Name: Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a establecer neumonía bacteriana en roedores inmunocompetentes mediante intubación intrabronquial no quirúrgica. Este método permite evaluar la eficacia de tratamientos antibacterianos en un modelo relevante de infección pulmonar severa.

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JH desea reconocer y agradecer a mentor, amigo y ex gerente Valerie Berry para la primera que nos enseña este modelo; y Gary Woodnutt, que nos enseñó los fundamentos de la inspiración y nuestro compromiso con el campo de PK / PD antibacteriano. Todos los autores desean agradecer a David Payne por su apoyo y reconocimiento a nuestra ciencia. Nos gustaría reconocer a nuestro ex colegas en microbiología vivo que contribuyeron a la cantidad de datos generados usando estos métodos, especialmente Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni página y Nerissa Simon. Por último, damos las gracias a nuestros colegas de microbiología in vitro por su ayuda, especialmente para proveer a todos los países de ingresos medios que solicitamos (Lynn McCloskey, Josh West y Sharon min); y para nuestro equipo de microbiología clínica que proporciona asesoramiento y apoyo (Linda Miller, Nicole Scangarella-Omán y Deborah Butler).

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<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tricyclics+%28e.g.+GSK945237%29+as+potent+inhibitors+of+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).</li>
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<li>Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+bacteriological+efficacy+of+pharmacokinetically+enhanced+amoxicillin-clavulanate+against+Streptococcus+pneumoniae+with+elevated+amoxicillin+MICs+and+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).</li>
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</ol>

Los autores son todos pagados empleados de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals y son dueños de acciones dentro de la empresa.

Para obtener resultados óptimos en la reproducción de este modelo de infección, se deben considerar las siguientes sugerencias adicionales. La virulencia de los nuevos aislados se puede mejorar haciendo pasar 2 - 3 veces en vivo antes de la utilización en un estudio. Poblaciones bacterianas congeladas siempre deben prepararse a partir de una fuente primaria -derivado in vivo con el menor número de pases como sea posible a partir de la original, y volver a congelar o reutilización de Stock descongelado no se recomienda. El uso de aislados clínicos recientes recuperados de pacientes con neumonía y / o preparación de los cultivos en fase logarítmica de crecimiento también puede ayudar a mejorar el establecimiento de la infección. Una dilución de cinco veces en el agar (por ejemplo, 2 ml de suspensión salina añadió a 8 ml de agar) se puede utilizar en lugar de diez veces para aumentar el inóculo bacteriano, y el volumen de inóculo se puede ajustar en función del tamaño del animal (por ejemplo, 200 l / animal generalmente se inocularon en 250 g de ratas). Antes de la adición de la suspensión bacteriana solución salina en elagar (es decir, en el paso 2.3), la densidad bacteriana se puede predecir o estimar mediante inspección visual, las normas de MacFarland o mediciones de densidad óptica. Es útil para familiarizarse con las características de crecimiento in vitro para cada aislamiento antes de realizar los experimentos in vivo. La consistencia en el crecimiento y la manipulación permite la estimación más precisa de la densidad bacteriana de cualquier muestra dada. métodos microbiológicos estándar que difieren de los descritos, tales como los medios de comunicación y homogeneizadores de tejidos alternativa, se pueden utilizar según sea apropiado para la preparación de inóculos y la enumeración de las bacterias a partir de tejidos infectados. Es muy recomendable para preparar o fundir el agar el día antes del experimento y almacenarla durante la noche en un baño de agua separada se establece en 50 ° C. Esto simplificará el proceso y ayudar a proteger contra el agar ser demasiado caliente en el momento de la infección. Una temperatura del 41 - 42 ° C logra un buen equilibrio entre el manteniNing el agar en estado líquido sin ser demasiado caliente para la supervivencia bacteriana a corto plazo. Como una posible alternativa a agar nutritivo, agar noble se ha utilizado con éxito en algunos experimentos. Un tubo de inóculo agar es por lo general suficiente para todo un