Name: Cultura de murinos embrionarias Metatarsianos: Un modelo fisiológico de osificación endocondral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a disecar y cultivar metatarsianos embrionarios de ratón para estudiar la osificación endocondral. Este modelo ex vivo mantiene interacciones celulares fisiológicas para investigar la mineralización ósea.

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Estamos agradecidos al Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) por financiar DH (BB/J01446X/1), CF y VEM (Financiación de la Subvención del Programa Estratégico del Instituto BB/J004316/1). También agradecemos a Arthritis Research UK por la financiación de KAS (20413). Agradecemos a la señorita Elaine Seawright por su ayuda con los experimentos detallados, al Dr. Neil Mackenzie por su asistencia con las técnicas lentivirales, y al Sr. Darren Smith y al Sr. Alex Robertson (Roslin Institute BRF) por su asistencia con los estudios con animales.

Los procedimientos que implican sujetos animales se llevaron a cabo en cumplimiento de los Animales (Procedimientos Científicos del Reino Unido) Act 1986 y los animales fueron mantenidos de acuerdo con el Ministerio del Interior publicó Código de prácticas para el alojamiento y cuidado de los animales criados, suministrados o utilizados para fines científicos. NOTA: Los experimentos llevados a cabo utilizando de tipo salvaje C57BL / 6J están bien establecidos y se describen a continuación. Metatarsianos embrionarias a partir de diferentes cepas de ratón pueden ser similarmente cultivadas in vitro, aunque sus tasas de crecimiento y la mineralización pueden ser diferentes a las que se detallan en este documento. 1. Disección Condiciones y preparación de los instrumentos <ol><li> Realizar toda la preparación de los medios de comunicación, tejidos disecciones y el trabajo de cultivo en una campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad de los medios de comunicación y los rudimentos embrionarias. </li><li> Permitir a los medios de cultivo y de disección que se equilibre durante al menos 1 hora en un 37 ° C, 5% de CO2 antes de su uso. </li><li> esterilizar la diseccióntijeras, Dumont # 5 y # 4 pinzas Dumont junto a un par de tijeras micro Vannas superfino (8 cm rectos, hojas de 3 mm) por tratamiento en autoclave. Después del autoclave, sumergir el equipo de disección en 70% de etanol antes de su uso. </li></ol> 2. Preparación de la disección y Medios de Cultivo <ol><li> Para preparar el medio de disección <ol><li> Diluir medio esencial α-mínimo (sin nucleósidos, aMEM) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (01:13) y resuspender albúmina de suero bovino (BSA) en 2 mg / m l antes de filtro esterilizante a través de una jeringa de 0,22 m, 33 mm de diámetro filtrar. NOTA: La disección medio se puede hacer, se esteriliza por filtración y se almacenó en alícuotas a -20 ° C indefinidamente. </li></ol></li><li> Preparar medio de cultivo <ol><li> Cultura metatarsianos embrionarias en 300 l de medio de cultivo (en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos). Preparar el medio de cultivo mediante la adición de 0,2% w / v BSA; 5 mg / ml de L-ASCOfosfato ácido de RBIC; 1 mM de β-glicerofosfato (βGP; opcional - ver sección de resultados); 0,05 mg / ml de gentamicina y 1,25 mg de anfotericina B a aMEM y el filtro de esterilización a través de un filtro de jeringa de diámetro 0,22 m, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. murino embrionarias metatarsiano disección y la Cultura <ol><li> Sacrificar el ratón embarazadas, la acogida embriones de 15 días de edad, por dislocación cervical, de conformidad con las directrices de Ministerio del Interior del Reino Unido </li><li> Coloque la supina animal y desinfectar la piel por pulverización con 70% de etanol. Usando tijeras de disección hacer una gran incisión en la línea media, que penetra la piel y el peritoneo para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Busque los dos cuernos uterinos del animal en la región dorsal de la cavidad corporal. Retire los cuernos uterinos al liberar en primer lugar, cada uterino desde el mesometrio por incisiones cuidadosas con tijeras de disección y, finalmente, el corte de los cuernos uterinos libre en su base. Placcuernos uterinos E en medio de disección. </li><li> Separar cada embrión mediante el corte entre los sitios de implantación a lo largo del cuerno uterino y la toma de embriones de sus sacos individuales usando unas pinzas. embriones de desecho por la decapitación de acuerdo con las directrices de Ministerio del Interior del Reino Unido </li><li> Después de la desinfección de la piel por pulverización con 70% de etanol, utilizar Vannas micro tijeras para quitar las extremidades traseras de los embriones mediante la incisión alrededor del fémur proximal. Esto garantiza tanto de la extremidad posterior como sea posible es eliminado. Colocar las extremidades traseras en una placa Petri sumergido en un medio de disección antes de la disección metatarsiano. </li><li> Bajo un microscopio de disección, empezar a quitar