: una primera fase, la línea de base; una fase de ejercicio corto, intenso; y una fase de recuperación. </li><li> Instruir al sujeto a permanecer inmóvil y relajar sus músculos de las piernas durante la línea base y de recuperación de las fases de la adquisición de espectroscopia con el fin de minimizar los artefactos de movimiento. </li><li> Proporcionar una cuenta atrás para el sujeto que indica el comienzo del ejercicio. En este punto, tiene el sujeto iniciar rodilla extensión / flexión como la fuerza y ​​lo más rápidamente posible en contra de la resistencia de las correas. NOTA: Los músculos cuádriceps se utilizan para mover la pierna inferior izquierda arriba y abajo, hasta que se indique que se detuviera. </li><li> Terminar el ejercicio después de una caída de 30%en la altura del pico de PCR. <ol><li> Observar la altura del pico PCr en la ventana del visor de adquisición, y también visualizarla sobre la terminación de la secuencia de ejercicio. NOTA: Una pauta general es que un aproximado gota 30% en la altura del pico PCr corresponde a un pico Pi que es 50% de la altura del pico de PCr. Si PCr agotamiento no está ocurriendo lo suficientemente rápido como para alcanzar una caída de 30% durante la fase de ejercicio del examen, fomentar el objeto de lanzar más fuerte o más rápido durante el ejercicio. NOTA: La cesación de ejercicio se determina mediante el control de la altura del pico de PCr y duración del ejercicio. Esto puede ocasionar un ligero diferentes duraciones de ejercicio en diferentes pacientes y puede ser valoradas en el análisis. </li></ol></li></ol> 4. Protocolo de escaneado <ol><li> Adquirir un localizador tri-plano para verificar la posición correcta del sujeto e identificar la ubicación de la bobina 31 P. NOTA: La secuencia del localizador comienza automáticamente y se centra en la indicado posición utilizando la guía de luz láser (paso 2.9) </li><li> Adquirir un segundo localizador tri-avión. <ol><li> Abra la vista de la rebanada en las primeras imágenes del localizador tri-plano. NOTA: Este proceso puede ser diferente para diferentes sistemas de software y hardware. </li><li> Centro y rotar la orientación rebanada haciendo clic izquierdo y la celebración en el grupo de la rebanada. Girar el grupo rebanada. Asegúrese de que la orientación final de las rebanadas coincide con la posición del aceite para bebé. </li><li> En la ventana de rutina de secuencia, aumentar el número de cortes para cubrir toda la pierna en la imágenes sagitales (Figura 3B) axial y. </li></ol></li><li> Secuencia de espectroscopia 31P: <ol><li> Utilice los siguientes parámetros de la secuencia de impulsos no localizados a adquirir: TR: 1.000 ms; TE: 0,34 mseg; anchura espectral: 2000 Hz; ángulo de inclinación: 90 grados; puntos de datos adquiridos: 1.024; 4 promedios resultantes en una resolución de tiempo de 1 espectro cada 6 seg. </li></ol></li><li> 31 P cuña box colocación: <ol><li> El uso de un ratón, arrastrar el segundo imágenes triplane localizador en la ventana de visualización en la parte superior de la pantalla. Arrastre la secuencia de la espectroscopia en la ventana de protocolo y haga doble clic para abrir. </li><li> Utilice la barra de herramientas para visualizar la posición del voxel cuña (seleccione el rectángulo negro con líneas horizontales). Después de seleccionar esta opción, observar un cuadro verde de las imágenes del localizador. NOTA: Este es el voxel cuña. </li><li> Mueva el voxel haciendo clic izquierdo y manteniendo pulsado el voxel en el centro. Cambiar el tamaño y rotar la orientación del voxel haciendo clic izquierdo y manteniendo pulsado el voxel en la esquina de la caja. Coloque la caja de cuña a fin de asegurar la homogeneidad de campo B0 directamente debajo de la bobina y paralela al plano de los cuádriceps. NOTA: Esto es para asegurar cuñas adecuada dentro de la región sensible bajo la bobina, que es el volumen de tejido directamente debajo del centro de la bobina. </li><li> Utilizar las imágenes tri-plano localizador para identificar el sensitive región de la bobina y ajustar el cuadro de cuña para abarcar esta