El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer

El objetivo general de este procedimiento es generar proteínas HLA solubles y peptídicas del receptor de células T recumbinadas y péptidos de calidad suficiente para su uso en análisis biofísicos y estructurales. Este método podría ayudar a responder preguntas en el campo de la inmunología de células T. Como, por ejemplo, ¿por qué las células T no responden de forma robusta al cáncer?

La principal ventaja de esta técnica es que obtenemos datos mecanicistas de muy alta resolución que explican cómo los receptores de las células T reconocen sus objetivos, lo que conduce a respuestas inmunitarias mediadas por células T. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de prácticamente cualquier enfermedad humana porque las células T desempeñan un papel fundamental en la mayoría de las respuestas inmunitarias. Aunque este método puede proporcionar información sobre las respuestas inmunitarias de las células T, también se puede aplicar a otros sistemas que están controlados por interacciones de ligandos de receptores.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es muy difícil generar proteínas solubles y activas de calidad suficiente para experimentos biofísicos y estructurales. Para comenzar el procedimiento de repliegue del péptido HLA a seis mililitros de tampón de guanidina con 10 milímetros de ditiotreitol, agregue 30 miligramos de cuerpos de inclusión HLA-A2, 30 miligramos de cuerpos de inclusión beta 2-M y cuatro miligramos del péptido deseado de interés. Incubar la mezcla durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, diluya la mezcla con un litro de tampón HLA refold, preenfriado a cuatro grados centígrados y revuelva la mezcla durante tres horas a esa temperatura. Diálisis la mezcla dos veces contra 20 litros de tris de 10 milimolares, pH 8,1, durante 24 horas cada uno. Para comenzar el procedimiento de repliegue de TCR, a seis mililitros de tampón de guanidina con 10 milimolares de ditiotreitol, agregue 30 miligramos de TCR Alfa y 30 miligramos de cadena TCR Alfa y Beta IB.

Incubar la mezcla durante 30 minutos a 37 grados centígrados y diluir la mezcla en un litro de tampón de repliegue TCR preenfriado. Revuelva y dialice la mezcla diluida de repliegue TCR de la misma manera que la mezcla de péptidos HLA. Filtre ambas mezclas de repliegue dializado a través de un filtro de membrana de 0,45 micrómetros.

A continuación, cargue una de las preparaciones de repliegue filtradas en una columna de resina de intercambio aniónico de 7,9 mililitros y 50 micrómetros, preequilibrada con 20 mililitros de tris de 10 milimolares, pH 8,1. Eluir la proteína con un sistema tampón de gradiente de sal a cinco mililitros por minuto. Recoja fracciones de un mililitro y analice las fracciones con SDS-Page.

Combina las fracciones que contienen la proteína replegada. Coloque la mezcla de proteínas en un concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodalton. Centrifugar la mezcla durante 20 minutos o el tiempo que sea necesario, a 4000 veces g, para concentrar la mezcla a 500 microlitros.

Deseche el flujo a través. Moldee la preparación de proteína concentrada en un circuito de inyección de dos mililitros e inyecte la proteína en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño de 24 mililitros, preequilibrada con el tampón de elusión adecuado. Eluir la proteína con un volumen de columna de tampón a 0,5 mililitros por minuto.

Recoja fracciones de un mililitro, analice las fracciones con SDS-Page y combine las fracciones que contienen la proteína de interés. Prepare 10 diluciones en serie de la solución TCR, en un rango de concentración que abarque 10 veces por encima y 10 veces por debajo de la KD de la interacción HLA del péptido TCR específico, si se conoce. De lo contrario, comience con una concentración de TCR de 200 micromolares.

A continuación, active un chip sensor recubierto de dextrano carboximetilado haciendo fluir una mezcla uno a uno de 100 milimolares y N-hidroxisuccinimida y 400 milimolares EDC sobre el chip a un caudal de 10 microlitros por minuto durante 10 minutos, a 25 grados Celsius. A continuación, cargue 110 microlitros de estreptavidina de 200 microgramos por mililitro y acetato de 10 milimolares de pH 4,5 en las cuatro celdas de flujo para funcionalizar la superficie del chip. Desactive los grupos reactivos restantes con 100 microlitros de clorhidrato de etanolamida de un molar.

