Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii

El objetivo general de este procedimiento no quirúrgico de infección intrabronquial es establecer una neumonía bacteriana robusta en roedores inmunocompetentes. Este método añade valor para el descubrimiento y desarrollo de antibacterianos al permitir evaluar la eficacia de posibles tratamientos en un modelo inmunocompetente de neumonía grave. La principal ventaja de esta técnica, es que establece una infección pulmonar robusta y reproducible con muchos aislados, incluyendo aquellos que típicamente requieren que los animales sean neutropénicos o aislados que no producen una infección viable con otros métodos.

Por lo general, las personas nuevas en este procedimiento tendrán dificultades. La intubación adecuada es un procedimiento ciego que requiere aprender a sentir correctamente para intubar la tráquea en lugar del esófago. La intubación adecuada es diferente para cada científico.

Es posible que el ángulo exacto de la cánula no sea el mismo para todos. La clave es palpar las crestas de la tráquea. Demostrando esta técnica, estará Cindy Mininger, científica de nuestro laboratorio.

Para comenzar, prepare suspensiones de bacterias salinas a partir de cultivos de caldo durante la noche, como se indica en el protocolo de texto, o de placas de agar, como se muestra aquí. Coseche el crecimiento durante la noche de las placas de agar mediante el uso de un bucle estéril para raspar las colonias de la superficie. Transfiera el material cosechado a cinco mililitros de solución salina estéril hasta obtener una suspensión turbia y opaca, y vórtice suavemente el cultivo hasta que sea homogéneo.

Diluya en serie, luego y coloque una alícuota de cada dilución de acuerdo con el protocolo de texto. Después de preparar el agar y ensamblar las herramientas necesarias para el proceso de infección, de acuerdo con el protocolo de texto, alícuota nueve mililitros de agar en un tubo estéril y luego coloque el tubo en el baño de agua hasta que el agar se equilibre a aproximadamente 42 grados Celsius. Agregue un mililitro de la suspensión de bacterias salinas previamente preparada en el tubo de agar.

Luego, invierta el tubo varias veces para mezclar y devolverlo al agua. Coloque una alfombra limpia y desechable sobre la superficie de trabajo cerca del baño de agua. Para preparar la superficie de trabajo y el dispositivo de intubación, primero esterilice la cánula metálica y el tubo de polietileno de acuerdo con el protocolo de texto y luego transfiéralo en su tubo de almacenamiento de vidrio a la superficie de trabajo.

Luego, retire la tapa del tubo de almacenamiento y deslice el extremo del mango de la cánula hasta el extremo abierto del tubo. Con pinzas estériles, retire un trozo de tubo de polietileno del vaso de precipitados e insértelo a través del interior de la cánula metálica estéril, asegurándose de que se mueva libremente. Coloque una marca guía en un lugar predeterminado con un bolígrafo indeleble.

A continuación, coloque una aguja estéril desechable de calibre 25 en el extremo libre del tubo de polietileno deslizando la aguja varios milímetros dentro del tubo. Luego, use una solución salina estéril para llenar una jeringa desechable nueva de un mililitro. Conecte la jeringa a la aguja colocada en el tubo de polietileno y enjuague todo el volumen de solución salina a través del tubo.

Deseche la jeringa usada en el recipiente para objetos punzocortantes. Luego, llene una nueva jeringa desechable estéril de un mililitro con el inóculo a base de agar del baño de agua. Vuelva a colocar la aguja y el tubo de calibre 25 y enjuague el agar a través del tubo presionando el émbolo hasta que el tubo esté completamente lleno de agar.

Después de anestesiar a la rata de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al animal en posición supina sobre la alfombra desechable con la cabeza hacia la derecha y la cola hacia la izquierda. A continuación, inserte el extremo libre de la cánula metálica en la boca del animal. Gire la cánula de modo que el extremo libre quede inclinado hacia arriba y acelere suavemente hacia la tráquea, evitando con cuidado las estructuras laríngeas con un ligero movimiento de torsión.

Confirme la inserción en la tráquea, en lugar de en el esófago, deslizando suavemente la cánula ligeramente hacia adelante y hacia atrás varias veces mientras usa el dedo índice izquierdo para palpar los anillos traqueales. Para asegurar la intubación en la tráquea, y no en el esófago, mueva la cánula ligeramente hacia adelante y hacia atrás y palpe las crestas. Si la cánula se desliza suavemente por la garganta y no se pueden sentir las crestas, retire el dispositivo y vuelva a intentarlo.