experimento (y se recomienda), pero múltiples tubos se puede preparar para infectar un gran número de animales (por ejemplo, más de 60) o cuando el proceso de infectar tarda más de 30 - 45 min Si se requieren múltiples tubos de inóculo, agregar la suspensión bacteriana solución salina a cada tubo de agar como se necesita. Esto reduce el riesgo de que la supervivencia y / o idoneidad bacteriana se verán afectados por la exposición prolongada a una temperatura elevada antes de la inoculación. Cabe señalar que el uso de múltiples tubos de inóculo también pueden requerir procedimientos adicionales de animales de aleatorización. Siempre que sea posible, infectar a todos los animales de la misma preparación del inóculo. Se recomienda para adaptar el tamaño de experimentos para el nivel actual de competencia con el technique. Un científico experto puede intubar e inocular un animal en menos de 30 s y inocular hasta 5 - 6 animales por lotes (es decir, con una jeringa llena de inóculo agar). Para aquellos que están aprendiendo la técnica, la velocidad es importante, ya que el agar se empezará a solidificar; sin embargo, la colocación exacta del inóculo es más importante. Comience con 1 o 2 animales por lote, y aumentar a medida que la técnica se hace más familiar. Los animales continúan a respirar durante la intubación; Por lo tanto, la ventana de tiempo para la inoculación depende de la rapidez con que el animal se recupere de isoflurano, que debe ser de aproximadamente 2 - 3 min. Los animales que despiertan durante el proceso pueden ser re-anestesiados e intentaron una segunda vez, pero no se recomienda hacerlo en varias ocasiones. Se espera que la inoculación con éxito en el primer intento en casi el 100% de los animales una vez que se logra el dominio. Tenga en cuenta que es más fácil para aprender la técnica usando ratas primera; Los ratones son más delicados y cuanto menor sea demasiadols son más propensos a la obstrucción con agar solidificado si no manipulado rápidamente. jeringas pre-calentamiento, tubos y salinas, así como mantener el dispositivo de intubación en una superficie tibia (no caliente), tal como una almohadilla térmica a baja temperatura, pueden ayudar a prevenir la solidificación del agar. Cuando el aprendizaje de la técnica, también es útil para practicar la colocación adecuada del inóculo usando un colorante de color oscuro (tal como azul de metileno concentrado) en lugar de la suspensión bacteriana en agar. Realizar el procedimiento como se describe, pero la eutanasia a los animales inmediatamente después de la inoculación del colorante (no permitir que el animal se recupere entre la anestesia y la eutanasia). Diseccionar para determinar donde el colorante se ha colocado, y ajustar en consecuencia la técnica. El criterio de valoración principal de este modelo es CFU de los pulmones infectados. La supervivencia no es un buen indicador de la carga bacteriana y no es un punto final recomendado. Para los estudios de eficacia, la N sugerido es de 5 - 6 animales por grupo, ya que es predicted para detectar ≥1 log 10 CFU diferencias entre los grupos con poder por lo menos 90%. Los animales pueden ser infectados en grupos de tal manera que sus compañeros de jaula permanecen juntos, o un verdadero proceso de asignación al azar pueden ser seguidos. Tenga en cuenta que si los grupos son asignados por jaula, los grupos deben ser infectados en una secuencia aleatoria con los controles de crecimiento de fin de estudio infectadas último (para confirmar que la supervivencia bacteriana / aptitud no se vio afectada por la longitud de tiempo de exposición a una temperatura elevada en el baño de agua). No hay métodos de censura datos deben ser necesario, y ninguno se recomiendan con la excepción de la eliminación inmediata de cualquier animal que ha sido obviamente mis-inoculadas en el comienzo del estudio (antes del inicio de cualquier tratamiento). Los animales que son sacrificados antes del final del estudio se tomarán muestras y los resultados incluidos en el conjunto de datos a menos que una razón válida para la exclusión se identificó de forma prospectiva (es decir, un evento no relacionado con la infección o tratamiento). arrastre medicamento puede affect algunas muestras y es una consideración importante en todos los modelos de infección in vivo. Si se administra un compuesto de frecuencia, cerca del momento de la eutanasia o tiene una larga vida media, puede estar presente en el homogeneizado de tejido en una concentración lo suficientemente alta para