región dentro del músculo cuádriceps. NOTA: La caja de cuña puede ser mayor que el verdadero alcance de la bobina de superficie con el fin de asegurar la homogeneidad B0 dentro del voxel de adquisición de datos (Figura 3c). </li><li> 31 P adquisición de ensayo: <ol><li> Abra la ventana del visor de adquisición y seleccione el icono de la cabeza de la barra de herramienta de adquisición. Esto permitirá la visualización de la adquisición espectroscopia en tiempo real. </li><li> Después de la colocación de la cuña del voxel 31P, ejecute la secuencia para obtener un solo espectro haciendo clic en el botón "Ejecutar" en la parte superior de la ventana de protocolo. </li><li> Examinar la calidad de cuñas B0. Observar el espectro resultante en la ventana de adquisición. Observar un pico prominente PCr con centro en 0 ppm y ningún ruido significativo (Figura 4a, izquierda). NOTA: Solución de problemas: Si aparece el espectro de ruido, asegúrese de que el cuadro de cuña se coloca dentro del músculo. Anunciosólo el tamaño y la posición de la caja de cuña para mejorar la relación señal-ruido. Repita la adquisición de ensayo, según sea necesario. </li><li> Con el fin de ver la altura del pico de PCr, abrir el espectro en la herramienta de espectroscopía ( "Aplicaciones" → "Espectroscopia"). Abra la carpeta del paciente (icono de árbol de carpetas), seleccione el análisis apropiado, y haga doble clic para cargar el espectro. </li></ol></li></ol></li><li> Imagen T1 antes del ejercicio: <ol><li> Obtener una imagen ponderada en T1 axial una de un único segmento en el centro de una bobina. </li></ol></li><li> 31 P adquisición antes del ejercicio: <ol><li> Copiar la secuencia desde el paso 4.4 (que produce la mejor calidad espectral) haciendo clic izquierdo y arrastrando la secuencia en la ventana de protocolo. Utilice esta secuencia para todas las mediciones posteriores. </li><li> En la ventana de rutina de secuencias, aumentar el número de mediciones de 1 a 10. Seleccionar plazo para adquirir 10 mediciones mientras el sujeto está en reposo. </li></ol></li><li> 31 &lt;/ Sup&gt; P adquisición de ejercicio: NOTA: Hacer buena nota de las horas de inicio y fin de ejercicio, ya que esto será importante para el análisis. <ol><li> Resto: Aplicar la configuración de cuña de la consulta anterior y establece la secuencia de adquirir 20 mediciones. Instruir al sujeto para comenzar a patadas tras una cuenta atrás. Instruir al sujeto a permanecer en reposo durante 2 mediciones. </li><li> Ejercicio: Pida al sujeto para realizar el ejercicio de extensión de la rodilla y 30 segundos (o el tiempo necesario para lograr una disminución del 30% en la amplitud de pico PCR). Después de que el sujeto logra suficiente PCr agotamiento, pedirles que descansar. </li></ol></li><li> 31 P después del ejercicio adquisiciones: <ol><li> Adquirir un 20 mediciones adicionales en reposo. Asegúrese de que las adquisiciones posteriores al ejercicio comienzan inmediatamente después de la secuencia de ejercicios, sin pausa ni cuñas (Figura 4a, derecha). NOTA: La subdivisión de este período de recuperación en dos adquisiciones separadas permite el análisis de la initial 20 espectros dinámico durante la adquisición de la segunda espectros dinámico 20, que permite al operador para evitar la adquisición del período de recuperación completa si el ejercicio necesita ser repetido. </li></ol></li><li> Asegurar la calidad del ejercicio: <ol><li> Comparación de las alturas de los picos de PCr al principio y al final del ejercicio. sesiones de ejercicio de alta calidad resultan en una disminución de ~ 30% en la concentración de PCR. </li><li> Compruebe que la altura del pico PCr es el mismo en principio de descanso y en el extremo de recuperación (típicamente, &lt;se desea diferencia 10%). Esto asegura que no había pérdida insignificante de homogeneidad de campo durante la adquisición. NOTA: Si la avería PCR es insuficiente, o si se ha producido una pérdida de homogeneidad del campo, a continuación, repetir la etapa de ejercicio / recuperación del examen (teniendo cuidado de evitar la fatiga), asegúrese de