Name: -Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a medir el consumo de oxígeno mitocondrial mediante respirometría de alta resolución en células intactas y permeabilizadas. Esta técnica permite evaluar la función mitocondrial con alta sensibilidad.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Subvención nº 32003B_127619).

1. Cultura de la célula <ol><li> Células de cultivo humano hepatoma HepG2 6 en 25 cm 2 frascos de cultivo de células en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una incubadora (5% CO 2, 95% de aire) (densidad de siembra: 1 x 10 6 células por 25 cm 2 frasco de cultivo celular, tiempo de incubación en la incubadora a 37 ° C: 48 h, la densidad de células en confluencia: 4-5 x 10 6 células por 25 cm matraz de cultivo de 2 células). </li><li> Realizar los experimentos cuando las células son 90% a 95% de confluencia. </li></ol> 2. alta resolución Respirometría calibración de sensores de oxígeno polarográficos <ol><li> Pipetear 2,1 ml de tampón de respiración en una cámara de oxygraph y se agita la memoria intermedia continuamente utilizando una barra de agitación magnética presente en la cámara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h hasta que una señal de flujo de oxígeno estable dese obtiene el sensor de oxígeno polarográfico. NOTA: electrodos de oxígeno polarográficos dentro de cada concentración de oxígeno medida cámara de oxygraph y calcular el consumo de oxígeno (flujo) dentro de cada cámara. La concentración de oxígeno y las tasas de consumo de oxígeno (flujo) se visualizan en tiempo real en línea en un ordenador utilizando el software de adquisición y análisis de datos. </li><li> Realizar una calibración de aire del sensor de oxígeno polarográfico de acuerdo con protocolos 14 del fabricante. NOTA: La calibración de los sensores de oxígeno polarográficas en los medios de comunicación la respiración y la concentración de oxígeno en los medios de comunicación en la saturación del aire de temperatura experimental se realiza sólo una vez al día por la mañana. Después, los medios de comunicación pueden ser removidos de las cámaras y las células se volvieron a suspender en un medio de la respiración fresca se añaden a una cámara oxygraph y se miden las velocidades de respiración. Después de que el primer experimento, la cámara se puede lavar y la serie adicional de experimentos se puede realizar en tél mismo la cámara sin más calibraciones. </li></ol> 3. La tripsinización de células adherentes, células Counting <ol><li> En el día del experimento, aspirar el DMEM a partir de la 25 cm matraz de cultivo de 2 células. </li><li> Enjuagar la monocapa de cultivo celular en el matraz de cultivo con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Pipetear 0,5 ml de 25 mg / ml de solución de tripsina (precalentado a 37 ° C en un baño de agua a 37 ° C) en la monocapa de células en el matraz de cultivo e incubar durante 5 min a 37 ° C en una incubadora (5% de CO 2 , 95% de aire). </li><li> Pipeta 5 ml de DMEM que contenía FBS al 10% en las células desprendidas en el frasco de cultivo celular y suspender las células mediante pipeteo. </li><li> Transferencia de células a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar resuspendió durante 5 min a 350 xg a temperatura ambiente y se decanta el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de tampón de respiración 13 (T capaces 1). </li><l<html> i&gt; Contar las células usando un contador de células y volver a suspender en el tampón de respiración a una densidad final de 1 x 10 6 células / ml. Dado que las tasas de respiración celular se normalizaron al número de células, contar las células con un contador de células exacta y precisa. </li></ol> 4. alta resolución Respirometría <ol><li> Después de la calibración de aire (realizado solamente una vez al día, los pasos 2.1 a 2.2), aspirar el medio de la respiración de una cámara del oxygraph y añadir 2,1 ml de suspensión de células (1 x 10 6 células / ml) de la etapa 3.7 a la cámara. </li><li> Cierre de la cámara de oxygraph mediante la inserción del tapón. </li><li> Agitar las células continuamente utilizando una barra de agitación magnética presente en la cámara (700 rpm) a 37 ° C y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable. NOTA: La concentración de oxígeno y la señal de flujo de oxígeno se visualizan en tiempo real en línea en un ordenador utilizando el software de adquisición y análisis de datoss = &quot;xref&quot;&gt; 14. </li><li> Después, inyectar sustratos e inhibidores de la respiración mitocondrial a través de los puertos de inyección de titanio de los tapones usando los siguientes protocolos. </li></ol> 5. La digitonina titulación en células intactas por respirometría <ol><li> Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 6 / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo. </li><li> Inyectar 2 l de rotenona mM 0,2 (0,2 M) &#39;PRECAUCIÓN&#39; en la cámara de oxygraph que contiene la suspensión celular a través de la abertura de inyección de titanio del tapón cámara usando una jeringa