la piel que rodea el pie embrionario, pellizcando y tirando de él con el # 5 pinzas mientras se mantiene constante la extremidad posterior usando el # 4 pinzas. Esto se realiza más eficazmente agarrando la piel en torno al nivel de la tibia y tirando hacia las falanges. El uso de tijeras en esta etapa para cortar elNo se requiere una piel muy fina. </li><li> sujetándola con cuidado los tarsos del pie embrionaria con # 4 pinzas y quitar el primer y quinto metatarsianos pellizcando rozando los tarsos usando # 5 pinzas y desechar. </li><li> Con el pie que tuvo lugar en la misma posición, utilice el # 5 pinzas para romper el tejido conectivo entre las tres falanges y metatarsos restantes. Inserte la punta de las pinzas # 5 en la unión entre las falanges y metatarsos para eliminar las falanges de los metatarsianos. </li><li> Por último, utilice # 5 pinzas para romper el tejido conectivo entre los tarsos y metatarsos. Una vez más colocar la punta de las pinzas # 5 en el espacio de la articulación entre los tarsos y metatarsos y con cuidado libres los metatarsos de los tarsos. </li><li> recoger suavemente hacia arriba los metatarsianos ahora libres con # 4 pinzas y lugar en medio de la disección fresco. NOTA: la disección cuidadosa debe proporcionar metatarsianos 6 de cada embrión. </li><li> Cuando todos los metatarsianos requeridos han sido disecados, carefully lugar metatarsianos de forma individual en las placas de 24 pocillos que contienen pre-calentado a 300 l de medio de cultivo. Metatarsianos cultivo a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante hasta 14 días. NOTA: No cambie los medios de cultivos E15 al menos hasta el día 5 de la cultura ya que esto afecta a su capacidad de mineralización 26. Las razones de esto no están claras pero el crecimiento lineal y mineralización de la matriz pueden depender de la estimulación por factores de crecimiento liberados de los metatarsianos. </li></ol> 4. Análisis y Manipulación de los metatarsianos culturas <ol><li> En el día de la disección (día 0) efectuar mediciones longitudinales iniciales usando un microscopio con una cámara adjunta y análisis de imágenes de software digital. Medir la longitud de la zona central de la mineralización cuando aparece después de unos días de cultivo. </li><li> Periódicamente, según sea necesario, realizar más mediciones (por lo general todos los días 2º) hasta el último día de la cultura y en ese momento metatarsal huesos se procesan depende de los resultados requeridos (discutido en la introducción). </li><li> Suplemento medio de cultivos de órganos metatarsiano con varios factores exógenos, por ejemplo, factores de crecimiento, hormonas y agentes farmacológicos desde el día 0 de la cultura 22,24. En todos los estudios de este tipo, se requiere el control no tratados metatarsianos. NOTA: Si bien es aconsejable que los huesos de control son el rudimento equivalente de la pierna contralateral, no ha habido ninguna diferencia en el crecimiento lineal o potencial de mineralización de la culta E15 2 °, 3 ° y 4 metatarsianos th (véase más abajo, Figura 2) . </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La cultura de los metatarsos de embriones murinos proporciona un modelo altamente fisiológica del crecimiento endocondral y la mineralización. Los primeros estudios han validado que E15 metatarsianos ratón se someten a un patrón normal de crecimiento del esqueleto y la diferenciación. El cartílago (condrocitos) y hueso (osteoblastos y osteoclastos) y las células de sus respectivas matrices de colágeno son indistinguibles de los observados in vivo. Sin embargo, hay algunas limitaciones reconocidas de este modelo. La velocidad de diferenciación de los osteoclastos se deteriora como es el crecimiento del hueso (pero no cartílago diferenciación). El crecimiento óseo es aproximadamente 50% más lento que el observado in vivo y puede ser debido a las deficiencias en los factores sistémicos que influyen en la producción de factores locales (por ejemplo, IGF-1, BMP, etc.) 31. Además, es bien reconocido que el hueso es sensible a su entorno mecánico y esto es también el caso de los metatarsianos cultivadas, que responden a cambios en 32,33 carga mecánica. Por lo tanto, en situaciones sin carga, tal como se describe en este protocolo, la mineralización y la resorción de minerales puede verse comprometida. Sin embargo, el modelo metatarsiano ofrece la posibilidad de medir directamente el crecimiento óseo lineal que no es posible a través de 2D y 3D en los sistemas de cultivo in vitro. Hemos proporcionado una descripción completa del protocolo involucrado en la disección y la cultura de E15 metatarsianos murinos y, de hecho, por primera vez, confirmar la validez de la combinación de los 2 °, 3 ° y 4 ° metatarsianos para los experimentos. Metatarsianos de E17 / E18 se utilizan comúnmente para investigar los mecanismos de crecimiento de los huesos debido a su extraordinario potencial para crecer ex vivo durante largos períodos de tiempo (es decir, más allá de 14 días en cultivo). Ellos son un modelo bien establecido para investigar