Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

El objetivo general de este procedimiento es extraer ARN de alta pureza de las semillas de las plantas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los cereales, como la comprensión de los perfiles genéticos, que contienen las transcripciones originales en las semillas. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores son capaces de preparar ARN altamente purificado con una ligera modificación en el método basado en la columna de espín.

En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la gran cantidad de aceites, proteínas, carbohidratos y polifenoles en el tamiz frontal dificultan el aislamiento del ARN altamente purificado; La demostración del procedimiento estará a cargo de Kazumi Hikino, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar el experimento, agregue un uno por ciento de peso por volumen de PVP de grado de biología molecular al tampón de lisis celular para la extracción de ARN y agite la mezcla vigorosamente. Incubar el PVP durante 20 minutos a 25 grados centígrados para disolverlo por completo.

Después de 20 minutos de incubación, mezcle el tampón suavemente girando el tubo boca abajo para evitar que se formen burbujas. Coseche los frutos de las plantas de Arabidopsis thaliana y colóquelos en dos tubos de polipropileno de 1,5 milímetros sobre hielo, luego coloque los frutos en placas de aluminio mantenidas a cuatro grados centígrados y aísle las semillas de los frutos bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, coloque aproximadamente 200 semillas aisladas en tubos de polipropileno de 1,5 mililitros que se hayan almacenado previamente en una rejilla de aluminio sobre hielo, e inmediatamente coloque los tubos en nitrógeno líquido.

Retire los tubos del nitrógeno líquido y devuélvalos a la rejilla de aluminio con hielo. Agregue 100 microlitros del tampón PVP del uno por ciento a cada tubo y centrifugue los tubos durante un minuto a 1000 veces G, a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, homogeneice la muestra con un mortero de acero inoxidable utilizando un molinillo de motor durante 60 segundos mientras mantiene el tubo en la rejilla de aluminio con hielo; A continuación, agregue 550 microlitros del tampón 100% PVP y gire suavemente el tubo boca abajo para mezclar e incubar el tubo.

Después de la incubación, centrifugar la solución, luego transferir 550 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de polipropileno de 1,5 milímetros y centrifugar el sobrenadante. Transfiera 450 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de polipropileno de 1,5 milímetros. Utilice el sobrenadante como lisado celular para la extracción de ARN utilizando un kit disponible en el mercado.

Prepare una rejilla de aluminio con hielo y descongele la mezcla total de ARN golpeando suavemente, luego coloque el tubo en la rejilla. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes. A continuación, diluya el ARN total en agua libre de ARNasa.

Descongele el ARN total y los conjuntos de tampones del kit comercial, mantenga las enzimas del kit en hielo después de un golpeteo suave. Preparar tubos de polipropileno de 0,2 mililitros libres de nucleasa esterilizados para su posterior análisis. En hielo, combine cinco microlitros de ARN total, un microlitro o 50 micromolares de cebador DT oligo y un microlitro, o 50 micromolares aleatorios de seis meros en el tubo de polipropileno de 0,2 mililitros.

Incuba la mezcla durante 15 minutos a 37 grados centígrados, luego coloca el tubo en hielo. Ajuste las concentraciones de plásmidos para las plantillas de ADN para las curvas estándar. A continuación, diluya las soluciones de CDNA de uno a 100 con agua destilada, luego agregue dos microlitros de las soluciones de CDNA diluidas y los plásmidos previamente preparados para las curvas estándar a la mezcla maestra del kit de PCR cuantitativo en tiempo real.

Por último, configure la PCR en tiempo real e inserte las muestras. El ARN total se aisló de aproximadamente 1.000 semillas utilizando concentraciones variables de tampón de lisis celular, PVP. Las cantidades y la pureza de los ARN aislados demuestran que 1.0%PVP es la concentración más efectiva para aislar grandes cantidades de ARN purificado de semillas.

Las concentraciones, las proporciones A260 y A280, y las proporciones A260 A230 de ARN aislado de 200 semillas mostraron que este método era el mejor para aislar ARN altamente purificado de ocho y 12 días después de la floración, o semillas DAF. Aunque las cantidades de transcripciones arrugadas y dependientes del azúcar son relativamente bajas en las semillas en desarrollo, fue posible detectar cambios en la expresión entre semillas en diferentes etapas de desarrollo mediante PCR en tiempo real; Este método también es adecuado para otras semillas oleaginosas, como se demuestra en esta tabla. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología vegetal exploraran los perfiles de expresión génica en alta concentración de reservas almacenadas, como semillas y frutos.