-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la respirometría de alta resolución para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los síndromes y enfermedades asociadas con la disfunción mitocondrial como; sepsis, diversas enfermedades neurológicas y trastornos relacionados con la edad. Las principales ventajas de esta técnica es que tiene una mayor sensibilidad y la capacidad de realizar ensayos de titulación de sustratos en inhibidores acoplados con un pequeño número de muestras biológicas, como células intactas o permeabilizadas.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Sandra Nansoz, una técnica de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, calibre con aire los sensores polarográficos de oxígeno, luego vuelva a suspender las células en el tampón de respiración a una concentración de una por diez a la sexta celdas por mililitro y reemplace el medio de respiración en una cámara del oxígrafo con 2,1 mililitros de la suspensión celular. Cierre la cámara con el tapón y ajuste la barra de agitación magnética en la cámara a 700 rotaciones por minuto.

A continuación, registre la respiración celular durante 5 a 10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. A continuación, utilice una jeringa para inyectar dos microlitros de rotenona a través del puerto de inyección de titanio en la cámara del oxígrafo y registre la respiración celular durante otros 5 a 10 minutos. Cuando se logre una señal de flujo de oxígeno estable, inyecte 20 microlitros de succinato molar seguidos de 10 microlitros de ADP 0,5 molar.

A continuación, inyecte dos volúmenes de dos microlitros de dos milimolares de digitonina y registre la respiración celular durante dos a cinco minutos después de cada inyección, seguida de la inyección escalonada de dos a cuatro microlitros de dos milimolares de digitonina hasta que la señal de flujo de oxígeno alcance el nivel máximo y las inyecciones posteriores de digitonina no aumenten la tasa de respiración. Para la evaluación de la integridad de la membrana externa mitocondrial, prepare una cámara de oxígrafo como se acaba de demostrar e inyecte dos microlitros de ocho milimolares de digitonina para permeabilizar las células. Después de cinco minutos, inyecte 20 microlitros de succinato molar y registre la respiración celular durante 5 a 10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.

A continuación, inyecte 10 microlitros de ADP 0,5 molar para estimular el complejo dos e inducir un aumento del consumo de oxígeno. Cuando se logre una señal de flujo estable, inyecte cinco microlitros de cuatro milimolares de citocromo c seguidos de un microlitro de cuatro miligramos por mililitro de ligamicina. Para medir la respiración estimulada por ADP de las células de carcinoma hepatocelular hepático, prepare una cámara de oygrafía como se acaba de demostrar, e inyecte dos microlitros de ocho milimolares de digitonina en la cámara de oxígeno para permeabilizar las células durante cinco minutos, seguido de la inyección de 12,5 microlitros de mallade de 0,8 molares y 10 microlitros de glutamato de dos molares.

Cuando se logre un flujo de oxígeno estable, inyecte 10 microlitros de ADP de 0,5 molar para aumentar el consumo de oxígeno, seguidos de dos microlitros de rotenona de 0,2 milimolares y 20 microlitros de succinato molar. A continuación, inyecte dos microlitros de cinco milimolares de antimicina y registre la respiración celular. Cuando la señal disminuya y se estabilice, inyecte 2,5 microlitros de escorbato de 0,8 milimolares seguido de la inyección inmediata de 2,5 microlitros de TMPD de 0,2 milimolares, registrando la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente y se estabilice.

A continuación, inyecte 10 microlitros de azita de sodio molar en la cámara del oxígrafo y registre la aspiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno disminuya y se estabilice. Para medir el consumo de oxígeno de la célula intacta, prepare una cámara de oxígrafo como se acaba de demostrar e inyecte 1 microlitro de cuatro miligramos por mililitro de aligimicina seguido de inyecciones de uno y tres microlitros de FCCP de 0,2 milimolares. A continuación, valore el FCCP en pasos de 0,1 a 0,3 micromolares inyectando de uno a tres microlitros de FCCP de 0,2 a un milimolar hasta que la señal de flujo de oxígeno alcance su nivel máximo sin más aumentos, y luego comience a disminuir.

A continuación, inyecte dos microlitros de rotenona de 0,2 milimolares y dos microlitros de antimicina A de cinco milimolares y registre la respiración hasta que la señal de flujo de oxígeno disminuya y se estabilice. En ausencia de digitonina, la respiración celular es muy baja y la respiración de las células intactas no permeabilizadas no se estimula en presencia de sustrato mitocondrial y ADP. Sin embargo, tras la adición escalonada de digitonina, la membrana plasmática celular se vuelve permeabilizada y la respiración mitocondrial aumenta hasta la permeabilización completa, momento en el que el succinato y el ADP ingresan a las células.

Sin embargo, la integridad de la membrana externa mitocondrial puede verse comprometida si se emplean cantidades excesivas de digitonina, lo que induce una reducción de la respiración del complejo al estado dependiente tres. El citocromo c no mejora la respiración del complejo al estado dependiente tres en las células tratadas con digitonina, lo que indica que no hay pérdida de citocromo c de la membrana externa mitocondrial y que la integridad mitocondrial se conserva, aunque el citocromo c puede mejorar la respiración de las células tratadas con dosis muy altas de digitonina. La adición de sustratos exógenos de la actividad del complejo mitocondrial después de la permeabilidad de la digitonina induce un aumento en las frecuencias respiratorias máximas de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial uno, dos y cuatro.

La generación de niveles respiratorios reducidos puede deberse a la contaminación de las cámaras del oxígrafo con inhibidores mitocondriales del experimento anterior. En presencia de aligicina y la adición secuencial de FCCP, se observa la frecuencia respiratoria desacoplada máxima de las células. Una vez dominadas, cualquiera de estas técnicas se puede realizar en menos de una hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar lavar ampliamente las cámaras y los tapones del oxígrafo después de cada experimento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las mediciones del contenido celular de ATP, cada uno de los cuales presenta actividad cimática y niveles de sustrato mitocondrial, para responder preguntas adicionales como si los cambios en la frecuencia respiratoria se deben a la falta de sustratos mitocondriales o a la reducción de la actividad de los cintatos de ATP. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bionegética exploraran la función mitocondrial en campos como las enfermedades mitocondriales adquiridas y genéticas, el estrés oxidativo, la lesión por perfusión cutánea y el envejecimiento en células o fibras intactas o permeabilizadas y mitocondrias aisladas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo ayudar a la función de las mitocondrias en células permeabilizadas e intactas mediante respirometría de alta resolución. No olvide que trabajar con antimicina a, rotenona, yozida de sodio, FCCP y aricomicina puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y batas de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.