el papel de los factores de crecimiento en el crecimiento longitudinal del hueso embrionario.Además, la disección y la cultura de los metatarsianos postnatales se emplea comúnmente para delinear los mecanismos que rodean el crecimiento óseo postnatal como se entiende que el crecimiento óseo y el crecimiento óseo postnatal fetal se regulan de manera diferente 21. Sin embargo, el crecimiento de los huesos metatarsianos observado en postnatales cultivadas es significativamente menor que la observada en rudimentos embrionarias 25,34, lo que limita su potencial en estudios a largo plazo y resaltando la influencia más sistémico sobre el crecimiento óseo en esta etapa postnatal. De hecho, 3 días de edad postnatal de ratones metatarsianos son típicamente la etapa más reciente que se puede utilizar para obtener 34 crecimiento medible. Aquí describimos nuestro protocolo para el aislamiento de huesos metatarsianos embrionarias en E15. La ausencia de mineral hydroxyapaptite en huesos metatarsianos E15 significa que proporcionan un modelo sin igual a investigar no sólo los mecanismos que rodean crecimiento longitudinal del hueso, sino también el iniciode la mineralización esquelética. La matriz mineralizada de la zona de condrocitos hipertrófica terminal proporciona un andamiaje para la invasión de los osteoblastos para establecer un hueso matriz específica (osteoide), que es posteriormente mineralizada, y como tal esta mineralización inicial es de vital importancia para la formación ósea exitoso y funcional 35. De hecho, un número de informes recientes que utilizan metatarsianos E15 han confirmado su capacidad única para la investigación del proceso de mineralización 28,36,37. Además, los investigadores han descrito el uso de los metatarsianos E15 como modelo de angiogénesis 38, destacando el potencial de los metatarsianos embrionarias como modelo fuera del entorno de crecimiento óseo / mineralización. El protocolo se describe sólo requiere equipos de laboratorio estándar, incluyendo una campana de flujo laminar, un microscopio de disección para realizar la disección y una incubadora de CO 2 para el cultivo de rudimentos extirpados. Por otra parte, una calle muy básicotura que contiene medio aMEM, BSA, antibióticos, antimicóticos y ácido L-ascórbico (un cofactor en la síntesis de hidroxiprolina e hidroxilisina, dos aminoácidos esenciales para la producción de colágeno 39) evita el uso de aditivos no definidos, tales como sueros animales . Tradicionalmente, los investigadores han añadido βGP a los medios empleados para el cultivo de embriones metatarsianos, pero como se revela en nuestros resultados, no se requiere el uso de una fuente de fosfato adicional para la mineralización éxito en este sistema de cultivo. Este es un hallazgo importante en nuestra búsqueda de la comprensión de los mecanismos que sustentan la mineralización ECM. Metatarsianos previamente han sido infectados con adenovirus que contienen formas dominantes negativos de Smad2 para explorar el papel del factor de crecimiento transformante β en la regulación del desarrollo de los huesos largos 40. Aquí también revelamos la transfección exitosa de tipo salvaje huesos metatarsianos E15 con partículas de virus GFP, lo que indica ttécnicas de sombrero de lentivirus podían fácilmente ser adaptada para manipular la expresión génica en las culturas de los metatarsianos. Del mismo modo, el sistema de cultivo de órganos metatarsiano es un excelente modelo en el que comparar el crecimiento de los huesos de ratones genéticamente alterados para entender mejor el papel de un gen particular en el proceso de crecimiento del hueso. Nuestros estudios previos han utilizado el sistema de cultivo de órganos metatarsiano para determinar el papel de supresor de la señalización de citoquinas-2 (Socs2) en el crecimiento de hueso endocondral. El uso de los huesos metatarsianos de los ratones deficientes en Socs2, hemos demostrado que la hormona de crecimiento es capaz de simular su longitudinal crecimiento independiente de la insulina como factor de crecimiento (IGF-1), a diferencia de los huesos metatarsianos de tipo salvaje que no responden al crecimiento tratamiento hormonal 34, 41. Esto pone de relieve la medida en que los cultivos de los metatarsianos pueden ser manipulados para examinar los efectos de diferentes genes y / o factores exógenos en el crecimiento de hueso endocondral. En resumen, tenemos detaiconducido un método para la extracción exitosa y la cultura de huesos metatarsianos embrionarias que se pueden manipular y se examinaron usando una variedad de análisis. Este modelo ex vivo mantiene célula-célula y las interacciones célula-matriz, así como contiene condrocitos en diferentes fases de la condrogénesis, por lo tanto, proporcionar un modelo más fisiológica de células en monocapa o un cultivo 3D. cultivos de órganos metatarsianos son, por tanto, un modelo único para la investigación de los mecanismos moleculares responsables de la osificación endocondral, y son esenciales para mejorar nuestra comprensión de la fisiología y la fisiopatología ósea

