Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

El objetivo general de este procedimiento es utilizar partículas magnéticas o MNP para identificar múltiples antígenos en la superficie de viriones individuales o vesículas extracelulares individuales con un citómetro de flujo convencional. Este método nos puede ayudar en cuanto a la naturaleza de la relación entre el fenotipo y la función de las vesículas y los virus en las enfermedades humanas, en particular, en la infección viral. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de viriones individuales o vesículas extracelulares individuales en lugar de análisis a granel en el que se pierden las propiedades individuales de estas partículas.

Este método puede proporcionar información sobre la prueba adecuada de partículas virales, pero también se puede aplicar a otros sistemas, siempre que se disponga de los anticuerpos adecuados. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque todos los pasos deben verificarse y verificarse antes del análisis, incluida la configuración adecuada del citómetro de flujo. Comience combinando 60 microlitros de MNP por condición y cinco microlitros de fragmentos de FAB marcados específicos para el isotipo del anticuerpo de captura de interés en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Incubar la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos con mezcla continua. A continuación, humedece previamente un concentrador de 100K con 300 microlitros de PBS y centrifuga el concentrador en la microcentrífuga. Al final de la centrifugación, purifique los complejos marcados en una columna de 100K seguida de otra microcentrifugación resuspendiendo el pellet en 200 microlitros de PBS fresco.

Para capturar las partículas de interés, incube las MNP marcadas con anticuerpos con la partícula de interés durante el período de incubación y la temperatura adecuados. A continuación, bloquee cualquier unión no específica de FC con la especie apropiada de anticuerpo IGG, haga un vórtice suave e incube la solución de partículas durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada la concentración recomendada por el fabricante de cada anticuerpo de detección a las partículas o anticuerpos de control del isotipo a la muestra de control del isotipo durante 20 minutos adicionales de incubación a temperatura ambiente.

Para separar las partículas capturadas por MNP del anticuerpo no unido, primero coloque una columna de separación magnética en un imán separador y humedezca previamente la columna con 500 microlitros de tampón de lavado. Deje que el tampón de lavado fluya a través de la columna, luego agregue los complejos de partículas MNP a la columna que recoja el flujo en un contenedor de desechos. Cuando toda la solución compleja haya pasado a través de la columna, lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de lavado.

Luego transfiera la columna a un tubo de 12 por 75 milímetros. Después de tres minutos, agregue 200 microlitros de PBS, permitiendo que las perlas eluyan por gravedad. Cuando todo el PBS haya pasado a través de la columna, agregue 200 microlitros de PBS fresco al tubo y fije las partículas con 200 microlitros de paraformaldehído al 4%.

A continuación, cargue PBS filtrado de 0,22 micras en un citómetro de flujo y ajuste el voltaje PMT en el citómetro hasta que el PBS filtrado muestre cero o muy pocos eventos. A continuación, ejecute las partículas capturadas con MNP utilizando un flujo bajo con un filtro en línea de 0,04 micras para el fluido de la vaina colocado en serie detrás del filtro de vaina estándar de 0,2 micras para eliminar aún más cualquier evento falso. Con la virometría de flujo, ahora es posible visualizar antígenos celulares en partículas virales individuales.

Por ejemplo, en este experimento se observó una alta heterogeneidad de viriones VIH-1 para la presencia de LFA-1 y HLA-DR con captura de partículas virales que dependían de las células que replicaban el virus. La maduración del virus del dengue se asocia con la expresión de proteínas precursoras de la membrana en los viriones, que se pueden distinguir mediante virometría de flujo, como se acaba de demostrar. En este experimento representativo, se capturaron vesículas extracelulares de plasma pobre en plaquetas utilizando varios anticuerpos fluorescentes acoplados a MNP para investigar diferentes subconjuntos de virus extracelulares en pacientes con síndrome coronario agudo.

El análisis de virometría de flujo determinó que, si bien el número total de vesículas extracelulares aumentó principalmente en los pacientes con síndrome coronario agudo en comparación con los controles de donantes sanos, la magnitud del aumento varió entre las diferentes subpoblaciones de vesículas extracelulares. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar configurar correctamente su citómetro de flujo antes de comenzar el análisis.

El desarrollo de esta técnica abrió un camino para que los investigadores en el campo de la virología y la biología extracelular investigaran el papel de estas partículas en procesos normales y patológicos en sistemas in vitro y en muestras humanas y animales. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la PCR o la espectrometría de masas, para responder a preguntas adicionales, como qué proteínas, moléculas de ARN o ADN transportan específicamente los VE o virus capturados. Espero que después de ver este video tenga una buena comprensión de cómo analizar la composición antigénica de viriones individuales o vesículas extracelulares individuales.