y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable . NOTA: Todas las inyecciones en los siguientes pasos se realizan a través de los puertos de inyección de titanio de tapones utilizando jeringas. Además de la rotenona es opcional (se evita el flujo inverso de electrones) y puede ser omitida para experimentos de titulación digitonina, verel paso 6.3. </li><li> Inyectar 20 l de succinato 1 M (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Inyectar 10 l de 0,5 M de ADP (2,5 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Inyectar 2 l de digitonina 2 mM (2 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular de 2-5 min hasta que se alcanza una señal de oxígeno estable. </li><li> Una vez más inyectar 2 l de 2 mM de digitonina en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular de 2-5 minutos hasta que se logre una señal estable de oxígeno. NOTA: adición gradual de digitonina a las células inducirá un aumento del consumo de oxígeno celular y la señal de flujo de oxígeno se incrementará. </li><li> Continuar inyectando 2-4 l de 2 mM paso a paso digitonina (2-4 mM cada paso) en la cámara. Después de cada paso, grabar la respiración celular de 2-5 mhasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable. NOTA: Detener la inyección de digitonina cuando la señal de flujo de oxígeno alcanza un nivel máximo y más inyecciones de digitonina no aumentan la tasa de respiración. Los lectores deben determinar la concentración óptima de digitonina en sus laboratorios utilizando sus propios reactivos y uso obtenido concentración óptima de digitonina en los pasos 6.2 y 7.2 de los siguientes protocolos para sus experimentos. </li></ol> 6. Evaluación de la membrana mitocondrial externa Integridad: citocromo C <ol><li> Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 6 / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo. </li><li> Inyectar 2 l de digitonina 8 mM (8 M) en la cámara de oxygraph que contiene la suspensión de células (1 x 10 6 / ml) y permeabilizar las células durante 5 min. </li><li> Inyectar 20 l de succinato 1 M (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar respirat celularion durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Inyectar 10 l de 0,5 M de ADP (2,5 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. NOTA: La adición de ADP a las células estimulará complejo I e inducir un aumento en el consumo de oxígeno, y la señal de flujo de oxígeno se incrementará y estabilizar. </li><li> Inyectar 5 l de 4 mM citocromo c (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Finalmente inyectar 1 l de 4 mg / ml oligomicina (2 mg / ml) y registrar la respiración celular hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable. </li></ol> 7. estimulada por ADP máxima Respiración (estado 3) de células permeabilizadas HepG2 <ol><li> Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 6 / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo.</li><li> Inyectar 2 l de digitonina 8 mM (8 M) en la cámara de oxygraph que contiene la suspensión celular y permeabilizar las células durante 5 min. </li><li> Inyectar 12,5 l de 0,8 M de malato (5 mM) y 10 l de 2 M de glutamato (10 mM) en la cámara de oxygraph. se consigue la respiración celular Record hasta que una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Inyectar 10 l de 0,5 M ADP (2,5 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que el oxígeno aumenta la señal de flujo y estabiliza. NOTA: La adición de ADP a las células induce un aumento en el consumo de oxígeno y la señal de flujo de oxígeno se incrementará. </li><li> Inyectar 2 l de rotenona 0,2 mM (0,2 M) &quot;Atención&quot; en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular hasta que la señal disminuye el flujo de oxígeno y se estabiliza. </li><li> Posteriormente, se inyectan 20 l de 1 M de succinato (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que se incrementa la señal de flujo de oxígenoy estabiliza. </li><li> A continuación, se inyectan 2 l de 5 mM antimicina (5 M) &quot;Atención&quot; en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular hasta que la señal disminuye el flujo de oxígeno y se estabiliza. </li><li> Entonces inyectar 2,5 l de ascorbato 0,8 mM (1 mM) e inmediatamente después de inyectar 2,5 l de TMPD 0,2 mM (0,25 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que el oxígeno aumenta la señal de flujo y estabiliza. </li><li> Finalmente inyectar 10 l de azida de sodio 1 M (5 mM) &#39;PRECAUCIÓN&#39; en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que la señal disminuye el flujo de oxígeno y se estabiliza. </li></ol> 8. Consumo de oxígeno de las células intactas <ol><li> Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 6 / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo. </li><li> Se inyecta 1 l de 4 mg / ml oligomicina (2 mg / ml) en la cámara de oxygraph que contiene una suspensión de célulasse logra d registro respiración celular hasta que una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Posteriormente inyecte 1 l de 0,2 mM de FCCP (0,1 M) &quot;Atención&quot; en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular hasta que las señales de flujo de oxígeno aumenta y se estabiliza. </li><li> Inyectar 3 l de 0,2 mM de FCCP (0,4 M) a la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que se incrementa la señal de flujo de oxígeno más y se estabiliza. </li><li> Valorar FCCP en 0,1 a 0,3 M pasos mediante la inyección de 1 a 3 l de 0,2 a FCCP 1 mM (0,1 a 2 M de concentración final en la cámara) en la cámara de oxygraph hasta que la señal de flujo de oxígeno alcanza sus niveles máximos y no hay nuevos aumentos y luego comienza a disminuir. NOTA: Deje de inyectar FCCP cuando la señal de oxígeno alcanza un nivel máximo y comienza a disminuir. </li><li> A continuación, inyectar 2 l de rotenona 0,2 mM (0,2 mM) y 2 l de 5 mM antimicina A (5 M) en la cámara. la respiración registro hasta tél de la señal de flujo de oxígeno disminuye y se estabiliza. </li></ol>

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<li>Nicholls, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binding+to+enzymes+and+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binding to enzymes and membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).</li>
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<li>Gorbenko, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+cytochrome+c+complexes+with+phospholipids+as+revealed+by+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer.</a> Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).</li>
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<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo del presente protocolo fue utilizar respirometría de alta resolución para medir los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial &#39;(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima y la integridad de la membrana mitocondrial externa. Hay algunos pasos críticos dentro del presente protocolo. En primer lugar, las tasas de consumo de oxígeno celular por lo general se normalizaron al número de células (pmol / [seg x núm...

Las mitocondrias desempeñan funciones importantes en el metabolismo de la energía celular, especialmente mediante el uso de oxígeno para producir el trifosfato de adenosina (ATP). Ellos están implicados en la muerte celular y en varias enfermedades humanas. fosforilación oxidativa mitocondrial (fosforilación oxidativa) combina el transporte de electrones a lo largo de la cadena de transporte de electrones con el consumo de oxígeno y la síntesis de ATP. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos mitocondrial (TCA) está implicada en la conversión de proteínas, carbohidratos y grasas en compuestos ricos en energía como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y dinucleótido de flavina adenina (FADH 2). Los electrones del NADH y FADH 2 se transfirieron a continuación a los complejos de proteínas de la cadena de transporte de electrones respiratorios (I a IV) localizado en la membrana mitocondrial interna. Además, otros dos vías redox pueden transferir electrones a la cadena de transporte de electrones: i) mitocondrial de electrones de transferencia de flavoproteínas (ETF) que se encuentra en la cara de la matriz interior mitomembrana mitocon-, y materiales de electrones de β-oxidación de ácidos grasos; y ii) mitocondrial glicerofosfato deshidrogenasa que oxida glicerofosfato a dihidroxiacetona fosfato y se alimenta electrones a la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Complejo IV (el último aceptor de electrones) transfiere los electrones a una molécula de oxígeno, la conversión de oxígeno a dos moléculas de agua. En movimiento de los electrones de complejo de la cadena de transporte de electrones respiratoria I a IV está acoplado con el flujo de protones a partir de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana que establece un gradiente electroquímico a través de la membrana interna mitocondrial. Después, mitocondrial complejo V (ATP sintasa) lanzaderas los iones de hidrógeno de nuevo en la matriz mitocondrial y sintetiza moléculas de ATP. Función de la fosforilación oxidativa se puede evaluar in vivo e in vitro usando diversas técnicas y diversos estados respiración mitocondrial se pueden obtener. En las mitocondrias aisladas de la siguiente respiratoestados ry se pueden medir: i) basal respiración mitocondrial (estado 1), ii) el consumo de oxígeno después de la adición de los sustratos específicos de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (estado 2), iii) el consumo de oxígeno mitocondrial máxima después de la adición de concentraciones saturantes de difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) y, iv) la respiración en reposo después del consumo de ADP (convertida en ATP) (estado 4). En células intactas los siguientes estados respiratorios se pueden medir: i) basal consumo de oxígeno celular en presencia de sustratos endógenos y ADP, ii) el consumo de oxígeno celular basal en presencia de oligomicina (oligomicina insensible a la respiración) y sensible a la oligomicina respiración (ATP volumen de negocios), iii) FCCP respiración desacoplada, y iv) la respiración