El esqueleto es un órgano muy complejo, dinámico y complejo que tiene una serie de funciones que van desde la locomoción, a la homeostasis de iones. Compuesto de hueso y cartílago, el esqueleto consta de las poblaciones de células funcionalmente distintas que funcionan para mantener su integridad estructural, bioquímica y mecánica 1. Una de las funciones primarias del esqueleto es su papel en el desarrollo y el crecimiento. Estos procesos requieren la orquestación de múltiples poblaciones celulares que son reguladas a través endocrina apretado y control genético. Con la excepción de los huesos planos por ejemplo, escápula, cráneo y el esternón, el esqueleto de los mamíferos se forma a través del proceso conocido como osificación endocondral. Este proceso, regulado tanto molecularmente y espacialmente, comienza con la condensación de células mesenquimáticas derivadas principalmente del mesodermo 2. Bajo la influencia del factor de transcripción SOX9, las células en THe interior de las condensaciones se diferencian en condrocitos, expresar y secretar componentes específicos de cartílago de la matriz extracelular (ECM) tales como colágeno de tipo II y agrecano. Las células en el margen de la condensación, expresan colágeno tipo I y la forma del pericondrio, delineando el hueso prospectivo 3. Más tarde, los osteoprogenitors del pericondrio se diferencian en osteoblastos, dirigida por la expresión de los factores de transcripción, y Runx2 osterix 4. Esto conduce a un predominio de los osteoblastos y esta capa se cambia el nombre del periostio que forma un collar óseo mineralizado alrededor de la mitad de la sección del hueso. Penetración vascular del periostio y la invasión del andamio cartilaginosa se produce trayendo consigo, haematopoetically derivado células óseas resorción, osteoclastos, que reabsorben los restos de condrocitos y gran parte de la matriz cartilaginosa 5. Los espacios formados son ocupados por osteoprogenitors que dan lugar a la osificación primariacentro que ocupa progresivamente el núcleo de la diáfisis y se fusiona con el periostio. Otras células dan lugar a la médula ósea. Alrededor del nacimiento, los vasos sanguíneos y osteoprogenitors penetran en la matriz rica en cartílago en cada lado (epífisis) de la diáfisis en desarrollo para formar el centro de osificación secundario. Situado entre la epífisis y la diáfisis en los extremos de los huesos largos es una banda de cartílago - la placa de crecimiento epifisaria - que es la responsable de coordinar el crecimiento lineal de todos los huesos largos 6. Los condrocitos en el cartílago de crecimiento inicialmente proliferan y posteriormente progresan a través de zonas morfológicamente distintas, coordinados por la expresión secuencial de transcripción y factores de crecimiento. La culminación de esta secuencia de eventos es la salida del ciclo celular y la hipertrofia de los condrocitos en el centro de este precursor cartílago. condrocitos hipertróficos expresan fuertemente colágeno tipo X y metaloproteinasas de la matriz-13 (MMP13) y su considerable volumen de la ampliación en la dirección del crecimiento longitudinal proporciona la mayor contribución al crecimiento óseo en mamíferos 7,8. Además, los condrocitos hipertróficos mineralizan su ECM circundante a través de la liberación de vesículas de matriz, estructuras de membrana delimitada especializados para la producción de fosfato de calcio amorfo a través de su inclusión de fosfatasas (tejido no específica de la fosfatasa alcalina (TNAP) y PHOSPHO1) y calcio canalización de proteínas (anexinas ) 9-11. Este cartílago calcificado es invadido por vasos sanguíneos de la médula ósea subyacente que resulta en el reclutamiento de los osteoclastos y la resorción de la matriz. Esto es seguido por la migración de osteoblastos y la alineación a la superficie de los restos de cartílago calcificadas en la que establecen una capa de osteoide, que es rápidamente mineralizado. El hueso reticular de la sustancia esponjosa primaria es posteriormente remodelado para hueso laminar de la esponjosa secundaria 12. resultados de fusión epifisarias en elcese de la osificación endocondral 13. Osificación endocondral está bajo una regulación estricta por muchas hormonas endocrinas y paracrinas y factores de crecimiento con el fin de prevenir el desarrollo perturbado y / o el crecimiento del hueso longitudinal 14. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y celulares que sustentan estos procesos tanto, es imperativo en nuestra búsqueda de avances clínicos hacia el beneficio humano. Las investigaciones previas sobre las similitudes y diferencias entre las placas de crecimiento de diferentes edades, lugares y especies han mejorado en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos fisiológicos que rodean la dinámica de la placa de crecimiento 15,16. Sin embargo, el estudio de los condrocitos aislados es difícil, ya que la eliminación de los condrocitos de su medio ambiente puede conducir a la desdiferenciación, acompañado de pérdida de la expresión de marcadores clave como Col2a1 17. El metatarsiano ratón cultivo de explantes de órganos, pioneered por el Prof. Elisabeth hamburguesa y sus colegas en los Países Bajos, es un modelo muy fisiológica ex vivo para el estudio de la osificación endocondral y el crecimiento óseo como la tasa de crecimiento de los huesos en la cultura imitan a la observada in vivo 18. Excepcionalmente, el cultivo de órganos metatarsiano permite el examen de los condrocitos en diferentes fases de la condrogénesis y mantiene célula-célula y las interacciones célula-matriz, por lo tanto, proporcionar condiciones más cerca de la situación in vivo que las células en cultivo de 19-21. Además, este modelo permite el examen directo del crecimiento óseo lineal que no es posible en cultivos de condrocitos primarios. También permite la separación de los factores sistémicos y locales, por tanto, que permiten el análisis específico de los efectos locales en la placa de crecimiento. La cultura de los metatarsianos permite la investigación de numerosos parámetros. Las mediciones diarias de longitud total y de las regiones mineralizadas delos rudimentos se pueden realizar con microscopía de contraste de fase estándar y software de análisis de imágenes. Histológico, hibridación in situ y tinción inmunohistoquímico se puede realizar fácilmente en las secciones de los metatarsianos, lo que permite la resolución espacial de las dos entidades moleculares y celulares, una importante ventaja sobre los métodos tradicionales de cultivo de células. El enfoque inmunohistoquímica incluye la detección y cuantificación de 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina captación (BrdU) por la proliferación de condrocitos 22. Además, el tratamiento posterior de los tejidos de los metatarsianos se puede realizar para permitir el análisis aguas abajo de la expresión de ARNm (RT-qPCR), proteína y análisis intracelular de señalización (transferencia Western) o la composición de lípidos (espectrometría de masas). La mayoría de los estudios hasta la fecha utilizan metatarsianos embrionarias cultivadas en lugar de los metatarsos de animales después de nacer. Mientras que ambos modelos pueden ser de carácter informativo, el estudio de los huesos embrionarios tiene varias ventajas: crecen más rápido y puede ser ExploITED para estudiar el inicio y la progresión de la 23 a 25 proceso de mineralización. Este protocolo describe en detalle la intrincada disección de metatarsianos embrionarias a partir de la extremidad posterior de día embrionario 15 (E15) embriones murinos. Además, se muestra el crecimiento y la mineralización de los huesos metatarsianos anatómicamente distintos.