que la bobina y las correas estén bien sujetos, y se extienden la duración del ejercicio y / o fomentar el ejercicio más vigoroso (Figura 4b). NOE: Una comparación de las imágenes obtenidas en los pasos 6 y 11 permite un paso de control de calidad adicional para visualizar cualquier desplazamiento del muslo y la bobina debido al ejercicio, lo que garantiza que el movimiento mínimo se produjo durante el protocolo, lo que podría afectar de manera significativa los datos adquiridos . </li></ol></li><li> Siguiendo imágenes T1 post-ejercicio, repetir el ejercicio pre-axial de imágenes T1 (paso 4.5) utilizando los mismos parámetros de adquisición. <ol><li> Además de agotamiento suficiente de PCr, medir el ejercicio pH final para garantizar que el ejercicio no indujo acidosis del músculo. </li><li> Realice esto midiendo el desplazamiento químico entre Pi y PCr (delta P i) y el uso de la siguiente ecuación 60: pH = 6,77 + log [(delta P i -3,29) / (5,68-delta P i)] NOTA: El pH debe permanecer superior a 6,8 61. Si la avería PCR es suficiente, pero el pH es demasiado bajo, repetir la sesión de ejercicio durante un cortoer duración y / o con una intensidad disminuida. </li></ol></li><li> Almacenamiento de datos: <ol><li> Salvar a todos los espectros adquiridos como archivos DICOM y exportarlos para su procesamiento utilizando JMRUI. </li><li> Si se utiliza un escáner, seleccione todas las adquisiciones de espectroscopia en la ventana "Navigator". </li><li> En "Aplicaciones", seleccione "Herramientas" → Dicom "Exportar MR Spectroscopy", y guardar los archivos DICOM (*) .dcm en C: / usuario / MedCom / temp / CDROFFLINE (La herramienta automáticamente elige esta ubicación). </li><li> En "transferencia", seleccione "Exportar a fuera de línea." Añadir a la ubicación deseada. </li></ol></li></ol> 5. Procesamiento de Datos y Análisis 62 <ol><li> Analizar los espectros de RM con el software JMRUI de libre disposición (versión 5.2; http://www.jmrui.eu/). </li><li> Apodize y desplazamiento de fase en los espectros para asegurar la uniformidad sobre todos los puntos de tiempo adquiridos (Figura 5). El pico de PCr se centrará unat 0 ppm en los espectros. </li><li> Usar el algoritmo AMARES incorporado para cuantificar la amplitud del pico de PCr en cada espectro adquirido. La amplitud de pico representa la concentración de PCr dentro de la región sensible de la bobina de superficie en ese punto de tiempo particular. </li><li> En el software de cálculo, trazar las concentraciones de PCr como una función del tiempo de adquisición. Uso de la herramienta integrada de ajuste de la curva de software computacional, se ajusta a los datos del período de recuperación de PCR para la siguiente ecuación 52, 63: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq1.jpg"></li><li> Registre los valores de la línea base de PCr ( <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq2.jpg"> ), El más bajo de PCR ( <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq3.jpg"> ), Y el tiempo de recuperación ( <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq4.jpg"> . </li><li> Asegúrese de que se cumplen las condiciones apropiadas durante el ejersesión CISE mediante el cálculo del agotamiento de PCr, la diferencia porcentual entre la línea de base PCr y el más bajo de PCR. sesiones de ejercicio ideal dan como resultado un 20 - 50% de agotamiento. NOTA: La calidad del ajuste de la curva se puede asegurar mediante la verificación de que el valor R 2 es mayor que 0,75. R 2 valores se calculan automáticamente por el software de adaptación. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este documento describe un protocolo estándar para 31 PMRS examen que permite la medición de serie y no invasiva in vivo de la función mitocondrial del músculo esquelético. El protocolo tiene un atractivo considerable cuando se considera la amplitud de las investigaciones dirigidas a la creciente carga de síndrome metabólico y su morbilidad y mortalidad resultante. Este protocolo 31 PMRS requiere una cantidad mínima de tiempo escáner y puede ser incorporado en las investigaciones metabólic...

