La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T
4 de diciembre de 2007
Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.
Estamos aquí en el Instituto de Investigación de Oncología Molecular del Centro Médico Tufts New England. Mi nombre es Christina Lesco y soy investigadora postdoctoral en el laboratorio del Dr. Rick Van. Nuestro laboratorio trabaja en el estudio de la leucemia inmunogénica humana, la LMC y enfermedades similares a la LMC.
Estamos modelando esta enfermedad humana en ratones y la forma en que lo hacemos es introduciendo el oncogén humano mediante un vector retroviral. Por lo tanto, lo primero que hay que hacer para introducir este oncogén humano en células de ratón es generar el propio virus. Lo siguiente será, efectivamente, concentrar el virus.
Entonces, esta es mi placa de cultivo con células 293T. Tendré que lavar el medio con PBS. Las células 293T son adherentes, sin embargo, no son muy adherentes, por lo que cada movimiento debe ser bastante suave. Una vez lavadas, reemplazaremos el PBS con tripsina.
Para desprender las células de la placa, necesitamos colocar la placa nuevamente en el incubador durante aproximadamente tres minutos. Después de estos tres minutos, las células quedan realmente en suspensión. Vamos a añadir unos mililitros más de medio regular.
Esto va a neutralizar la tripsina. En este momento, estamos pipeteando arriba y abajo para asegurarnos de que todas las células estén bien en suspensión; pasamos la suspensión a un tubo de 50 ml y contamos las células en presencia de azul de tripano, utilizando un hemocitómetro para contarlas manualmente. Ahora realizo mi dilución según lo calculado y a continuación voy a sembrar tres por diez a la seis células por placa.
En medio de cuatro ml, nos aseguramos de que las células se siembren adecuadamente y devolveremos las placas al incubador durante 16 a 18 horas, lo que normalmente corresponde a la mañana siguiente. Por lo tanto, ahora estamos a 48 horas después de la infección con el virus GFP. Se utiliza cloroquina para aumentar la absorción del ADN que vamos a añadir a las células.
Aspiramos suavemente el medio de las células, que ahora se han adherido suavemente a las placas en el lateral de la placa. En este momento, vamos a devolver las placas a las incubadoras durante aproximadamente una hora. Mientras tanto, vamos a preparar nuestra mezcla de ADN para aplicarla a las células: una que expresa un gen resistente a la neomicina y otra que expresa GFPI; estoy utilizando ADN XI para controlar toda la transfección.
Finalmente, estamos añadiendo cloruro de calcio. El uso de cloruro de calcio aumenta considerablemente la eficiencia de transfección. Ahora, una hora después, tomamos las placas con medio de cloroquina y vamos a añadir nuestra solución de transfección.
El último paso que debemos realizar consiste en agregar efectivamente un ml de HBS estéril 2x mientras se añade la solución de H2XHBS. Es necesario vortexar el tubo al mismo tiempo y hacerlo lentamente, gota a gota. Esto se realiza para evitar precipitaciones; inmediatamente se distribuye un ml de la solución a la placa de interés, y nuevamente se realiza esto gota a gota.
En este momento, las células 293T están bastante sensibilizadas debido al medio con cloroquina que estamos utilizando. Es necesario mantener toda el área cubierta y mover las placas lo menos posible; etiquete la placa con el constructo que agregó y repita el procedimiento para el siguiente constructo.
En este momento, coloque nuevamente las placas en el incubador durante siete a 11 horas. Al menos siete, pero no más de 11, porque las células están muy sensibilizadas debido a la cloroquina y necesitaremos cambiar el medio después de este tiempo. Ahora estamos a unas 30 horas después de la transfección.
Este es nuestro último cambio de medio por ahora, las células 293 C3T han alcanzado confluencia. Nuevamente, debemos ser muy cuidadosos al aplicar el nuevo medio en el lateral de la placa. Estoy utilizando una jeringa de 10 ml con aguja.
Voy a reemplazar la aguja con un filtro, así que en este momento estoy mezclando bien el medio; ya hemos recolectado nuestro virus y podemos almacenarlo a menos 80 grados hasta su uso. Lo primero que hay que hacer es concentrar realmente el virus. Existen varios pasos sensibles durante la producción del virus, y el primero de ellos es la concentración adecuada de células 293T.
Estamos sembrando tres por diez a la seis células por placa porque después de 18 horas estarán aproximadamente al 80 % de confluencia. Esto aún les deja tiempo para crecer más, de modo que 24 horas después de la transfección alcanzarán el 100 % de confluencia. Se ha demostrado que esto es bastante importante para obtener un título vírico excelente.
El siguiente paso consiste en el uso de cloroquina, y emplear cloroquina sensibiliza realmente las células 2 9 3. Todos los cambios de medio deben realizarse con mucha delicadeza para que toda la capa de células 2 9 3 T no se desprenda de la placa. Finalmente, el ADN que se utiliza para producir el virus debe ser extremadamente puro. Estamos utilizando ADN de banda C.
Una vez que tenemos nuestro virus, lo mantenemos a menos 80 grados. Normalmente, solo lo seguimos una vez por cada fo, lo que disminuirá la concentración del virus dos veces. Por lo tanto, nos gusta congelar el virus que preparamos y luego descongelarlo antes de realizar la titulación real del virus.