no mitocondrial después de la adición de antimicina A y la rotenona. En las células permeabilizadas, sustratos específicos de los complejos de la cadena de transporte de electrones y ADP se pueden añadir y complejos dependientes de máximas velocidades de respiración sUCH I- tan complejo, II- y respiratoria IV-dependientes se puede medir. Las mediciones de la respiración celular proporcionan información importante sobre la capacidad respiratoria mitocondrial específica de los complejos I-IV, la integridad mitocondrial y el metabolismo de 1, 2, 3 energéticos. Uno de los dispositivos que permiten mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial con gran precisión, resolución y sensibilidad es la alta resolución oxygraph 4. El dispositivo de alta resolución oxygraph contiene dos cámaras con puertos de inyección y cada cámara está equipada con un sensor de oxígeno polarográfico. suspensiones mitocondriales celulares o aisladas se agitan continuamente en el respirómetro. Para evaluar la función mitocondrial, sustratos e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial puede añadirse siguiendo protocolos estándar. Sustratos e inhibidores se pueden valorar por inyección into las cámaras del oxygraph, y las tasas de consumo de oxígeno se calculó utilizando el software y se expresó como picomoles por segundo por número de células. De alta resolución de respirometría ofrece varias ventajas sobre los dispositivos tradicionales y convencionales electrodo de oxígeno polarográfico incluyendo aumento de la sensibilidad y la capacidad de trabajar con un número pequeño de muestras biológicas tales como células intactas o permeabilizadas. Además, cada dispositivo contiene dos cámaras, y las tasas respiratorias se pueden grabar simultáneamente para la comparación de las concentraciones de oxígeno. La alta resolución de oxygraph también tiene la ventaja de la reducción de la fuga de oxígeno a partir de las cámaras del dispositivo en comparación con los dispositivos tradicionales de electrodos de oxígeno polarográficos. Otro dispositivo desarrollado recientemente para medir el consumo de oxígeno celular es el 96 pocillos analizador de flujo extracelular 5. El analizador de flujo extracelular está equipado con fluorescencia en lugar de sensores polarográficas. Las ventajas de la extracelularanalizador de flujo en comparación con la de alta resolución oxygraph son i) que es un dispositivo en gran medida automatizado, ii) es posible medir el consumo de oxígeno en 24 y placas de 96 pocillos para cribado de alto rendimiento, por lo tanto requieren menores cantidades de muestras biológicas, y iii) es posible método de medición del flujo glucolítico celular. Las desventajas del analizador de flujo extracelular en comparación con el de alta resolución oxygraph son i) los altos costos del dispositivo y de los consumibles, tales como placas fluorescentes, que son de un solo uso, y ii) sólo cuatro compuestos por ensayo / pocillo son inyectables , por lo tanto, el sistema no es factible para protocolos de titulación sustrato-desacoplador-inhibidor. En el presente estudio, utilizamos respirometría de alta resolución para determinar la respiración mitocondrial. Para los experimentos de consumo de oxígeno celulares, las células se permeabilizaron para permitir la entrada de ADP exógeno y sustratos oxidables mitocondriales para la alimentación de electrones en Complexes del sistema respiratorio. Este enfoque permite la disección de los complejos mitocondriales individuales capacidades respiratorias, que es una clara ventaja en comparación con las células intactas (muchos sustratos son células impermeant). Sin embargo, célula permeabilización de la membrana perturbará la barrera entre el citosol y en el espacio extracelular y medio (lavado de solutos citosólicas) y la composición del espacio intracelular está equilibrada con el medio extracelular. Uno de los inconvenientes de las células permeabilizadas más células intactas es que la membrana externa mitocondrial puede ser dañado si se emplean cantidades excesivas de detergente durante la permeabilización celular. En células intactas, basal, acoplar y desacoplar la respiración de las células intactas se puede medir. Este método evalúa el consumo de oxígeno de las células intactas sin la adición de sustratos exógenos y ADP, la reproducción de la función respiratoria en la célula integrada y que también proporciona información sobre transpo electrones mitocondrial maximalcapacidad rt 6, 7. Una de las ventajas de las células intactas más de células permeabilizadas es que entorno celular no se interrumpe y las mitocondrias están en contacto con el conjunto de componentes de las células. Con el fin de permeabilizar la membrana plasmática celular, detergentes tales como digitonina se han usado 8. Sin embargo, la integridad de la membrana externa mitocondrial puede verse comprometida si se emplean cantidades excesivas de digitonina. Para confirmar que la integridad de la membrana externa mitocondrial no se vea comprometida en las células permeabilizadas, la titulación de digitonina