Drosophila Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca in vivo utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de la función cardíaca de Drosophila longitudinalmente in vivo utilizando una técnica de microscopía de coherencia óptica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo estructural y funcional cardíaco de Drosophila al proporcionar métricas, como los cambios en el diámetro cardíaco, la frecuencia cardíaca y el período de actividad cardíaca durante la metamorfosis de Drosophila. La principal ventaja de esta técnica es que la microscopía de coherencia óptica es capaz de obtener imágenes de corazones de animales pequeños de forma no invasiva con una alta resolución espacial y temporal.

Esta técnica puede ayudar a revelar los mecanismos de la enfermedad cardíaca humana y la relación con el desarrollo cardíaco debido a las similitudes genéticas que existen entre Drosophila y los vertebrados. Este método también se puede aplicar a otros sistemas, como la estimulación optogenética para estudiar o tratar la función debilitada del marcapasos en modelos animales. Al producir las moscas para este experimento, permita que las moscas parentales reproductivas se apareen y pongan huevos en un frasco fresco durante ocho horas.

Por lo tanto, la nidada de huevos puestos se convertirá en moscas de una edad similar. Para montar una larva para la obtención de imágenes de OCM, primero prepare un lado limpio con un trozo de cinta adhesiva de doble cara. Empuje las burbujas de aire atrapadas debajo de la cinta.

A continuación, utilice un cepillo suave para extraer una larva del tamaño adecuado del vial. Coloque la larva sobre un pañuelo limpio. Retire cualquier alimento pegado a él con un cepillo humedecido y luego déjelo secar.

Ahora, bajo un microscopio de campo amplio, confirme la etapa de desarrollo de la larva. Luego, coloque la larva con el lado dorsal hacia arriba para montarla. Luego, baje el portaobjetos adhesivo sobre la larva y use una presión moderada para asegurarlo a la cinta.

Coloque la larva montada en la etapa ajustable del sistema OCM a lo largo de la dirección transversal Y con el lado dorsal hacia arriba. Un pequeño agujero en la etapa mantiene a la larva fuera de contacto con el plano de la etapa. Un amplio lumen del tubo cardíaco se encuentra desde los segmentos A5 hasta A8. Usando las imágenes en tiempo real en la computadora, encuentre la región posterior del tubo cardíaco y mueva la etapa hacia adelante hasta que el segmento A7 sea visible.

Ahora, establezca los parámetros de la adquisición de la imagen. Utilice 100 exploraciones A por exploración B y utilice 100 exploraciones B. A continuación, ajuste el voltaje del escáner para que cubra unos 0,28 milímetros en la dirección transversal x y ajústelo a 0 voltios en la dirección transversal y.

A continuación, bloquee la trayectoria del haz de muestra con un paño oscuro y haga clic en el botón de inicio del software para adquirir datos de ruido de fondo para la sustracción de fondo. Para capturar imágenes transversales en modo M, ajuste los parámetros a 128 escaneos A por escaneo B y use 4, 096 escaneos B. Luego, reajuste el voltaje para cubrir 0,28 milímetros en la dirección x y 0 voltios en la dirección y como antes.

A continuación, adquiera imágenes en el modo M transversal del segmento A7 del tubo cardíaco de la mosca. Durante el proceso de almacenamiento de datos, bloquee el haz de imágenes con un paño oscuro para minimizar la exposición a la luz de la muestra de muestra. Tome imágenes del corazón cinco veces para obtener una medición confiable de la función cardíaca.

Para recopilar imágenes tridimensionales, utilice 400 escaneos A por escaneo B, 800 escaneos B y use voltaje para 1,7 milímetros en el transverso x y aproximadamente 4 milímetros en el transversal y. Luego, mueva la platina del microscopio para observar toda la mosca y ajuste el enfoque para ver imágenes claras. Para eliminar la larva, use un cepillo húmedo y suave para transferirla a un nuevo vial con alimento fresco para un desarrollo continuo y un estudio longitudinal.

La luz ancha del tubo cardíaco permanece en los segmentos A5 a A8 en la etapa de pupa PD1. En PD1, esfuércese por obtener imágenes del segmento A7, como se hace con las larvas de las etapas L2 y L3. La etapa de pupa PD1 se identifica por el pupario blanco.

