Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

El objetivo general de este protocolo es desarrollar tecnologías que permitan una transducción génica exitosa en células asesinas naturales primarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunoterapia, como el efecto de la modificación genética sobre linfocitos efectorores, tales como las células asesinas naturales o células NK. La principal ventaja de esta técnica es la expresión eficiente de un gen de interés en células NK primarias de ratón o humanas.

Después de preparar y titular vectores lentivirales según el protocolo descrito, purifique las células NK primarias murinas pasando suspensiones celulares únicas de bazo a través de columnas de lana de nailon para agotar las poblaciones adherentes compuestas por linfocitos B y macrófagos. Utilice 1.000 unidades por mililitro de interleucina-2 en medio completo RPMI1640 para cultivar la población no adherente que contiene células NK. En el día cuatro del cultivo, cambie el medio usando 20 mililitros de medio completo RPMI1640 y 1.000 unidades por mililitro de IL-2 para eliminar las células T y NKT no adherentes.

El día siete, utilice marcadores específicos de células NK para verificar la pureza de las células NK murinas mediante citometría de flujo, usando preparaciones con una población mayor al 95 % negativa para CD3 y positiva para NK1.1. Para aislar los mononucleares de sangre periférica, o PBMC, coloque cuidadosamente 35 mililitros de células semidiluidas sobre un gradiente de densidad de 15 mililitros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue el gradiente en un rotor de cestas oscilantes a 400 × g y 20 °C durante 30 minutos sin freno.

Después de purificar las células NK primarias humanas según el protocolo descrito, determine la pureza de las células añadiendo dos microgramos por mililitro de anticuerpo anti-CD3 y dos microgramos por mililitro de anticuerpo anti-CD56. Incube las células a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Use PBS para lavar las células dos veces.

Luego, analice las células mediante citometría de flujo. La población de células NK será positiva para CD56 en la superficie celular y negativa para CD3. Suspenda las células NK primarias de ratón o humano en los pocillos de una placa de 24 pocillos a 0,5 veces a la 5ª por mililitro de medio con el sobrenadante de lentivirus GFP, a una NLY de cinco, 10 y 20.

Luego, en presencia de polibreno, sulfato de protamina o dextrano, centrifugar las placas a 1.000 ×g durante 60 minutos. A continuación, sin decantar el sobrenadante, cultivar las células en un incubador a 37 grados Celsius con una atmósfera de 5,2 % de dióxido de carbono durante la noche.

Después de lavar las células con 10 mililitros de PBS, utilice dos mililitros de medio RPMI1640 con IL-2 para re-suspender las células. El día anterior a la recolección de las células, recubra placas de poliestireno altamente absorbentes de 96 pocillos con 2,5 microgramos por mililitro de anticuerpos monoclonales anti-MKG2D e incube las placas a temperatura ambiente o en el refrigerador durante la noche.

Al día siguiente, use 100 microlitros de PBS para lavar cada pocillo tres veces. Recoga las células NK transducidas golpeando suavemente las placas y luego agregue 100 microlitros de las células a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. De 16 a 18 horas posteriores a la activación, use una pipeta multicanal para recolectar los sobrenadantes.

Luego, utilizando la citocina recombinante de un kit de ELISA, genere una curva estándar y cuantifique las citocinas, como el interferón gamma en el sobrenadante. Para evaluar la viabilidad de las células NK, cuatro días después de la transducción, lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS frío. A continuación, recupere las células y úselas para teñirlas con XM5 7-aminoactinomicina D.

Utilice la citometría de flujo para determinar el porcentaje de células necróticas entre las células NK transformadas y analice los datos según el protocolo descrito en el texto. Esta figura muestra que las células NK humanas incubadas con IL-2 recombinante y luego transducidas con el lentivirus GFP lograron una mayor eficiencia de transducción y aumentaron el título viral cuando se añadió dextrano al cultivo, en comparación con la adición de polibreno o sulfato de protamina. Como se observa aquí, se demostraron resultados similares en células NK murinas, donde el dextrano aumentó la eficiencia de los vectores lentivirales, en comparación con el polibreno o el sulfato de protamina.

En este experimento, la capacidad citotóxica de las células NK primarias transducidas se examinó mediante un ensayo de liberación de CR frente a K562 y YAC-1 como células diana. La transducción de células NK mediante dextrano no altera negativamente el potencial de lisis de las células NK transformadas en comparación con las células NK no transducidas. Aquí, las células NK primarias humanas transducidas se co-cultivaron con K562 durante 24 horas, y los sobrenadantes se recogieron para medir la interferona gamma.

Los resultados indican que el dextrano no tiene impacto en la capacidad de las células NK transducidas para producir citocinas. Además, una validación independiente mostró que las células NK tratadas con dextrano y activadas con anticuerpos monoclonales anti-NKG2DA10 inmovilizados en placas aún podían producir la citocina Interferón Gamma. Al intentar este procedimiento, es importante recordar centrifugar las células transducidas.

Tras seguir este procedimiento, otros métodos como la transfección pueden ser muy útiles para responder preguntas adicionales, como cómo mejorar la entrega de genes. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Inmunología exploraran la manipulación genética en células NK. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transducir células NK.