<table><tbody><tr><td>Tijeras de disección</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #4</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoclave esterilizar antes</td></tr><tr><td>de usar Tijeras SuperFine Vannas</td> World <td>Precision Instruments</td><td></td><td></td>501778</tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Diluido al 70% v/v en dH2</td></tr><tr><td>O&alpha;-MEM sin nucleósidos</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>22561021</tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa (0,22 &mu; m) 33 mm de diámetro</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de fosfocolina sal de calcio tetrahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Añadir directamente al medio antes de la experimentación</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico-2-fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Suministro de caldo a 5 mg/ml y alícuota a -20 & grados. C</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td> Almacenamiento <td>de material a 150 mM y alícuota a -20 °C; C</td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sódico sal hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Stock de maquillaje a 1mM y alícuota a -20 &deg; C</td></tr><tr><td></td><td>Gentamicina Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710049</tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15290018</tr><tr><td>Placas de 24 pocillos tratadas con cultivo celular Nunc</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de murinos embrionarias metatarsianos: un modelo fisiológico de osificación endocondral

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

El proceso fundamental de osificación endocondral está bajo una estricta regulación en el individuo sano para prevenir el desarrollo perturbado y/o el crecimiento óseo longitudinal. Como tal, es imperativo que profundicemos nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes involucrados en tales trastornos para proporcionar avances en beneficio del paciente humano y animal. El cultivo de explantes de órganos metatarsianos de ratón es un modelo ex vivo altamente fisiológico para estudiar la osificación endocondral y el crecimiento óseo, ya que la tasa de crecimiento de los huesos en cultivo imita la observada in vivo. De manera única, el cultivo de órganos metatarsianos permite el examen de condrocitos en diferentes fases de la condrogénesis y mantiene las interacciones célula-célula y célula-matriz, por lo que proporciona condiciones más cercanas a la situación in vivo que las células en cultivo monocapa o 3D. Este protocolo describe en detalle la intrincada disección de los metatarsianos embrionarios de la extremidad posterior de embriones murinos E15 y los análisis posteriores que se pueden realizar para examinar la osificación endocondral y el crecimiento óseo longitudinal.

