Metales de imagen en el tejido cerebral por ablación con láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS)

El objetivo general de este método es cuantificar la distribución espacial de metales en secciones de tejido mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente y ablación láser. Este método puede responder preguntas clave tanto de la biología básica como de la investigación de enfermedades, particularmente en condiciones donde la bioquímica de metales está involucrada en la patología de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que conserva la información espacial sobre los metales, la cual tradicionalmente se pierde al utilizar técnicas convencionales de análisis de metales en tejidos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas porque nos permite monitorear cómo cambian los metales en regiones cerebrales que presentan muerte celular. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades al configurar estos experimentos largos y complejos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que diseñar el experimento y analizar los datos puede ser complicado porque cada paso debe ejecutarse en un orden específico.

Primero, coloque una muestra de tejido cerebral y todos los estándares de tejido con matriz coincidente en la cámara de ablación láser. Asegúrese de que las muestras estén dentro del campo de profundidad de la cámara LACCD. Cierre la puerta de la cámara y apriete los tornillos con los dedos.

A continuación, en el software del ICPMS, abra la válvula del gas portador y ajuste el caudal a 1,2 litros por minuto. En el software del LA, realice una purga de 30 minutos de la celda de ablación con el gas portador. Para una celda de ablación de dos volúmenes, cada diez minutos mueva la platina de la muestra a cada esquina de la cámara para reducir la cantidad de aire residual en la celda.

Encienda el ICPMS y permita que el instrumento se caliente durante dos horas. Mientras el instrumento se está calentando, en el software de ablación láser trace una línea de ablación de aproximadamente tres milímetros de longitud a través de la superficie del primer estándar de tejido. Haga clic en la línea de ablación y configure el diámetro predeterminado del haz, la velocidad de escaneo y la fluencia radiante.

Duplique la línea seis veces, espaciando las líneas según el diámetro del haz. Repita este proceso para cada patrón. Luego, utilice la herramienta de línea para dibujar el área de ablación sobre la muestra desde la esquina superior izquierda a través del punto más ancho de la muestra, utilizando los mismos parámetros que los empleados para los patrones.

Duplique la línea según sea necesario para lograr una cobertura completa de la muestra con el mismo espaciado utilizado en los patrones. Luego, trace un conjunto de líneas para el escaneo intermitente de los patrones, no más tarde de 20 horas después de escanear la muestra, o entre cada muestra. Añada un escaneo de los patrones al final del experimento.

En función de la longitud de la línea y la velocidad de escaneo, determine el tiempo de análisis para las líneas de la muestra y del patrón. Luego, cree un nuevo lote en el software de ICPMS y seleccione análisis resuelto en el tiempo. Elija los valores de relación masa a carga de interés y establezca los tiempos de integración para cada relación, de modo que el tiempo total de integración para un ciclo sea de 0,25 segundos.

Guarde el lote. Para un lote estándar, complete el tiempo de análisis de cada línea con un margen adicional de 15 segundos para tener en cuenta los tiempos de calentamiento del láser y de lavado. Establezca una lista de ejecución de muestras con una adquisición para cada línea estándar.

Para el lote de muestras, duplique el lote estándar y ajuste los tiempos y el número de adquisiciones según corresponda al patrón de ablación de la muestra. Una vez que el ICPMS haya alcanzado la temperatura de funcionamiento, agregue el primer lote a la cola y asegúrese de que el software esté esperando un disparador desde el instrumento LA. Luego, en el software de LA, encienda la fuente de alimentación del láser y configure los tiempos de calentamiento del láser y de lavado.

Inicie la secuencia del láser y verifique que el ICPMS comience correctamente la recopilación de datos tras la ablación. Una vez que se hayan recopilado los datos, extraiga los datos de los estándares a partir de los archivos CSV. Realice las líneas de base de tracción y excluya la señal de fondo.

Identifique caídas de señal causadas por agujeros en los estándares de tejido. Enmascare estas áreas de señal baja y luego exporte los datos como una hoja de cálculo. Calcule un factor de conversión de CPS a PPM para cada elemento identificado.

Repita este proceso para cada estándar. A continuación, abra el software de construcción cuantitativa de imágenes e importe los datos de la muestra desde los archivos CSV. Seleccione varias áreas del fondo para aplicar la corrección del fondo.

Seleccione la herramienta de edición de gráficos, haga clic derecho en la imagen y seleccione modificar la apariencia de la imagen. Cambie el primer color en Z a un valor negativo grande y haga clic en listo para realzar la señal de fondo. Luego, en la pestaña de estándares, ingrese los factores de corrección CPS PPM para cada estándar y haga clic en continuar.

Abra el explorador de datos en la pestaña de datos, haga clic con el botón derecho en un archivo de imagen corregido y haga clic en nueva imagen. Abra la ventana de modificar apariencia de la imagen y configure la tabla de colores y la escala. Utilice la herramienta de agregar anotación para colocar una escala de colores en la imagen.

Ajuste la escala de colores en la ventana de escala de colores. Una vez que la imagen haya sido coloreada y anotada, copie y pegue la imagen en otro programa o exporte la imagen desde el software de construcción de imágenes. Para activar las herramientas de ROI, seleccione procesamiento de imágenes desde los paquetes de análisis y elija una imagen.

En la pestaña de imagen, haga clic en ROI y comience a dibujar el ROI. Seleccione la región de interés y luego haga clic en finalizar ROI. En la pestaña de imagen, haga clic en estadísticas para obtener los datos del ROI.

Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo, asegurándose de guardar cada vez que se añade una ROI. Repita el proceso según sea necesario. Se investigó el contenido y la distribución de metales en el cerebro de un ratón de tipo salvaje utilizando esta técnica.

Aquí, las distribuciones de carbono, magnesio y fósforo se muestran en cuentas por segundo. Se muestran imágenes cuantitativas para manganeso, cobre, hierro y zinc. La distribución de carbono se utilizó como estándar interno.

El hierro era más abundante en el mesencéfalo y en el giro dentado. El zinc era más abundante en las áreas corticales. La información proveniente de estas imágenes puede utilizarse entonces para rastrear la expresión y funcionalidad de las proteínas de unión a metales. Una vez dominado, un experimento que abarca varios días puede montarse en una hora si se realiza adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, es importante sincronizar sus líneas de ablación y sus archivos de datos con el ICPMS. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales, como la tinción histológica en secciones adyacentes, con el fin de obtener información adicional, como la colocalización de metales con proteínas específicas. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos examinar cómo cambiaban los niveles de metales en modelos de laboratorio de la enfermedad de Parkinson.

Aunque este método puede utilizarse para obtener información sobre la neurodegeneración, también puede aplicarse a diferentes tipos de tejidos y estados patológicos, incluyendo tejido humano y una variedad de matrices biológicas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia examinaran cómo cambiaban los niveles de metales tanto en muestras humanas como en modelos animales de enfermedad. Después de ver este video, deberías tener una buena idea de cómo configurar el experimento de ICPMS con ablación láser.

No olvide que trabajar con material biológico puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal adecuado, durante la realización de este procedimiento.