El objetivo de este trabajo es describir un método reproducible para medir de forma no invasiva in vivo la función mitocondrial en el músculo esquelético en individuos que poseen una amplia gama de habilidades. deterioro mitocondrial aberrante es un sello distintivo de una amplia gama de síndromes metabólicos y enfermedades genéticas, de las condiciones comunes como el envejecimiento y la diabetes a enfermedades raras tales como la ataxia de Friedreich. Síndrome metabólico y disfunción mitocondrial El síndrome metabólico se ha demostrado que alteran la función mitocondrial, deprimir la fosforilación oxidativa del músculo esquelético, y dar lugar a almacenamiento de lípidos ectópico en el músculo esquelético 1, 2. Como orgánulos críticos que regulan metabólica y la homeostasis de la energía, las mitocondrias están implicados en la fisiopatología de la obesidad 3, 4, 5 resistencia a la insulina </sup&gt;, Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 6, 7, relacionadas con la diabetes micro 8, 9, 10, 11 y macrovasculares 12, 13, y no alcohólicas hígado graso (NAFLD) 14, 15, 16, entre otros .Insulin resistencia se caracteriza por profundos cambios en la actividad mitocondrial del músculo esquelético, incluyendo disminución de la frecuencia mitocondrial de los ácidos tricarboxílicos (TCA) de flujo, tasa de síntesis de ATP y citrato sintasa y NADH: O2 actividad oxidorreductasa 5. Una hipótesis es que estas alteraciones podrían deberse a la acumulación de metabolitos de ácidos grasos libres (AGL) en el músculo, que se aumentan notablemente durante la obesidad y otra obesidad-renfermedades eufóricos 2, 17. La exposición de músculo para AGL elevados y productos intermedios de lípidos puede disminuir la expresión de genes en la vía oxidativa de los lípidos, así como el ciclo de TCA y la cadena de transporte de electrones (ETC) 18. Esta reducción de la capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial del músculo esquelético en la fijación de una sobrecarga de lípidos se acompaña de una disminución en el cuantitativo (contenido y la biogénesis de las mitocondrias) 19 y la función cualitativa de las mitocondrias del músculo esquelético 20. La exposición de los miocitos del músculo esquelético y de ácidos grasos libres conduce a la resistencia grave a la insulina, y aumento de la captación de FFA en el músculo está asociada con resistencia a la insulina en los seres humanos y roedores 21. La ceramida intermedios de lípidos y diacilglicerol (DAG) han demostrado inhibir directamente la vía de señalización de la insulina mediante la alteración de la actividad de quinasas, como la proteína quinasa C y protein quinasa B 21. Por lo tanto, las moléculas de derivados de lípidos parecen desempeñar un papel destacado en el desarrollo de la resistencia a la insulina del esqueleto muscular y DM2. Sin embargo, no queda claro si los cambios en la capacidad mitocondrial son una causa o una consecuencia de la resistencia a la insulina 22. La disfunción mitocondrial y la Ataxia de Friedrich Disminución de la fosforilación oxidativa también pueden surgir de defectos genéticos. Ataxia de Friedrich (FA), la forma más común de ataxia hereditaria, es un trastorno genético provocado por una mutación en el frataxina (FXN) de genes, lo que resulta en la acumulación de hierro intra-mitocondrial, la producción de especies reactivas de oxígeno, y las anormalidades de la fosforilación oxidativa 23, 24, 25, 26. Este importante descubrimiento ha conducido al desarrollo de terapias dirigidas, which objetivo de mejorar la función mitocondrial a nivel subcelular. A pesar de este conocimiento, ha habido un desarrollo limitado de in vivo, marcadores biológicos reproducibles para la investigación clínica FA. De hecho, una barrera crítica en la evaluación efectiva de las terapias dirigidas en FA es la incapacidad para realizar un seguimiento de los cambios en la función mitocondrial. medidas funcionales actuales, por ejemplo, puede identificar disminución del gasto cardíaco; sin embargo, son incapaces de determinar el nivel en el que se produce la disfunción (Figura 1). El desarrollo de un marcador fiable de la función mitocondrial que puede ser utilizado para identificar y evaluar la progresión de la enfermedad en la ataxia de Friedrich es crucial para calibrar el impacto mecánico correspondiente de terapias dirigidas. Deterioro de la fosforilación oxidativa y la disfunción cardíaca la función mitocondrial aberrante, ya sea adquirida o genética, podría contribuir al desarrollo o la progresión de cardidisfunción ac. En las condiciones de sobrecarga de presión y la insuficiencia cardíaca, los interruptores de preferencia de sustrato de energía primaria de FFA a la glucosa. Esto se asocia con una disminución de la actividad de ETC y la fosforilación oxidativa 27. La fisiopatología de la bioenergética mitocondrial en la disfunción cardíaca puede ser diferente dependiendo del origen primario del defecto mitocondrial. La diabetes y el síndrome metabólico resulta en alteraciones