se realiza para determinar la concentración óptima para la permeabilización celular. Para estos experimentos, las células se resuspendieron en medio de la respiración y la concentración de digitonina se titula mediante respirometría en presencia de sustratos y ADP mitocondriales, y las tasas de respiración se miden. La respiración de células intactas, no permeabilizadas no se estimula en presencia de mitochondrial sustratos y ADP. Sin embargo, la posterior titulación digitonina por pasos produciría permeabilización gradual de las membranas de plasma, y ​​se obtiene una óptima concentración de digitonina. Esto se demuestra por el aumento de la respiración hasta alcanzar la plena permeabilización. Calidad mitocondrial y la integridad de la membrana externa se pueden verificar mediante la adición exógena citocromo c 2, 9. El citocromo c es una proteína que lleva 12 kDa de electrones de la cadena mitocondrial de transporte de electrones 10, 11, 12. Se localiza en el espacio intermembrana mitocondrial, y está implicado en el consumo de oxígeno, que lleva electrones de complejo III a IV complejo. Una vez que la membrana externa mitocondrial está dañado, el citocromo c se libera, y el consumo de oxígeno mitocondrial se reduce. Tras la adición de citocromo c exógeno, cualquier aumento en la respiración mitocondrial es indicativo de unainterrumpida membrana externa mitocondrial. En las células permeabilizadas, sustratos e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial se añaden después de varios protocolos 3, 9. Por ejemplo con el fin de investigar la frecuencia respiratoria complejos impulsada mitocondriales, el siguiente protocolo se puede utilizar. Después de la permeabilización de las células, primero complejo I se estimula por el malato de sustratos y glutamato, que generan NADH como sustrato para la cadena respiratoria y provocar la activación del complejo I. Después, se añade ADP para la conversión a ATP (estado 3, activa complejo I-dependiente de la respiración). Después de que se alcanza un valor estable, rotenona (complejo I mitocondrial inhibidor) se administra para inhibir el complejo I. La rotenona es seguido por succinato de FADH 2 y para activar el complejo II (II dependiente de la respiración complejo el estado 3, activa). Con el fin de medir la respiración IV dependiente de complejo, primero complejo IIIrespiración dependiente es inhibida por la adición de antimicina A (mitocondrial inhibidor del complejo III). Después, complejo respiración IV-dependiente se estimula mediante la administración de ascorbato y tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD puede auto-oxidar en el tampón de la respiración, por lo tanto la máxima complejo IV dependiente de la tasa de respiración (estado 3) se calcula restando las tasas de respiración antes y después de la adición de azida de sodio, un inhibidor del complejo IV mitocondrial. Los experimentos de respiración pueden llevarse a cabo en dos cámaras de un oxygraph en paralelo-uno que sirve como control (células no estimuladas), los otros que contienen las células estimuladas. Obviamente, las células pueden ser pre-tratadas de varias maneras, por ejemplo, con fármacos que afectan las funciones mitocondriales, antes de su consumo de oxígeno se mide en la cámara de oxygraph. Este protocolo permite el examen funcional de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial individuales. Además, se puede medir ADP estimulada máximarespiración (estado 3) de las células permeabilizadas, utilizando ácido graso exógeno en forma de palmitato. En este protocolo, las acciones concentradas de palmitato de sodio se conjugan con albúmina de ácidos grasos de ultra bovino libre de suero (BSA) (relación 6: 1 molar palmitato: BSA). Posteriormente, las células primero se permeabilizadas con digitonina y la respiración mitocondrial se evalúa mediante la adición de carnitina y palmitato seguido de la adición de ADP (estado 3, la respiración máxima). A continuación, se añade oligomicina para imitar el estado 4 (4o estado) y la relación del control respiratorio (valor RCR) se calcula como el estado 3 / estado 4o. β-oxidación promueve la producción de acetil CoA (que entra en el ciclo TCA) y la generación de FADH 2 y NADH, los electrones de los cuales se pasan a la cadena de transporte de electrones por flavoproteína de electrones transferencia y β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa. Las mitocondrias son en el centro del metabolismo de ácidos grasos y se describen protocolo palmitato-BSA puede ser utilizado por los investigadores que examinaron grasaty la oxidación de ácidos. En células intactas, se añaden activadores e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial siguiendo un protocolo diferente 6, 9. Para estos experimentos, primero el consumo de oxígeno de las células no permeabilizadas en ausencia de sustratos exógenos se mide (fosforilación de la tasa de respiración). Entonces, la tasa de respiración no de fosforilación se mide después de la adición de oligomicina, que es un inhibidor de la ATP sintasa mitocondrial. Posteriormente, el