Name: La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a producir retrovirus defectuosos en replicación mediante transfección transitoria de células 293T para introducir oncogenes humanos en modelos murinos de enfermedades mieloproliferativas.

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<ol><li> La noche antes de la transformación de células de placas, 293T en 3-5x10 6 células / 6 cultureplate tejido cm. Nota: Usamos células 293T por su facilidad de transfección y virus productores de células efficacyas. Estas células son deficientes en el embalaje del virus a menos que un plásmido auxiliar que se introduce. </li><li> La primera mañana, retire suavemente medio y reemplazar con 4 ml de células 293T medicina que contiene 25 mM cloroquina. Puesto en la incubadora durante 1 hora. Nota: la placa debe ser alrededor del 80% confluente. </li><li> Mientras tanto, prepare el virus de la toma de la mezcla de dos platos a la vez, en tubos de 5 ml: <ol><li> 2 x 10 mg de plásmido construir retrovirales </li><li> 2 x 5 mg envase construcción (Ecopak), </li><li> 2 x 62 ml de CaCl </li><li> completa a 1 ml con agua estéril O ddH 2 Nota: Mientras que los retrovirales plásmido codifica el oncogén de interés y un marcador, Ecopak codifica gag-pol-env. Junto con las células 293T, se producirá un retrovirus ecotropic (RV) específicos para las células de ratón, pero no infectar a las células humanas. La cloroquina y CaCl2 se ha demostrado que aumentar la eficiencia de transfección. </li></ol></li><li> Añadir 1 ml de 2x sterileHBS sabio de abandono a la mezcla, mientras que suavemente el tubo de vórtice. </li><li> Inmediatamente agregar esta solución al 2 platos, 1 ml cada una, suavemente, gota a gota. </li><li> Puesto en la incubadora de 7 a 11 hrs. </li><li> Por la noche (7 a 11 hrs. Después), retire suavemente medio, y con mucho cuidado reemplazar con 5 ml de medio fresco 293T. Puesto en la incubadora hasta el mediodía, al día siguiente. Nota: este paso es importante, ya que necesita quitarse la cloroquina de las células. Si se mantiene durante largos periodos de tiempo, la cloroquina es tóxico. La solución de las placas se ve borrosa, debido a una muy fina, como la precipitación de polvo de la mezcla de transfección. Nota: Es importante hacer todos los cambios en los medios de comunicación con extrema delicadeza, ya que las células han sido sensibilizados por la cloroquina, y fácilmente puede desprenderse de la placa. </li><li> Al día siguiente, 18 a 24 hrs. antes de recuperar el virus (en torno al mediodía), retire suavemente medio, y con mucho cuidado reemplazar con 3 ml de medio fresco 293T. Vuelva a colocar en la incubadora O / N. </li><li> La mañana del tercer día (18 a 24 hrs. Después), aspirar suavemente el medio desde los platos con una jeringa de 10 ml equipado con una aguja de 18 G. Este sobrenadante contiene los retrovirus. </li><li> Cambie la aguja a un filtro de jeringa de 45 mm, invertir varias veces la jeringa para mezclar la solución, así, pasar el sobrenadante a través del filtro, y la alícuota en criotubos Nota: Como alternativa, si usted está haciendo 3 platos + de virus, la piscina todos los sobrenadantes del mismo virus en un tubo de 5 0 ml cónico. Mezclar bien, entonces sobrenadantes alícuota que contenga el retrovirus en criotubos por el filtrado. </li><li> Los tubos que contienen los sobrenadantes completo el virus se mantiene en -80 ° C hasta su uso. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
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<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
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<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
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<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Cuatro puntos críticos que aseguran el éxito de una acción viral buena: <ol><li> Las células 293T produce tiene que ser muy saludable, lo que significa que se han dividido en un horario muy regular, nunca fueron crecido, y se colocan en la densidad óptima de 3,5 a 5.000.000 por 6 cm de la placa de cultivo de tejidos, por lo que llegar a una densidad del 80% de la placa en la mañana de la transfección. </li><li> Además de la cloroquina mejora la eficiencia de transfección y el título de virus posterior, alrededor de 3 - a 5 v...