A continuación, haga fluir una solución de aproximadamente un péptido micromolar HLA en el tampón proporcionado por el fabricante del chip sobre la superficie del chip a 10 microlitros por minuto hasta que el recuento de unidades de respuesta haya aumentado entre 500 y 600. Sature la superficie del chip con un milimolar de biotina y tampón proporcionado por el fabricante durante 60 segundos. A continuación, inyecte las 10 diluciones en serie de la solución TCR a 30 microlitros por minuto a 25 grados centígrados.

Calcule la constante de enlace de equilibrio y ejecute un análisis cinético. Realice una serie de experimentos SPR de esta manera, variando solo la temperatura a la que se inyectan las diluciones de TCR. Determine la constante de enlace de equilibrio para cada temperatura y calcule las energías de Gibbs y otros parámetros termodinámicos.

Conecte las energías de Gibbs contra la temperatura utilizando un ajuste de regresión no lineal. Concentrar la solución peptídica de HLA a 0,2 milimolar y tampón de cristalización por centrifugación a 3.000 veces g, en un concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodalton. Prepare una solución de 0,1 milimolar de TCR uno a uno y péptido HLA para la cristalización de cocomplejos.

Usando un robot de cristalización y un kit de detección, prepare ensayos de cristalización utilizando la técnica de gota sentada en una placa de 96 pocillos. Con 60 microlitros de tampón de cristalización en cada depósito, y cada gota está compuesta por 200 nanolitros de solución proteica y tampón. Cultiva los cristales a 18 grados centígrados.

Puntúe los cristales bajo un microscopio después de 24 horas, 48 horas, 72 horas y luego, semanalmente. Una vez que hayan crecido cristales individuales de calidad suficiente, coseche los cristales individuales con un bucle compatible con criógenos y almacene los cristales en nitrógeno líquido. Realice difracción de rayos X de sincrotrón bajo una corriente de gas nitrógeno a 100 kelvin, analice los datos y resuelva las estructuras con el software adecuado.

Calcular los contactos, la complementariedad superficial y el ángulo de cruce de las estructuras resueltas. Usando estos métodos, las moléculas de TCR y HLA peptídica se expresaron y se replegaron en una forma soluble. El péptido en las moléculas peptídicas HLA fue el antígeno gp100.

Se utilizó SPR para determinar la afinidad de unión del PMEL17 TCR para el antígeno a varias temperaturas. A continuación, se utilizaron la SPR y la valoración calorimétrica isotérmica para determinar los parámetros termodinámicos de la interacción proteína-proteína. El complejo PMEL17 TCR A2-YLE-9V se cristalizó y evaluó con difracción de rayos X de sincrotrón.

Se identificaron los bucles TCR CDR y los residuos peptídicos de HLA contactados por la proteína TCR y se estudió la naturaleza de los contactos. Las moléculas de HLA del péptido con formas mutadas del péptido también se purificaron y cristalizaron de esta manera. Investigar las diferencias estructurales que podrían impedir las interacciones de unión con TCR.

Se encontró que la mutación del tercer o quinto residuo cambiaba significativamente la posición de la prolina cuatro, lo que interrumpiría muchos de los contactos con el TCR CDR-3 Alpha Loop. Al intentar este procedimiento, es importante seleccionar solo las proteínas más puras para un análisis más detallado. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de tetrámeros HLA de péptidos, utilizando las proteínas solubles para aislar las células T específicas del antígeno de la sangre del paciente para su diagnóstico y análisis posterior.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología de células T exploraran la unión del péptido TCR HLA con exquisito detalle, lo que permitió el desarrollo de nuevos medicamentos para el cáncer y otras enfermedades humanas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar proteínas TCR y HLA peptídicas de calidad suficiente para realizar análisis biofísicos y estructurales.