continuar matar las bacterias ex vivo durante el proceso de enumeración de bacterias (dilución y el chapado de las muestras o en las placas de agar durante la incubación durante la noche). Para evitar esto, carbón activado y / o un aditivo que degrada la molécula activa sin dañar las células bacterianas se pueden añadir a la muestra antes de la homogeneización. Otros métodos incluyen la centrifugación de las muestras para eliminar la mayoría del compuesto activo (que debe permanecer en el sobrenadante) y el empleo de diferente dilución y chapado esquemas para diluir suficientemente el compuesto activo a una concentración no inhibidora. Como lo demuestran los ejemplos que se muestran en la Figura 2, este modelo de éxito induces infecciones pulmonares en los roedores con una amplia gama de organismos, incluidos los que no crecen bien en otros modelos (por ejemplo, H. influenzae). Estas infecciones son consistentes y reproducibles, lo que reduce la probabilidad de que tendrán que repetirse debido a la falta de modelo y / o de bajo rendimiento con un aislado concreto experimentos. Aunque los animales son inmunocompetentes, no son capaces de resolver rápidamente la infección, en todo caso. Esto permite una mayor flexibilidad en la longitud del estudio, como muchos aislados mantienen una infección viable a través de al menos 96 h sin la necesidad de inyecciones repetidas para mantener la neutropenia. El beneficio potencial de estudiar la eficacia antibacteriana en animales inmunocompetentes se ha señalado anteriormente 20, 21, y hay pruebas de que, para algunos compuestos (por ejemplo, oxazolidinonas), los datos de los roedores no neutropénicos pueden predecir con mayor precisión los objetivos de exposición humana en comparación con los neutropénicos prestados 5. La utilidad de usos múltiples de tque el modelo se demuestra en las figuras 3 y 4 y las Tablas 1 y 2. Estos estudios son parte de una gran colección de los datos publicados y no publicados que se ha generado con este modelo para apoyar los esfuerzos de optimización de plomo 16, 17, 22-24, para la comparación y la confirmación de la dosificación humana propuesto regímenes de 19, 25 a 29 y para la caracterización de PK / PD 18, 30-32 .While este modelo es inicialmente más complejo para llevar a cabo en comparación con el método intranasal inhalación, hay muchas ventajas como se describió anteriormente. Con la práctica y el uso rutinario, las técnicas deberían ser fáciles de realizar. Se puede observar en algunos estudios que la carga bacteriana al inicio del estudio fue inferior a la que generalmente se busca en otros modelos de infección pulmonar. Esto se debe en gran parte a la dilución requerida en agar y el pequeño volumen desafío, particularmente en ratones. Sin embargo, también hay que señalarque el crecimiento de bacterias se observó en todos los casos, incluso cuando la carga inicial fue relativamente baja. La carga bacteriana de línea de base de destino es 6-6,5 log 10 CFU / pulmones (6,8 a 7,3 log 10 CFU / g de tejido en ratones en base a pesos de los pulmones promedio) que corresponde a densidades estimadas en pacientes humanos con neumonía grave 33. Una carga de línea de base más alta se puede lograr mediante la concentración aún más el inóculo bacteriano o retrasando el inicio de la administración del compuesto para permitir el crecimiento bacteriano adicional; Sin embargo, el aumento de la carga de interrogación en exceso puede conducir a la enfermedad anormalmente grave y aguda (es decir, la muerte en menos de 24 h) que es refractario a todos los tratamientos antibacterianos independientemente de la susceptibilidad. Aunque el inóculo se coloca inicialmente preferentemente en el pulmón izquierdo del animal, la infección generalmente se extiende a lo largo de ambos pulmones. La enfermedad progresiva pulmonar, la difusión de las bacterias a otros órganos, y la eventual morbilidad suele ser observed con S. pneumoniae, K. pneumoniae y P. aeruginosa. De interés, las infecciones por H. influenzae y A. baumannii son por lo general más contenida y rara vez conducen a la muerte en el inóculos bacterianos prescrito. Los resultados de eficacia obtenidos a partir de este modelo se correlaciona bien con los perfiles de sensibilidad in vitro, así como objetivos PK / PD definidos. Las reducciones en la carga bacteriana se observan rutinariamente para aislamientos considerados susceptibles al agente que se está probando, mientras que las exposiciones resistente considerado ningún cambio o el crecimiento