mitocondriales en el miocardio, como la biogénesis deteriorado y el metabolismo de los ácidos grasos, los cuales conducen a la reducida flexibilidad de soportes, la eficiencia energética, y, finalmente, la disfunción diastólica 28, 29. En FA, por otro lado, una deficiencia de frataxina resultado en la acumulación de hierro mitocondrial significativa en cardiomiocitos 30, 31. La acumulación de hierro conduce a la producción de radicales libres a través de la reacción de Fenton 32 &lt;/ Sup&gt; y aumenta la probabilidad de daño de los cardiomiocitos inducida por radicales. La acumulación de hierro Intra-mitocondrial también se asocia con un aumento de la sensibilidad al estrés oxidativo y una capacidad oxidativa reducida 30, 31. La acumulación de hierro y la posterior función mitocondrial aberrante, debido a la deficiencia de frataxina, por lo tanto, pueden ser responsables de la energética cardíacas y alteraciones observadas en la miocardiopatía FA 33, 34. También es interesante notar que la capacidad oxidativa reducida en las mitocondrias del músculo esquelético es paralela a la intolerancia al ejercicio y reducción de la capacidad metabólica en la insuficiencia cardíaca (HF) 35. Medición de la capacidad de la fosforilación oxidativa del músculo esquelético, como se detalla en el presente documento, es fácilmente implementable y robusto; junto con la importancia de la fosforilación oxidativa del músculo esquelético en la IC, estas características lo convierten en un atractivo biomarcador en estudios completos sobre los oyenenfermedad t 36. La fosforilación oxidativa y la alteración de la disfunción cardíaca acompañante no es un aspecto insignificante del metabolismo y enfermedad mitocondrial. Los sujetos con diabetes y enfermedades metabólicas están en un riesgo mayor de desarrollar enfermedades cardiovasculares y tienen exceso de mortalidad después de un infarto de miocardio (IM) 37, 38, 39, 40, 41; más de la mitad de los sujetos con AF tienen cardiomiopatía, y muchos mueren de arritmia cardíaca o insuficiencia cardíaca 42. Por lo tanto, la cuantificación de la reducción de la fosforilación oxidativa no sólo podría permitir la detección y el tratamiento de la disfunción cardiaca temprana, pero también podría aliviar una carga importante clínica en estas enfermedades. Las terapias dirigidas a aumentar directamente la capacidad de la fosforilación oxidativa es un área prometedora para mejorar el tratamiento de sujetos, cuando planeesTher la causa de la disfunción metabólica es genética o adquirida. En la actualidad, el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos a dianas que, o bien alivian la función mitocondrial anormal 43 o corregir el defecto genético primario 44 puede mejorar la característica bioenergética trastornada de la FA. En el caso de la disfunción mitocondrial adquirido, el aumento de la actividad física puede mejorar mitocondrial función 45, 46, 47. 31 El fósforo Espectroscopia de Resonancia Magnética como biomarcador no invasivo de la función mitocondrial Independientemente de la terapia de la prueba, un sistema integrado de evaluación in vivo de la bioenergética del músculo esquelético es una herramienta fundamental para evaluar el impacto de las intervenciones dirigidas, sobre todo en sujetos con intolerancia al ejercicio intenso o la incapacidad para someterse a metabo convencionallas pruebas lic. Espectroscopia de resonancia magnética sintonizado a fósforo (31 PMRS), un núcleo endógeno encontrado en varios sustratos de alta energía dentro de las células en todo el cuerpo, se ha utilizado para cuantificar la capacidad oxidativa mitocondrial usando una variedad de enfoques, incluyendo en-imán protocolos de ejercicio de recuperación y protocolos de estimulación muscular 48. Los protocolos de ejercicios de recuperación dependen de una variedad de aparatos que van en complejidad desde ergómetros compatibles con resonancia magnética que regulan y miden la carga de trabajo para configuraciones simples de las correas y las almohadillas que permiten tipo de ráfaga-resistivo y el ejercicio cuasi-estática. Uno de los objetivos principales de cualquiera de estos protocolos es producir un desequilibrio energético para los que se cumple inicialmente la demanda de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la descomposición enzimática de la fosfocreatina (PCr) a través de la reacción de la creatina quinasa 49. Tras el cese de ejercicio, la tasa de producción de ATP está dominado por pho oxidativosphorylation y representa el máximo de la capacidad in vivo de la mitocondria 50. Por otra parte, la fosforilación oxidativa durante la recuperación después del ejercicio puede describirse mediante una reacción de velocidad de primer orden 51. Por tanto, la recuperación post-ejercicio de la PCR puede ser cuantificado mediante la instalación de una constante de tiempo exponencial (τ PCR), con menores valores de τ PCr que representan una mayor capacidad para la síntesis de ATP oxidativo. Se han hecho esfuerzos significativos para