Esta ventana de tiempo es ideal para realizar imágenes ópticas de la pupa temprana porque la alta transparencia conduce a una mayor penetración de luz para la obtención de imágenes OCM. Limpia la pupa con el cepillo si hay comida pegada al cuerpo. Con un cepillo húmedo, monta la pupa en un pequeño portaobjetos de vidrio y mantén el lado dorsal hacia arriba.

El portaobjetos debe encajar en un tubo de mosca para preservar el desarrollo del animal en su propia cámara. Seque el exceso de agua de la pupa y luego colóquela en el escenario con la pupa hacia arriba y proceda a obtener imágenes del segmento A7 como se hizo con la larva. Después de la toma de imágenes, transfiera el portaobjetos de vidrio con la pupa al tubo para un cultivo continuo.

Después de la etapa PD1, comenzando en la PD2, comienza a desarrollarse una cámara cónica entre los segmentos A1 y A4. Dado que las pupas se vuelven progresivamente más opacas, la profundidad de penetración del sistema de imágenes se reduce. En PD2, la cáscara de la pupa se vuelve amarillenta y el cuerpo es menos transparente que PD1.

En PD3, el color de la pupa es aún un poco más oscuro que el de la etapa PD2. En la etapa PD4, se pueden observar rayas negras dentro de la cáscara. Algunos PD4 se convertirán en adultos y otros entrarán en la etapa PD5.

En la etapa PD5, las rayas negras son aún más obvias. Toma una pupa PD2 con pinzas y móntala en un tobogán. En el sistema OCM, encuentre el extremo anterior del tubo cardíaco y luego muévase unas 50 micras hacia el posterior para encontrar el segmento A1 del tubo cardíaco.

Tenga en cuenta que en la etapa PD2, la cámara cónica del corazón es muy pequeña y es posible que aún no esté latiendo. Proceda con la toma de imágenes como se describió anteriormente. Repita el mismo procedimiento para obtener imágenes de Drosophila en las etapas PD3, PD4 y PD5.

Para comenzar, transfiera la mosca adulta a un vial vacío que tenga un volumen de aproximadamente 45 mililitros. Luego, sumerja un aplicador de algodón en la solución anestésica y coloque la varilla en el frasco con la punta de algodón justo debajo del tapón de algodón. Espere tres minutos.

La mosca adulta será anestesiada durante dos minutos y medio a tres minutos y medio, dependiendo de su tamaño. Ahora prepare un portaobjetos de vidrio con un trozo de cinta adhesiva de doble cara. Luego, con un cepillo suave, mueva la mosca anestesiada sobre el portaobjetos de vidrio con el lado dorsal hacia arriba.

Bajo un microscopio de campo amplio, separe las alas con pinzas y péguelas a la cinta, exponiendo así la región del corazón para la obtención de imágenes. Ahora, use la técnica de imagen descrita anteriormente para obtener imágenes del segmento A1 del corazón y sacrifique la mosca al final del experimento. Las imágenes cardíacas longitudinales se realizaron utilizando moscas extensométricas con una copia del controlador 24B-GAL4.

En las etapas larvarias, el tubo cardíaco comienza en la región abdominal posterior A8 con una luz más ancha y termina en el segmento dorsal anterior A1 con un diámetro más estrecho. A finales de PD2, comenzó a desarrollarse una cámara cónica en el segmento A1 a A4. La frecuencia cardíaca de la mosca se cuantificó a partir de las imágenes de OCM en modo M transversal.

Curiosamente, durante las etapas de pupa, el corazón dejó de latir de vez en cuando. En general, los latidos del corazón se ralentizaron significativamente desde la etapa larvaria hasta la etapa de pupa y luego aumentaron sustancialmente de pupa a adulto. Desde este desarrollo, esta técnica ha proporcionado a los investigadores en el campo de la cardiología del desarrollo una nueva herramienta para explorar los efectos de varios genes en el desarrollo del corazón en modelos de Drosophila.

Al intentar este procedimiento, es importante seguir cuidadosamente el desarrollo de una Drosophila para crear imágenes en cada etapa de desarrollo.