Todos los reactivos utilizados en la transfección debe ser esterilizada por filtración (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) y se mantiene estéril.

la producción de replicación defectuosa retrovirus por transfección transitoria de células 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Nuestros estudios de laboratorio de las enfermedades mieloproliferativas humanos inducida por oncogenes como Bcr-Abl o receptor del factor de crecimiento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR, etc.) Somos capaces de modelar y estudiar una enfermedad parecida a la humana en nuestro modelo de ratón, mediante el trasplante de células de médula ósea previamente infectadas con un retrovirus que expresan el oncogén de interés. Replicación defectuosa retrovirus que codifica para un oncogén humano y un marcador (GFP, RFP, gen de resistencia a antibióticos, etc) es producido por un protocolo de transfección transitoria con células 293T, un ser humano línea de células epiteliales renales transformado por el producto del gen E1A de adenovirus. 293 células tienen la extraña propiedad de ser altamente transfectable por fosfato de calcio (Capo 4), con hasta un 50-80% la eficiencia de transfección puede lograrse fácilmente. En este sentido, co-transfectar 293 células con un vector retroviral que expresan el oncogén de interés y un plásmido que expresa las funciones de embalaje gag-pol-env, como por ejemplo el genoma de un solo embalaje construye kat o PCL, en este caso el Ecopak plásmido. La transfección inicial se mejora aún más mediante el uso de la cloroquina. Las existencias de virus ecotropic, recogidos como sobrenadante de cultivo de 48 horas. después de la transfección, se pueden almacenar a -80 ° C y se utiliza para la infección de líneas celulares a la vista de la transformación y en estudios in vitro, las células primarias o como las células de médula ósea de ratón, que luego pueden ser utilizados para el trasplante en nuestro modelo de ratón .

Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.

La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T

Nuestro laboratorio estudia las enfermedades mieloproliferativas humanas inducidas por oncogenes como Bcr-Abl u oncogenes derivados de receptores de factores de crecimiento (ZNF198-FGFR1, ...

Estamos aquí en el Instituto de Investigación de Oncología Molecular del Centro Médico Tufts New England. Mi nombre es Christina Lesco y soy investigadora postdoctoral en el laboratorio del Dr. Rick Van. Nuestro laboratorio trabaja en el estudio de la leucemia inmunogénica humana, la LMC y enfermedades similares a la LMC.Estamos modelando esta enfermedad humana en ratones y la forma en que lo hacemos es introduciendo el oncogén humano mediante un vector retroviral. Por lo tanto, lo primero que hay que hacer para introducir este oncogén humano en células de ratón es generar el propio virus. Lo siguiente será, efectivamente, concentrar el virus.Entonces, esta es mi placa de cultivo con células 293T. Tendré que lavar el medio con PBS. Las células 293T son adherentes, sin embargo, no son muy adherentes, por lo que cada movimiento debe ser bastante suave. Una vez lavadas, reemplazaremos el PBS con tripsina.Para desprender las células de la placa, necesitamos colocar la placa nuevamente en el incubador durante aproximadamente tres minutos. Después de estos tres minutos, las células quedan realmente en suspensión. Vamos a añadir unos mililitros más de medio regular.Esto va a neutralizar l

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Investigación

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Biología

Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.

Lentivirus de producción

Los lentivirus son una valiosa herramienta de investigación para explorar la función del gen, sin embargo, los investigadores desean evitar la producción de la codificación de lentivirus pantropic conocidos o sospechosos oncogenes. Como alternativa, se presenta un protocolo más seguro para el uso de lentivirus ecotropic en las células humanas modificadas para expresar el receptor mSlc7a1 ecotropic.

Transducción de las células humanas con polímeros complejos Lentivirus ecotropic de Mayor Seguridad de la Biotecnología

En este protocolo se describe la producción, purificación y valoración de lentiviral vectores. Se presenta un ejemplo de entrega gen vector lentiviral mediada por neuronas cultivadas en la enseñanza primaria y astrocitos. Nuestros métodos pueden aplicarse también a otros tipos de...

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

ARN de interferencia (RNAi) posee muchas ventajas sobre los octavos de final de genes y ha sido ampliamente utilizado como una herramienta en los estudios de genes funcionales. La invención de ADN basado en vectores RNAi la tecnología ha hecho a largo plazo y caída de genes inducibles posible, y también aumentó la viabilidad de silenciamiento de los...

ADN vectorial basado en el ARN de interferencia para estudiar la función génica en el cáncer

Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.

Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Aquí presentamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos embrionarios murinos en células madre trofoblásticas completamente funcionales y estables mediante la sobreexpresión de diez días de Tfap2c, Gata3, Eomes y Ets2.

Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

Delineamos un protocolo de 9 días para la transducción y expansión de células mononucleares de sangre periférica de rhesus macaque que produce células con excelente coexpresión de los genes de interés en número suficiente para estudios de infusión de eficacia celular.

Transducción y expansión de células T primarias en nueve días con mantenimiento del fenotipo de memoria central

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

Aprende a producir retrovirus defectuosos en replicación mediante transfección transitoria de células 293T para introducir oncogenes humanos en modelos murinos de enfermedades mieloproliferativas.

La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T

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