El objetivo de este método fue aislar metatarsianos y cultura los embriones para el examen de crecimiento longitudinal del hueso y mineralización ECM. Utilizando el protocolo descrito en el presente documento, huesos metatarsianos embrionarias se diseccionaron con éxito, como se visualizó por microscopía de luz. Las mediciones de huesos metatarsianos, llevados a cabo como se indica en la figura 1, mostraron su capacidad de crecer en la longitud longitudinal y mineralizar su ECM (Figuras 2 y 3). La mineralización de la matriz se observó por primera vez en la media de la diáfisis del hueso y el rudimento es fácil de observar con el microscopio óptico. No se requiere tinción aunque la absorción de calceína puede ofrecer una visualización mejorada del mineral recién formado. Los estudios que utilizan metatarsianos embrionarias hasta la fecha 22,27,28 han puesto en común la diseccionado 2º, 3º y 4º (CENtral tres metatarsianos), asumiendo que el crecimiento in vitro y la mineralización sean comparables. In vivo del desarrollo de los metatarsianos murinos, sin embargo, revela que los dígitos 3 ° y 4 ° tienen indicios de mineralización antes de todos los otros metatarsianos y falanges 29. Evaluación del potencial de crecimiento y la mineralización de forma individual aislaron y cultivaron E15 2º, 3º y 4º metatarsianos no reveló diferencias significativas en la aparición o la extensión de la mineralización después de 7 días de cultivo (Figura 2). No hay diferencia en el porcentaje de incremento respecto al valor basal fue encontrado durante el período de cultivo. Como se observó ninguna diferencia en el potencial de mineralización del protocolo estándar del agrupamiento de los metatarsianos 2º 3 ° y 4 ° parece válida para futuros estudios. Tradicionalmente, los investigadores han añadido a los medios βGPempleados para el cultivo metatarsianos embrionarias para promover la mineralización ECM. Sin embargo, en estudios de cultivo celular, se ha demostrado que si se añade enzima TNAP a los medios que contienen osteogénicas βGP, ectópico deposición mineral hidroxiapatita todavía se produce incluso en ausencia de células 30. Para examinar los efectos de diversos sustratos de mineralización y agonistas sobre la capacidad de mineralización metatarsiano, cultivamos metatarsianos E15 en medios de cultivo que contiene una serie de suplementos, y las imágenes y las mediciones de longitud se registraron diariamente. Los resultados indicaron que E15 huesos metatarsianos todavía crecen y mineralizan su ECM en ausencia de βGP. E15 huesos metatarsianos cultivadas en ácido ascórbico único medio de comunicación mostraron aumentos comparables en la longitud y la mineralización como metatarsianos cultivaron en presencia de βGP (Figura 3). También hemos demostrado que los lentivirus se puede usar para transfectar ADN exógeno en metata cultivaronrsals. Aquí transfectadas con éxito huesos metatarsianos en día 0 de cultivo (es decir, día de la disección) con 2 x 10 6 partículas de virus proteína fluorescente verde (GFP) por metatarsiano. Para activar la transducción de virus, se añadió polibreno simultáneamente a los cultivos a 1: 500. Los cultivos se dejaron durante 7 días, sin cambios de medio como se requiere para E15 mineralización metatarsiano que ocurra, antes de ser incubadas con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) mancha durante 5 min y después se visualizaron directamente usando un microscopio confocal ( la Figura 4). Nuestra prueba de concepto experimentos muestran claramente la transducción eficaz. Sin embargo, sería prudente examinar secciones a lo largo de la totalidad del hueso metatarsiano para evaluar su manipulación genética transfección y eficaz. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figura 1: Metodología estándar utilizado para medir tLongitud él y Zona de mineralización embrionarias metatarsianos. (A) medidas totales de longitud de los metatarsianos E15 en el día 0 de la cultura (día de la disección) a través del centro del metatarsiano. (B) Las mediciones de la longitud longitudinal total de un metatarso después de siete días de cultivo. Tenga en cuenta la ligera curvatura en el metatarsiano. (C) La medición de la longitud de la zona de mineralización después de siete días de cultivo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figura 2: Crecimiento y mineralización de la capacidad de anatómicamente distintos E15 Metatarsianos de imágenes y medición de la 2ª, 3ª y 4ª metatarsos de la extremidad posterior de ratones E15 w.como se realizó. (A) Imágenes seriadas de la 2ª, 3ª y 4ª metatarsianos durante todo el período de cultivo. (B) Porcentaje de aumento en la longitud desde el día 0 en cada día de cultivo. (C) Longitud de Mineral de la segunda, tercera y 4º metatarsianos sobre el período de cultivo, expresado como porcentaje de la longitud total metatarsiano. Los datos de se representan como media ± error estándar de la media (SEM), (n = 6). (D) C57BL / 6J longitudes de los metatarsianos en cada día de cultivo. Los datos de se representan como media ± desviación estándar (n = 6). Barra de negro = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figura 3: Crecimiento y mineralización Capacidad de tipo silvestreE15 Metatarsianos cultivadas en diferentes medios osteogénico. (A) Imágenes seriadas de los metatarsianos cultivadas en ácido ascórbico solamente, 1 mM βGP, fosfocolina 3 mM, cloruro de calcio 1,5 mM o cloruro de calcio 3 mM que contenía medios de comunicación. (B) Porcentaje de aumento en la longitud desde el día 0 de metatarsianos cultivó con los diversos suplementos. (C) Longitud de Mineral de metatarsianos cultivadas en diversos medios de comunicación, expresado como porcentaje de la longitud total metatarsiano. Los datos se representan como media ± error estándar de la media (SEM), (n = 6). Barra de negro = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figura 4: La transfección de E15 Metatarsianos con el Virus de GFP Partículos. huesos metatarsianos (A) E15 fueron transfectadas con GFP partículas de virus de prueba de concepto. (B) Los huesos fueron teñidas con DAPI para la visualización del ADN. (C) Las imágenes duales indican la transfección exitosa de virus GFP largo de la totalidad de los huesos metatarsianos. Las barras blancas = 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un protocolo para diseccionar y cultivar huesos metatarsianos murinos embrionarios de día 15 (E15). Este modelo ex vivo altamente fisiológico de osificación endocondral proporciona condiciones más cercanas a la situación in vivo que las células en cultivo monocapa o 3D y es una herramienta vital para investigar el crecimiento y desarrollo óseo.