Dependiendo de los virus, podemos tener ya sea expresión de GFP junto con el virus para rastrear las células infectadas, o bien podemos tener resistencia a la neomicina. Y es muy importante conocer la titulación del virus antes de usarlo, con el fin de poder comparar entre experimentos o entre diferentes mutantes.
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Descripción general
Esta técnica demuestra una manera eficiente de preparar lotes de retrovirus defectivos para la replicación que codifican un oncogén humano, los cuales se utilizan posteriormente para la inducción de una enfermedad mieloproliferativa en un modelo murino.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Oncología Molecular
- Terapia Génica
- Modelos Murinos de Enfermedad
Antecedentes
- Las enfermedades humanas inmunogénicas, como la leucemia, son complejas y requieren modelos eficaces.
- Los vectores retrovirales se utilizan comúnmente para introducir oncogenes en células huésped.
- Los retrovirus defectuosos en replicación son más seguros para su uso en investigación.
- Comprender los mecanismos de las enfermedades mieloproliferativas puede conducir a mejores estrategias terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la creación de lotes de retrovirus con defectos de replicación.
- Modelar enfermedades inducidas por oncogenes humanos en ratones.
- Investigar los efectos de la introducción de oncogenes en células de ratón.
Métodos Utilizados
- Preparación de lotes de retrovirus defectivos para la replicación.
- Introducción de oncogenes humanos en células de ratón.
- Inducción de enfermedad mieloproliferativa en modelos de ratón.
- Análisis de la progresión de la enfermedad y sus efectos sobre el huésped.
Resultados principales
- Preparación exitosa de partículas retrovirales que codifican el oncogén humano.
- Inducción de enfermedad mieloproliferativa observada en el modelo murino.
- Se demostró la eficiencia del sistema de vectores retrovirales.
- Se obtuvieron conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad mediante este modelo.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque confiable para estudiar los efectos de oncogenes humanos in vivo.
- Este modelo puede utilizarse para investigaciones futuras sobre enfermedades mieloproliferativas.
- Estudios futuros podrían conducir a intervenciones terapéuticas mejoradas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La producción de retrovirus con deficiencia de replicación mediante transfección transitoria permite la entrega confiable de oncogenes para modelar malignidades hematológicas humanas en sistemas preclínicos. Este enfoque apoya la validación de objetivos al establecer vínculos causales entre los factores genéticos y los fenotipos de la enfermedad in vivo. El método aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar una plataforma escalable y estandarizada para la reducción mecanicista de riesgos en las vías oncogénicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la indagación de la función de oncogenes mediante la expresión controlada en contextos celulares relevantes.
- Valor operativo: Facilita la generación de modelos isogénicos para la elucidación de vías y la reducción de riesgos en dianas terapéuticas.
- Valor estratégico: Posibilita la validación de dianas basada en hipótesis con resultados fenotípicos medibles.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce lotes virales estandarizados para una eficiencia de transducción constante en campañas de cribado.
- Valor operativo: Permite la preparación reproducible y de alto título de bibliotecas virales marcadas con reporteros o resistencias.
- Valor estratégico: Facilita la disponibilidad de ensayos para evaluaciones de interacción con el blanco y lecturas funcionales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela la patogénesis inducida por oncogenes humanos en sistemas de ratones inmunocompetentes o humanizados.
- Valor operativo: Proporciona reservas renovables de virus para estudios longitudinales y experimentos de respuesta a la dosis.
- Valor estratégico: Permite la evaluación preclínica de intervenciones terapéuticas dirigidas a oncogenes conductores validados.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica de la eficacia, permitiendo ciclos iterativos de diseño, síntesis y prueba.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación funcional de dianas genéticas mediante la expresión controlada de oncogenes in vitro e in vivo.
- Cribado: Genera reactivos estandarizados para evaluar los efectos de compuestos en células que expresan oncogenes.
- Análisis: Permite la cuantificación de la eficiencia de transducción y la expresión del transgén como marcadores farmacodinámicos clave.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos de enfermedad in vivo, apoyando decisiones de avance o interrupción.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para generar modelos relevantes para enfermedades asociadas a múltiples dianas oncogénicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco mediante la concordancia fenotípica entre modelos in vitro e in vivo.
- Valor operativo: Proporciona una transfección reproducible y de alta eficiencia con producción de virus escalable.
- Valor estratégico: Reduce los falsos positivos biológicos al confirmar el mecanismo del blanco en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Impacto en el portafolio: Orienta la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en la potencia oncogénica validada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células de mamífero, técnicas de transfección y prácticas de nivel de bioseguridad 2.
- Depende del acceso a células 293T, reactivos de transfección (fosfato de calcio, cloroquina) y plásmidos de empaquetamiento.
- Necesita la estandarización de la pureza del ADN, la confluencia celular y el momento de recolección para lograr consistencia entre lotes.
- Requiere adaptación para diferentes pseudotipos de envoltura con el fin de modificar el tropismo hacia tipos celulares específicos.
- Limitado por la capacidad de carga del transgén y el posible silenciamiento en cultivos a largo plazo o in vivo.