protonóforo carbonil cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) se administra a varias concentraciones y se mide la frecuencia respiratoria mitocondrial desacoplado máxima. Protonóforos como FCCP pueden inducir un aumento de la permeabilidad de protones de la membrana interna, lo que permite el movimiento pasivo de protones para disipar el gradiente de quimiosmótica. Un aumento en la permeabilidad de protones desacopla la respiración oxidativa (sin producción de ATP) y induce un aumento en oxygen consumo. Después, se añaden rotenona y antimicina A para inhibir la respiración mitocondrial y la respiración mitocondrial no se resta de todas las otras frecuencias respiratorias. Las tasas de consumo de oxígeno se pueden expresar como IO 2 [pmol x seg -1 x 10 -6 células] (flujo de oxígeno por millón de células) que se calcula dividiendo el flujo de oxígeno-volumen específico (en la cámara de oxígeno cerrado), JV, O 2 [pmol x seg -1 x ml -1] por la concentración de células en la cámara celular (número de células por volumen [10 6 células ∙ ml 1]) 15. Masa de células de flujo de oxígeno específico, JO 2 [pmol x seg -1 x mg -1], es el flujo por célula, IO 2 [pmol x seg-1 x 10 -6 células], dividido por la masa por célula [10 mg ∙ 6 células]; o volumen específico de flujo, JV, O2 [pmol x seg -1 x ml -1], dividido por la masa por volumenUME [mg ∙ ml 1]. JO 2 es el flujo de oxígeno por la proteína celular, peso seco o volumen celular. En el presente estudio el uso de alta resolución respirometría, describimos los protocolos para determinar i) la concentración de digitonina óptima para completa permeabilización de la membrana plasmática celular (ensayo de valoración de digitonina), ii) integridad de la membrana externa mitocondrial usando exógena citocromo c, iii) los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial I , las tasas respiratorias máximas II y IV en las células HepG2 digitonina permeabilized en presencia de ADP exógeno y sustratos de la cadena respiratoria mitocondrial, y iv) basal, junto y máximo respiración desacoplada (máxima capacidad de transporte de electrones) de las células intactas sin la adición de sustratos exógenos y ADP, la reproducción de la función respiratoria en la célula integrada.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Químico, disolver en etanol</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Químico</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Químico</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td>Químico, disolver en etanol</td></tr><tr><td>Contador de celdas automatizado Countess&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td></td></tr><tr><td>Químico Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>Químico, disuelto en DMSO</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco 31966021</td><td></td><td>Medio</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Químico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td>Componente medio</td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>Sigma H 7523</td><td>Químico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Químico</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Químico</td></tr><tr><td>K-lactobionato</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td></td></tr><tr><td>Químico MgCl2 </td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>O2K-Core: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrumento de respirometría de alta resolución</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>Químico, disuelto en etanol</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Químico, disuelto en etanol</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Taurina</td><td></td><td>Sigma T 8691</td><td>Químico</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T 4674</td><td>Químico</td></tr></tbody></table>

-alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Un oxígrafo de alta resolución es un dispositivo para medir el consumo de oxígeno celular en un sistema de cámara cerrada con muy alta resolución y sensibilidad en muestras biológicas (células intactas y permeabilizadas, tejidos o mitocondrias aisladas). El dispositivo de oxigrama de alta resolución está equipado con dos cámaras y utiliza sensores polarográficos de oxígeno para medir la concentración de oxígeno y calcular el consumo de oxígeno dentro de cada cámara. Las tasas de consumo de oxígeno se calculan mediante software y se expresan como picomoles por segundo por número de células. Cada cámara de oxígrafo de alta resolución contiene un tapón con puertos de inyección, lo que la hace ideal para valoraciones de inhibidores de desacoplador de sustrato o protocolos de valoración de detergente para determinar concentraciones efectivas y óptimas para la permeabilización de la membrana plasmática. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en una amplia gama de tipos de células y también proporciona información sobre la calidad e integridad mitocondrial, y la capacidad máxima del sistema de transporte de electrones respiratorio mitocondrial.