Cultura de murinos embrionarias Metatarsianos: Un modelo fisiológico de osificación endocondral

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y cultivar metatarsianos de ratones embrionarios para proporcionar un modelo ex vivo que permita el estudio del crecimiento óseo endocondral y de la mineralización. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la osificación endocondral, el proceso mediante el cual crecen los huesos largos. En particular, es especialmente adecuado para investigar los mecanismos de inicio de la mineralización esquelética.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona, mediante el mantenimiento de las interacciones célula a célula y célula a matriz, un modelo más fisiológico de osificación endocondral en comparación con células en cultivo 2D o 3D. Para comenzar, prepare el medio de disección diluyendo el medio mínimo esencial alfa uno a 13 en PBS. A continuación, re-suspenda la albúmina sérica bovina (BSA) a dos miligramos por mililitro y luego esterilice por filtración mediante un filtro de jeringa.Luego, prepare el medio de cultivo y esterilice por filtración utilizando el mismo tipo de filtro de jeringa usado para la BSA. Después de filtrar el medio de cultivo, cargue 300 microlitros del medio en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos. A continuación, coloque la placa de cultivo celular de 24 pocillos y el medio de disección en un incubador durante al menos una hora para su equilibrio.Luego, sumerja el equipo de disección esterilizado en autoclave en etanol al 70 %. Obtenga embriones C57 black 6J de tipo silvestre E15 según se describe en el protocolo de texto adjunto y colóquelos en una placa de Petri que contenga medio de disección. Tras la decapitación, lave la piel con etanol al 70 % y use tijeras microquirúrgicas de Vannas para retirar las extremidades traseras de los embriones realizando incisiones alrededor del fémur proximal.Esto asegura que se retire la mayor parte posible de la extremidad trasera. Coloque las extremidades traseras en una placa de Petri y sumérjalas en medio de disección antes de la disección de los metatarsianos. Luego, colóquelas bajo un microscopio estereoscópico.Utilice una pinza número cuatro para sostener la extremidad firmemente mientras usa una pinza número cinco para retirar la piel que rodea el pie embrionario. Esto se realiza de manera más efectiva agarrando la piel aproximadamente a la altura de la tibia y tirando hacia las falanges. A continuación, use la pinza número cuatro para sostener cuidadosamente los huesos tarsianos del pie embrionario mientras utiliza la pinza número cinco para retirar y descartar los metatarsianos primero y quinto.Sosteniendo el pie en la misma posición, utilice la pinza número cinco para separar los tejidos conectivos entre las tres falanges restantes y los metatarsianos. A continuación, inserte la punta de la pinza número cinco en la articulación entre las falanges y los metatarsianos para separar las falanges de los metatarsianos. Finalmente, use la pinza número cinco para separar los tejidos conectivos entre los tarso y los metatarsianos.Nuevamente, coloque la punta de la pinza número cinco en el espacio articular entre los tarso y los metatarso y separe suavemente los metatarso de los tarso. Luego, tome suavemente los metatarso ya liberados con la pinza número cuatro y colóquelos en medio de disección fresco. Es fundamental que los metatarso embrionarios no sufran daños ni se sequen durante los pasos de disección y manipulación.El daño a los metatarsianos afecta su crecimiento y mineralización. Cualquier tejido blando restante se desprenderá de los metatarsianos durante el cultivo, por lo que no debe preocuparse excesivamente por su eliminación completa durante la disección. Una vez que se hayan diseccionado todos los metatarsianos necesarios, coloque cuidadosamente cada metatarsiano individualmente en la placa de 24 pocillos previamente calentada que contiene 300 microlitros de medio de cultivo.A continuación, realice mediciones longitudinales iniciales utilizando un microscopio con una cámara digital acoplada y software de análisis de imágenes. Cultive los metatarsianos hasta por 14 días. Sin embargo, no cambie el medio de los cultivos E15 hasta al menos el día cinco de cultivo, ya que esto afecta su capacidad de mineralización.Después de unos días en cultivo, mida la longitud de la zona de mineralización central cuando aparezca. Después de unos días en cultivo, la mineralización de la matriz ocurre en la diáfisis media del rudimento óseo y se observa fácilmente mediante microscopía de luz. A menudo, los metatarsianos segundo, tercero y cuarto se agrupan para estudios embrionarios.En siete días de cultivo, los metatarsianos segundo, tercero y cuarto no mostraron diferencias significativas en la apariencia ni en la extensión de la mineralización, lo que valida esta práctica. Para examinar los efectos de diversos sustratos y agonistas de mineralización sobre la capacidad de mineralización de los metatarsianos, se cultivaron metatarsianos E15 en medios que contenían una variedad de suplementos como se muestra aquí. Las imágenes y las mediciones de longitud se registraron diariamente.De todos los sustratos probados, el ácido ascórbico aumentó la longitud del mineral en mayor medida y de forma más comparable a los efectos del beta-glicerofosfato. La transfección con lentivirus del plásmido GFP en metatarsianos E15 resultó en la expresión de GFP en todo el metatarsiano. Esto destaca el uso del lentivirus para transfectar con éxito metatarsianos embrionarios.Esta técnica también puede utilizarse para reducir o sobreexpresar genes diana. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los metatarsianos E15 son extremadamente frágiles. La integridad del metatarsiano es fundamental para el éxito del cultivo posterior.Tras la disección y el cultivo de metatarsianos de E15, se pueden realizar muchos análisis posteriores. Por ejemplo, la expresión de ARNm y de proteínas puede evaluarse mediante RTQPCR e inmunotransferencia, respectivamente. Además, la inmunohistoquímica puede utilizarse para localizar proteínas dentro del metatarsiano.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar con éxito los metatarsianos de las extremidades posteriores de ratones de día embrionario 15. Este método puede adaptarse a metatarsianos de día embrionario 17 o 18, que son más útiles para el estudio del crecimiento óseo.