bacteriano de línea de base por encima de 16, 17, 19, 24-29. Los estudios en ratas que evalúan dos quinolonas y un macrólido usando este modelo 32 han demostrado que el objetivo PK / PD requerido para un 1-log 10 reducción de S. pneumoniae en comparación con la línea base correlacionado con el objetivo determinado en ratones neutropénicos y, más importante, con objetivos clínicos para pneum bacteriana adquirida en la comunidadOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un novedoso mecanismo de antibióticos, se ensayó frente a S. pneumoniae y múltiple requiere un objetivo PK / PD similar para una reducción de 10 1-log en este modelo de infección pulmonar 31 como la requerida para una reducción de 10 1-log en el modelo del muslo neutropénico 36 cuando la penetración de pulmón fue tomada en cuenta (datos en archivo). Del mismo modo, los objetivos de PK / PD determinados en ratones para GSK2251052 contra P. aeruginosa fueron consistentes para la estasis, 1- y 2-log 10 reducciones de CFU entre este modelo de pulmón 30 y el modelo de infección del muslo neutropénico cuando la penetración de pulmón se consideró 37, 38 . Correlación con un modelo de infección pulmonar neutropenia mediante inoculación intranasal era pobre; sin embargo, GSK2251052 no produjo más de una respuesta estática en ese estudio 38. Esto puede ser atribuible a la inóculo bacteriano superior, que era 8 log 10 CFU / ratón, en comparación con 6 log <sub&gt; 10 UFC / ratón en los neutropénicos muslo 37 y la intubación endotraqueal 30 modelos. Colección de datos como esto es fundamental para la evaluación comparativa, ya que permite la comparación directa con los modelos y correlación con los datos clínicos existentes para evaluar la capacidad de predicción de traslación. Un uso más generalizado de la intubación modelo de infección pulmonar intratraqueal proporcionará datos adicionales para este tipo de análisis. Existen varias limitaciones de este modelo de neumonía inmunocompetentes. En primer lugar, no está bien adaptado a la evaluación de emergencia de la resistencia espontánea debido a la alta inóculo bacteriano requiere generalmente para este tipo de estudios resulta en una infección demasiado severa. Después de intentos para lograr cargas bacterianas de 7 u 8 log 10 UFC al inicio del estudio, la morbilidad rápida se ha observado (es decir, los animales se conviertan moribunda en menos de 24 h) a pesar de un lavado a fondo de los inóculos para eliminar toxinas pre-existente (datos en archivo). Esopuede ser posible superar este problema mediante el uso de los roedores más grandes. Las ratas, las ratas especialmente más pesados ​​(&gt; 250 g), parecen tolerar mejor superior inóculos en comparación con los ratones y pueden ser adecuados para este tipo de estudios. Una segunda limitación es que el uso de agar como una infección potenciador puede impedir usando el modelo para la evaluación de determinadas host: patógeno. Se cree que el agar proporciona un punto focal protegida hasta que la infección está plenamente establecida dentro del pulmón. Es posible administrar el inóculo en solución salina en lugar de agar para ayudar a superar este problema; sin embargo, debe tenerse en cuenta que esto sólo producirá la infección con algunas cepas. En tercer lugar, hay una curva de aprendizaje requerida para alcanzar la competencia en la técnica. El procedimiento puede ser delicado, especialmente en ratones. Es fácil de colocar por error la cánula de metal en el esófago, y la fuerza excesiva puede conducir a la punción ya sea del esófago o la tráquea. La colocación cuidadosa del inóculo es tambiénrequeridos o los animales pueden o no recuperarse o no estar infectados de manera adecuada. Sin embargo, con paciencia y perseverancia, se puede llegar a ser altamente competente y realizar la técnica con rapidez, suavidad y precisión. Al eliminar el requisito de la neutropenia, lo que aumenta la robustez y reproducibilidad, lo que permite a los investigadores estudiar más patógenos y aislados, la mejora de la flexibilidad del diseño experimental y proporcionar una infección difícil de caracterizar la farmacodinamia de la neumonía, este modelo de infección pulmonar inmunocompetentes añade un valor sustancial para el descubrimiento de antibióticos comunidad. El mayor uso de este modelo por los investigadores adicionales ayudará a proporcionar la evaluación comparativa necesaria para que pueda obtener una mayor aceptación y continuar proporcionando información de apoyo para la interpretación apropiada.