validar 31 PMRS contra ex vivo y medidas más directas de la fosforilación oxidativa y demostrar el potencial de aplicabilidad clínica de esta técnica 52, 53, 54, 55. En particular, el protocolo descrito en este trabajo se puede implementar en escáneres clínicamente disponibles, y que ha sido ampliamente validado como un biomarcador no invasivo of la función mitocondrial 56. Sin embargo, un protocolo de ejercicio PMRS 31 optimizado para su aplicación a los individuos con diferentes niveles de gravedad de la discapacidad neuromuscular o la movilidad no ha sido bien establecida 57. A, protocolo de ejercicio ampliamente aplicable bien definido y 31 técnica PMRS serían particularmente útiles en la evaluación de las enfermedades con anomalías fundamentales en la función mitocondrial. Varios estudios anteriores han explorado las aplicaciones de las técnicas no invasivas para cuantificar la función mitocondrial en sujetos. Por ejemplo, estas técnicas han demostrado la fosforilación oxidativa alterada en sujetos con diabetes tipo 2 36. Lodi et al. primero probado la viabilidad de las técnicas de PMRS en sujetos con FA y se encontró que 1) el defecto genético fundamental en FA afecta la fosforilación oxidativa del músculo esquelético y 2) el número de triplete GAA se repite es inversamente proporcional al músculo esquelético OXPHOS 33. Más recientemente, Nachbauer et al. PMRS utiliza como una medida de resultado secundaria en un ensayo de la droga FA con 7 temas. Los tiempos de recuperación de PCR fueron significativamente más largo en comparación con los controles sujetos, reafirmando el trabajo anterior de Lodi y que indica que los efectos de la expresión aberrante de la frataxina en FA puede resultar en una disminución de la capacidad mitocondrial que es detectable usando técnicas PMRS 58. Los métodos fiables para definir adecuadamente vivo en función del músculo esquelético en un rentable, y de manera factible y reproducible son críticos para mejorar los resultados de sujetos en una serie de enfermedades que afectan a la función mitocondrial. Este trabajo describe un procedimiento robusto para la obtención in vivo máxima capacidad oxidativa del músculo esquelético utilizando 31 PMRS. El protocolo de ejercicio en-imán es bien tolerado por los individuos que abarcan una amplia gama de física y funcionalismol habilidades y produce a una configuración simplificada sujetos utilizando equipos de bajo costo y ampliamente disponible.

<table><tbody><tr><td>1.5 T MR Scanner</td><td>El fabricante de Siemens</td><td>no afectará</td>los <td></td> resultados</tr><tr><td>Bobina de transmisión-recepción de 10 cm 31P, el fabricante PulseTeq</td><td></td><td></td> compatible con 1.5T <td>no afectará los resultados</td></tr><tr><td>3 fl oz Baby Oil</td><td>Johnson & El fabricante de Johnson</td><td></td><td>no afectará los resultados</td></tr><tr><td>Cojín triangular de espuma (rodilla)</td><td>El fabricante de Siemens</td><td>no afectará</td> los <td></td> resultados</tr><tr><td>(3) correas resistivas de hebilla de plástico; el</td> fabricante <td>de Siemens</td><td>de mesa a mesa no afectará</td> los <td></td> resultados</tr><tr><td>(1) correa resistiva de hebilla de plástico; autoconectante</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir en vivo capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

La capacidad de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) del músculo esquelético, que es de importancia crítica en la salud y la enfermedad, puede medirse in vivo y de forma no invasiva en humanos mediante espectroscopia de resonancia magnética de fósforo-31 (31PMRS). Sin embargo, el enfoque no ha sido ampliamente adoptado en la investigación traslacional y clínica, con variaciones en la metodología y orientación limitada de la literatura. Una mayor optimización, estandarización y difusión de los métodos para PMRS in vivo 31facilitaría el desarrollo de terapias dirigidas para mejorar la capacidad de OXPHOS y, en última instancia, podría tener un impacto favorable en la salud cardiovascular. 31PMRS produce una medida no invasiva in vivo de la capacidad de OXPHOS en el músculo esquelético humano, a diferencia de las medidas alternativas obtenidas de mitocondrias explantadas y potencialmente alteradas a través de biopsias musculares. Se basa solo en una modesta instrumentación adicional más allá de la que ya existe en los escáneres de resonancia magnética disponibles para la investigación clínica y traslacional en la mayoría de las instituciones. En este trabajo, describimos un método para medir in vivo el músculo esquelético OXPHOS. La técnica se demuestra utilizando un escáner de resonancia magnética de cuerpo entero de 1,5 Tesla equipado con el hardware y el software adecuados para 31PMRS, y explicamos un protocolo simple y robusto para el ejercicio resistivo en el imán para fatigar rápidamente el músculo cuádriceps. La reproducibilidad y la viabilidad se demuestran tanto en voluntarios como en sujetos de una amplia gama de capacidades funcionales.