Cuando la cánula llegue a la bifurcación donde la tráquea se divide en los bronquios izquierdo y derecho, haga un ligero movimiento de torsión hacia el lado izquierdo del animal para asegurarse de que la cánula se inserte en el bronquio izquierdo. Un error común es no colocar los inóculos lo suficientemente profundo en el pulmón, lo que puede bloquear las vías respiratorias e inhibir la respiración. Cuando la cánula se gira al ángulo adecuado, debe deslizarse fácilmente hacia el bronquio izquierdo y avanzar suavemente hasta la profundidad adecuada.

Avance la cánula metálica hasta que el extremo esté a mitad de camino o tres cuartos del pulmón izquierdo, utilizando la marca guía colocada anteriormente para confirmar que se ha alcanzado la profundidad adecuada. Con la cánula metálica en su lugar, avance el tubo de polietileno varios milímetros utilizando la marca guía previamente colocada en el tubo para asegurarse de que avance solo lo suficiente como para salir del extremo de la cánula metálica y no perforar el pulmón. Con ambas cánulas en su lugar, use la jeringa adjunta para instilar 100 microlitros de suspensión de agar profundamente en el lóbulo grande del pulmón izquierdo.

Retire varios milímetros del tubo y retire suavemente el dispositivo de intubación intacto. Vuelva a colocarlo en el tubo de almacenamiento de vidrio y mueva al animal a una jaula nueva para que se recupere. Prepare la superficie de trabajo y la cánula como se acaba de demostrar para las ratas, utilizando el equipo del tamaño adecuado para ratones.

Utilice una jeringa desechable estéril de 1 mililitro y una aguja estéril de calibre 25 para llenar la jeringa de microinyección de vidrio con solución salina estéril. Luego, enjuague la solución salina a través del dispositivo reensamblado. A continuación, utilice una nueva jeringa estéril desechable de un mililitro y una aguja estéril de calibre 25 para llenar la jeringa de microinyección con el inóculo de agar.

Luego, vuelva a ensamblar el dispositivo y enjuague el agar a través del tubo hasta que el tubo esté completamente lleno de agar. Después de anestesiar al ratón de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al animal en la misma orientación que se mostró para la rata y use una presión constante pero suave para intubar la tráquea de manera similar a como lo hace con la rata. Evite el uso de la fuerza, ya que la técnica es más delicada en ratones.

Asegúrese de que la cánula se inserte en la tráquea palpando los anillos traqueales. Gire ligeramente y avance la cánula hacia el bronquio izquierdo, insertándola profundamente en el pulmón utilizando las marcas guía previamente colocadas. Con la cánula metálica en su lugar, avance el tubo de polietileno varios milímetros e instilar 20 microlitros de suspensión de agar.

Aquí se muestra un ejemplo representativo de colonias que crecen en una placa de agar después de la dilución en serie y la siembra por triplicado de una muestra de homogeneizado pulmonar. Como se demuestra en este gráfico con S. pneumoniae, se observa típicamente un aumento en la carga bacteriana de varias UFC de base logarítmica diez por encima de los controles basales en los pulmones infectados para la mayoría de los aislados bacterianos, incluso a las 96 horas después de la infección, y la variabilidad entre animales es baja. En este experimento, se evaluaron dos compuestos frente a aislados de S. pneumoniae susceptibles a quinolonas o resistentes a las quinolonas para ilustrar que este modelo de infección pulmonar se puede utilizar durante la optimización de una serie química principal para apoyar las relaciones de actividad estructural.

Cada símbolo representa UFC determinada a partir de los pulmones de una rata. Aquí se muestran modelos E max creados utilizando datos de eficacia de rango de dosis en ratones inmunocompetentes infectados en el pulmón con aislados de S. pneumoniae o H. influenzae para determinar objetivos farmacocinéticos y farmacodinámicos para un nuevo inhibidor de la deformilasa polipeptídica. Los círculos representan la carga bacteriana media de cuatro a cinco ratones por grupo tratados con dosis variables de compuesto.

Los círculos abiertos representan el área libre bajo la curva y los círculos rellenos representan el área bajo la curva de tiempo de concentración sobre la concentración inhibitoria mínima. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en unos 30 segundos por animal, con hasta cinco o seis animales inoculados por jeringa de inóculo de agar. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar este método de infección intrabronquial no quirúrgico y poder utilizarlo para establecer infecciones pulmonares con muchos aislados bacterianos diferentes.

Instrumental energético