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los modelos animales se emplean con frecuencia para imitar lesiones óseas graves en la investigación biomédica. Debido a su pequeño tamaño, el establecimiento de lesiones óseas estabilizadas en ratones está más allá de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación. En este trabajo, describimos un método simple para establecer y analizar defectos femorales experimentales en ratones.

A-crítico tamaño femoral Defecto sencillo modelo en ratones

Este protocolo describe una técnica de osteosíntesis mínimamente invasiva utilizando un tornillo intramedular para estandardizado estabilización de fracturas de fémur, que puede utilizarse para analizar el hueso endocondral en ratones.

Un modelo mínimamente invasivo para analizar la fractura endocondral en ratones en condiciones biomecánicas estandarizadas

Aquí, presentamos un organotypic cultivo protocolo para crecer órganos embrionarios de pollo en vitro. Usando este método, el desarrollo de tejidos de embrión de pollo puede ser estudiado, manteniendo un alto grado de control sobre el ambiente de cultivo.

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

El modelo murino fractura cerrada de fémur es una poderosa plataforma para el estudio de fracturas y nuevas estrategias terapéuticas para acelerar la regeneración ósea. El objetivo de este protocolo quirúrgico es generar fracturas femorales cerradas unilaterales en ratones con una varilla intramedular de acero para estabilizar el fémur.

La generación de fracturas femorales cerradas en ratones: un modelo para el estudio del hueso curativo

Aquí, presentamos un método para la cultura ex vivo de huesos largos de murino en las etapas del feto y del recién nacido, adecuado para analizar el desarrollo de hueso y cartílago y la la homeostasis en condiciones controladas, mientras que recapitular el proceso in vivo.

Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal de ratón adulto para investigar la formación de blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa, analizada por inmunohistoquímica fluorescente y tomografía microcomputada secuencial in vivo.

Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa

Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para el establecimiento de una fractura diafisaria en el fémur de ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular, para estudios de cicatrización de fracturas.

Establecimiento de un modelo de fractura de fémur diafisario en ratones

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Este protocolo describe un modelo de ratón mejorado para las lesiones de la placa de crecimiento óseo en adolescentes. Utilizando ratones transgénicos con reporteros fluorescentes de tres linajes para los tipos de colágeno I, II y X, las matrices primarias asociadas con tres sustratos diferentes de la placa de crecimiento, la ubicación de la lesión es guiada por fluorescencia nativa bajo el microscopio.

Modelo murino transgénico tricolor para el estudio de la lesión del cartílago de crecimiento

El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

Aprenda a disecar y cultivar metatarsianos embrionarios de ratón para estudiar la osificación endocondral. Este modelo ex vivo mantiene interacciones celulares fisiológicas para investigar la mineralización ósea.

Cultura de murinos embrionarias Metatarsianos: Un modelo fisiológico de osificación endocondral

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