Estudio de reproducibilidad Seis voluntarios (4 hombres y 2 mujeres, edad media: 24,5 ± 6,2 años) con ningún corazón auto-reporte, metabólico o enfermedad mitocondrial se sometieron a sesiones de ejercicio y Técnica de escaneo 31 PMRS se describe en 2 días diferentes dentro de 1 semana para evaluar la técnica reproducibilidad (Figura 6a). Los estudios realizados en voluntarios norma...

Este trabajo demuestra la viabilidad de una técnica de espectroscopia de resonancia magnética de fósforo-31 (31PMRS) in vivo para cuantificar la capacidad de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) en el músculo esquelético humano.

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir En Vivo Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

El objetivo general de esta técnica de resonancia magnética in vivo y protocolo de ejercicio es establecer un método robusto y estandarizado para la medición no invasiva de la capacidad de fosforilación oxidativa mitocondrial. La capacidad de fosforilación oxidativa mitocondrial del músculo esquelético se puede medir de forma no invasiva con espectroscopia de resonancia magnética de fósforo 31 in vivo. Esta técnica estandarizada facilitará el desarrollo de terapias dirigidas para mejorar la capacidad de fosforilación oxidativa.Las principales ventajas de esta técnica son que no es invasiva, lo que permite la investigación en serie, y que es bien tolerada por individuos que abarcan una amplia gama de capacidades funcionales. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la configuración del equipo y la posición del sujeto son técnicamente intensivos y de vital importancia para obtener buenos resultados. Antes de la toma de imágenes, primero obtenga el consentimiento escrito e informado del sujeto y examínelo minuciosamente para determinar la seguridad de la resonancia magnética.Luego, prepárese para el experimento. Este protocolo se demuestra utilizando un sistema Siemens Avanto 1.5 Tesla. Comience a prepararse para la obtención de imágenes conectando primero la bobina de fósforo 31 en el conector de bobina de mesa más cercano al orificio.A continuación, coloque una almohadilla de espuma triangular grande cerca del otro extremo de la mesa de examen del escáner, pero no directamente sobre la bobina. Además, coloque una almohada para la cabeza en la mesa de examen de resonancia magnética más alejada del orificio, luego indique al sujeto que se acueste en decúbito supino con los pies primero en la mesa de resonancia magnética. Coloque un cojín de espuma debajo de sus rodillas para apoyar la pierna en una posición parcialmente flexionada.Asegúrese de colocar el sujeto cerca del lado derecho de la mesa para centrar el muslo izquierdo lo más cerca posible del isocentro del imán para garantizar una homogeneidad óptima de B0. Luego, proporcione al sujeto tapones para los oídos o auriculares para protegerse los oídos. Coloque la bobina de fósforo 31 en el cuádriceps izquierdo del sujeto, aproximadamente en el punto medio entre la rótula y la cabeza femoral.Luego, asegúralo a la pierna con correas. La espiral debe estar sobre la porción lateral de la pierna, por encima del vasto lateral. Asegure un biberón de aceite para bebés a la cara medial del muslo con las mismas correas que se usan para asegurar la bobina a la pierna, luego ate las piernas del sujeto con una correa colocada debajo de la bobina y por encima de la rodilla.Asegure las piernas del sujeto a la mesa de resonancia magnética con correas adicionales, una por encima de la rodilla y otra a medio camino entre la rodilla y el tobillo. Permita que el sujeto practique el ejercicio isométrico para asegurarse de que las correas proporcionen suficiente resistencia. Luego, una vez que el sujeto se sienta cómodo, use la guía de luz láser para marcar el centro de la bobina y mueva la mesa al isocentro del imán usando el punto de referencia de centrado.Para la fase inicial de la adquisición de espectroscopia, indique al sujeto que se quede quieto y relaje los músculos de las piernas para minimizar los artefactos de movimiento. Comience por adquirir un localizador triplano para verificar el posicionamiento e identificar la ubicación de la bobina. Además, adquiera un segundo localizador, pero abra la vista de sector en el primer localizador triplano.A continuación, configure la secuencia de espectroscopía de fósforo 31 con parámetros de secuencia adquiridos por pulso no localizados como se ve aquí. Centre y gire la orientación de la rebanada haciendo clic con el botón izquierdo y manteniendo presionado el grupo de rebanadas, y haga coincidir la orientación final de