Determinación de la concentración óptima de digitonina para la permeabilización celular: Titulación Experimento digitonina Digitonina valoración se realiza para determinar la concentración óptima para la permeabilización de las células HepG2. Para estos experimentos, digitonina se valora en células intactas en presencia de rotenona, succinato (mitocondrial complejo sustrato II) y una cantidad saturante de ADP (para inducir el est...

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial &#39;(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la respirometría de alta resolución para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los síndromes y enfermedades asociadas con la disfunción mitocondrial como; sepsis, diversas enfermedades neurológicas y trastornos relacionados con la edad. Las principales ventajas de esta técnica es que tiene una mayor sensibilidad y la capacidad de realizar ensayos de titulación de sustratos en inhibidores acoplados con un pequeño número de muestras biológicas, como células intactas o permeabilizadas.La demostración del procedimiento estará a cargo de Sandra Nansoz, una técnica de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, calibre con aire los sensores polarográficos de oxígeno, luego vuelva a suspender las células en el tampón de respiración a una concentración de una por diez a la sexta celdas por mililitro y reemplace el medio de respiración en una cámara del oxígrafo con 2,1 mililitros de la suspensión celular. Cierre la cámara con el tapón y ajuste la barra de agitación magnética en la cámara a 700 rotaciones por minuto.A continuación, registre la respiración celular durante 5 a 10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. A continuación, utilice una jeringa para inyectar dos microlitros de rotenona a través del puerto de inyección de titanio en la cámara del oxígrafo y registre la respiración celular durante otros 5 a 10 minutos. Cuando se logre una señal de flujo de oxígeno estable, inyecte 20 microlitros de succinato molar seguidos de 10 microlitros de ADP 0,5 molar.A continuación, inyecte dos volúmenes de dos microlitros de dos milimolares de digitonina y registre la respiración celular durante dos a cinco minutos después de cada inyección, seguida de la inyección escalonada de dos a cuatro microlitros de dos milimolares de digitonina hasta que la señal de flujo de oxígeno alcance el nivel máximo y las inyecciones posteriores de digitonina no aumenten la tasa de respiración. Para la evaluación de la integridad de la membrana externa mitocondrial, prepare una cámara de oxígrafo como se acaba de demostrar e inyecte dos microlitros de ocho milimolares de digitonina para permeabilizar las células. Después de cinco minutos, inyecte 20 microlitros de succinato molar y registre la respiración celular durante 5 a 10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.A continuación, inyecte 10 microlitros de ADP 0,5 molar para estimular el complejo dos e inducir un aumento del consumo de oxígeno. Cuando se logre una señal de flujo estable, inyecte cinco microlitros de cuatro milimolares de citocromo c seguidos de un microlitro de cuatro miligramos por mililitro de ligamicina. Para medir la respiración estimulada por ADP de las células de carcinoma hepatocelular hepático, prepare una cámara de oygrafía como se acaba de demostrar, e inyecte dos microlitros de ocho milimolares de digitonina en la cámara de oxígeno para permeabilizar las células durante cinco minutos, seguido de la inyección de 12,5 microlitros de mallade de 0,8 molares y 10 microlitros de glutamato de dos molares.Cuando se logre un flujo de oxígeno estable, inyecte 10 microlitros de ADP de 0,5 molar para aumentar el consumo de oxígeno, seguidos de dos microlitros de rotenona de 0,2 milimolares y 20 microlitros de succinato molar. A continuación, inyecte dos microlitros de cinco milimolares de antimicina y registre la respiración celular. Cuando la señal disminuya y se estabilice, inyecte 2,5 microlitros de escorbato de 0,8 milimolares seguido de la inyección inmediata de 2,5 microlitros de TMPD de 0,2 milimolares, registrando la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente y se estabilice.A continuación, inyecte 10 microlitros de azita de sodio molar en la cámara del oxígrafo y registre la aspiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno disminuya y se estabilice. Para medir el consumo de oxígeno de la célula intacta, prepare una cámara de oxígrafo como se acaba de demostrar e inyecte 1 microlitro de cuatro miligramos por mililitro de aligimicina seguido de inyecciones de uno y tres microlitros de FCCP de 0,2 milimolares. A continuación, valore el FCCP en pasos de 0,1 a 0,3 micromolares inyectando de uno a tres microlitros de FCCP de 0,2 a un milimolar hasta que la señal de flujo de oxígeno alcance su nivel máximo sin más aumentos, y luego comience a disminuir.A continuación, inyecte dos microlitros de rotenona de 0,2 milimolares y dos microlitros de antimicina A de cinco milimolares y registre la respiración hasta que la señal de flujo de oxígeno disminuya y se estabilice. En ausencia de digitonina, la respiración celular es muy baja y la respiración de las células intactas no permeabilizadas no se estimula en presencia de sustrato mitocondrial y ADP. Sin embargo, tras la adición escalonada de digitonina, la membrana plasmática celular se vuelve permeabilizada y la respiración mitocondrial aumenta hasta la permeabilización completa, momento en el que el succinato y el ADP ingresan a las células.Sin embargo, la integridad de la membrana externa mitocondrial puede verse comprometida si se emplean cantidades excesivas de digitonina, lo que induce una reducción de la respiración del complejo al estado dependiente tres. El citocromo c no mejora la respiración del complejo al estado dependiente tres en las células tratadas con digitonina, lo que indica que no hay pérdida de citocromo c de la membrana externa mitocondrial y que la integridad mitocondrial se conserva, aunque el citocromo c puede mejorar la respiración de las células tratadas con dosis muy altas de digitonina. La adición de sustratos exógenos de la actividad del complejo mitocondrial después de la permeabilidad de la digitonina induce un aumento en las frecuencias respiratorias máximas de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial uno, dos y cuatro.La generación de niveles respiratorios reducidos puede deberse a la contaminación de las cámaras del oxígrafo con inhibidores mitocondriales del experimento anterior. En presencia de aligicina y la adición secuencial de FCCP, se observa la frecuencia respiratoria desacoplada máxima de las células. Una vez dominadas, cualquiera de estas técnicas se puede realizar en menos de una hora si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar lavar ampliamente las cámaras y los tapones del oxígrafo después de cada experimento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las mediciones del contenido celular de ATP, cada uno de los cuales presenta actividad cimática y niveles de sustrato mitocondrial, para responder preguntas adicionales como si los cambios en la frecuencia respiratoria se deben a la falta de sustratos mitocondriales o a la reducción de la actividad de los cintatos de ATP. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bionegética exploraran la función mitocondrial en campos como las enfermedades mitocondriales adquiridas y genéticas, el estrés oxidativo, la lesión por perfusión cutánea y el envejecimiento en células o fibras intactas o permeabilizadas y mitocondrias aisladas.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo ayudar a la función de las mitocondrias en células permeabilizadas e intactas mediante respirometría de alta resolución. No olvide que trabajar con antimicina a, rotenona, yozida de sodio, FCCP y aricomicina puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y batas de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

El objetivo de este protocolo es medir el efecto de la glucosa mediada por cambios en la respiración mitocondrial en presencia de compuestos naturales en las células beta de la intacta 832/13 mediante respirometría de alta resolución.

Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

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La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Los métodos para estudiar la bioenergética mitocondrial bajo concentraciones de sustrato fisiológicamente relevantes en las células inmunitarias son limitados. Proporcionamos un protocolo detallado que utiliza fluororrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios en la respuesta del potencial de la membrana mitocondrial a la demanda de energía en células T humanas, monocitos y células mononucleares periféricas.

Fluorrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios dinámicos en el potencial de la membrana mitocondrial en células inmunitarias humanas

Aquí, mostramos que la cámara de 0,5 ml para la respirometría de alta resolución muestra resultados que son consistentes con la cámara de 2,0 ml si se aplica la corrección de fondo instrumental O2 adecuada. Requiere menos muestra, lo que es ventajoso para estudios con disponibilidad limitada o bajas capacidades respiratorias.

Respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen

Aprende a medir el consumo de oxígeno mitocondrial mediante respirometría de alta resolución en células intactas y permeabilizadas. Esta técnica permite evaluar la función mitocondrial con alta sensibilidad.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

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