las rebanadas con la posición de la botella de aceite. Ahora, coloque la caja de cuñas arrastrando el segundo localizador triplano a la ventana de visualización, luego arrastre la secuencia de espectroscopia a la ventana de protocolo y haga doble clic para abrir.Utilice la barra de herramientas de posición para visualizar el vóxel de compatibilidad que aparecerá en las imágenes del localizador. El vóxel se puede mover haciendo clic con el botón izquierdo y manteniéndolo en el centro de la caja, y su tamaño y rotación se pueden cambiar haciendo clic con el botón izquierdo y manteniéndolo en la esquina de la caja. Coloque la caja de cuñas directamente debajo de la bobina y paralela al plano de los cuádriceps para garantizar la homogeneidad del campo B0.Utilice las imágenes del localizador para identificar la región sensible de la bobina y ajuste la caja de cuñas para abarcar esta región dentro del músculo. Abra la ventana del visor de adquisición y seleccione el icono de la cabeza en la barra de herramientas para permitir la visualización de la adquisición de espectroscopia en tiempo real, luego ejecute la secuencia para obtener un solo espectro de prueba. A continuación, observe el espectro resultante y examine la calidad de la cidad B0.Busque un pico prominente de fosfocreatina centrado en cero partes por millón sin ruido significativo. Si el espectro parece ruidoso, vuelva a colocar la caja de cuñas y vuelva a adquirirla. Copie la secuencia de espectroscopia de prueba con la mejor calidad espectral y utilícela para todas las mediciones posteriores.Aumente el número de mediciones de uno a 10, luego adquiéralas mientras el sujeto está en reposo. A continuación, para la adquisición del ejercicio, aplique la configuración de la cuña del escaneo anterior y configure la secuencia para adquirir 20 mediciones. Indique al sujeto que primero permanezca en reposo durante dos mediciones, luego proporcione al sujeto una cuenta regresiva para indicar cuándo comenzar el ejercicio.En este punto, el sujeto debe iniciar la flexión de la extensión de la rodilla con la mayor fuerza y rapidez posible contra la resistencia de las correas durante aproximadamente 30 segundos. Después de observar una caída del 30% en la altura del pico de PCR, instruya al sujeto para que termine el ejercicio y descanse. Luego, adquiera 20 mediciones adicionales después del ejercicio de inmediato sin pausa ni calzas.Una vez completadas las adquisiciones, asegure la calidad del ejercicio comparando las alturas máximas de fosfocreatina al comienzo y al final del ejercicio. Este gráfico muestra la recuperación de la concentración de fosfocreatina después de su agotamiento con el ejercicio rápido de extensión de rodilla cuasiestática. La línea representa el ajuste de la función de recuperación exponencial.Un análisis de Bland-Altman del tiempo de recuperación de la fosfocreatina demuestra una diferencia de medias y una desviación estándar de 1,03 más o menos 4,83 segundos, y un coeficiente de variación entre ensayos de 4,66. Aquí se muestra una curva representativa de recuperación de fosfocreatina del examen de un sujeto no ambulatorio. Tenga en cuenta que se logró una depleción de fosfocreatina del 64% con este protocolo de ejercicio.Finalmente, esta comparación de los tiempos de recuperación de fosfocreatina demuestra una capacidad oxidativa mitocondrial secuencialmente más pobre en sujetos control, no diabéticos y diabéticos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 20 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se debe verificar que el espectro tenga suficiente señal antes del ejercicio y asegurarse de que el ejercicio resulte en una depleción de fosfocreatina de al menos el 30%Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como imágenes de cuantificación de músculo graso para calcular la masa muscular y el contenido de grasa, que también son importantes para la función general del músculo esquelético.Esta técnica se puede utilizar para investigar muchas enfermedades, incluida la ataxia de Friedreich, donde permitió a los investigadores correlacionar los marcadores genéticos de la gravedad de la enfermedad en la capacidad oxidativa mitocondrial. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una exploración de espectroscopia de resonancia magnética de fósforo 31 in vivo y un protocolo de ejercicio. No olvide que trabajar con escáneres de resonancia magnética requiere estrictas medidas de seguridad, y que todos los experimentos de resonancia magnética deben ser realizados por personal adecuadamente capacitado.

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