La evaluación de la eficacia de los fármacos candidatos potenciales en modelos animales de infección es un componente crítico del proceso de descubrimiento de fármacos antibacterianos. Los estudios in vivo proporcionan datos importantes para la toma de decisiones en el transcurso de los esfuerzos de descubrimiento, de elucidar las relaciones estructura-actividad (SAR) y la optimización de serie química iniciativa a través de la determinación farmacocinético-farmacodinámico (PK / PD) características de los compuestos y el apoyo a la dosis para desarrollo clínico y la aprobación reglamentaria. Numerosos modelos animales de infección se describen en la literatura para estos fines. Uno de los modelos más comunes y ampliamente utilizados es la infección neutropénica muslo del ratón, el cual fue iniciado por Eagle 1, 2 y posteriormente expandido en Vogelman y Craig 3, 4. Este modelo ha sido muy valioso para apoyar la determinación de la susceptibilidad de interrupción bacterianas y para proporcionar objetivos PK / PD guía para la dosificación humana. Hay muchos examenples donde la capacidad de predicción de este modelo se ha demostrado 4-7. Sin embargo, uno de los inconvenientes del modelo de infección del muslo es la falta de relevancia directa para las infecciones pulmonares. Ahora hay un mayor énfasis en la búsqueda de la localización de la infección en modelos animales para el sitio de la infección en los seres humanos; y por lo tanto, para estudiar compuestos para el tratamiento de la neumonía, es ideal para utilizar un modelo de infección pulmonar en los animales. Varios métodos para inducir infecciones pulmonares en los animales de laboratorio se han descrito y utilizado para los estudios de eficacia antibacteriana incluyendo inhalación intranasal, la aspiración a través de la ruta de la orofaringe, la exposición al aerosol, y la inoculación intratraqueal quirúrgica 8. En muchos casos, los animales (especialmente ratones) primero deben ser prestados neutropénica a fin de lograr una infección pulmonar robusto. A pesar de este estado gravemente inmunodeprimidos, el número de patógenos bacterianos y cepas que producen infecciones viables en roedores eslimitado. Por ejemplo, puede ser difícil de establecer con éxito Haemophilus influenzae o Acinetobacter baumannii en modelos neumonía 9, 10, e incluso más virulenta patógenos, tales como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae, puede plantear problemas 11-13. En 1991, Smith describe un modelo de infección pulmonar en ratas destetadas inmunocompetentes en los que la infección se estableció mediante la instilación de bacterias directamente a los pulmones a través de un simple método de intubación intratraqueal no quirúrgica 14. Berry et al. posteriormente modificado el método para infectar a los ratones 15. El uso de un inóculo a base de agar, esta técnica de inoculación induce infecciones pulmonares robustas en tanto en ratas inmunocompetentes y ratones con S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa y A. baumannii. Es susceptible a una amplia gama de aislados, incluyendo aquellos que alberga varios resistendeterminantes ANCE y aquellos que no producen una infección viable a través de otras vías de inoculación. También permite a la eficacia que se determinará en animales inmunocompetentes, una condición que es más relevante que el modelo tradicional de ratón neutropénico para poblaciones de pacientes que no están severamente inmunocomprometidos. La consistencia y fiabilidad de este modelo a través de múltiples patógenos y aislamientos hace que sea muy adecuado para estudios de eficacia antibacteriana.

<table><tbody><tr><td>Agar de soja TSA II Trypticase con 5% de sangre de oveja</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321261</td><td></td></tr><tr><td>Agar Chocolate II</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321267</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Caldo Modificado</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>299070</td><td></td></tr><tr><td>BBL Caldo de Soja Trypticase con 20% de Glycerol</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>297808</td><td>medios de almacenamiento para Stock congelado</td></tr><tr><td>Asa de inoculación</td><td>Nunc</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Cloruro de sodio, USP</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar Nutriente</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>213000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrífugo independiente de 30 mL con tapa</td><td>EverGreen Scientific</td><td>222-3530-G80</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico de polipropileno 30 x 115 mm</td><td>Falcon, una marca Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 14 mL de fondo redondo 17 x 100 mm</td> Falcon, una herramienta de guía <td>352059</td><td></td><td>de la marca</td></tr><tr><td></td><td>Corning Intek Services Ltd</td><td>GT01</td><td>cánula metálica hecha a medida para ratas</td></tr><tr><td>Tubo Portex de 90' Cánula</td> de plástico <td>SAI</td><td>POR-080-100</td><td>para ratas</td></tr><tr><td>Jeringa TB de 1 mL Punta deslizante</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Aguja PrecisionGlide 25 G x 5/8</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de alimentación animal - recta 20 x 3" 2-1/4</td><td>Popper and Sons, Inc</td><td>7903</td><td>utilizada para crear cánula de metal para ratones</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno intramedic</td><td>marca Clay Adams - Becton Dickinson and Company</td><td>427401</td><td>cánula de plástico para ratón&nbsp;</td></tr><tr><td>75 TN 5.0 y micro; Jeringa L 26s/2"/2</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>HPLC jeringa de inyección de vidrio Pyrex</td></tr><tr><td>, cultivo 25x150 tapón de rosca con revestimiento de goma</td><td>Corning</td><td>9825-25</td><td>para autoclave/almacenamiento cánulas metálicas</td></tr><tr><td>70% alcohol isopropílico</td><td>Vi-Jon (Swan)</td><td>NDC 0869-0810-43</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher&nbsp;</td><td>Seward</td><td>Stomacher80</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 bolsas clásicas</td><td>Seward</td><td>BA6040</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ensayo, 96 pocillos, fondo redondo</td><td>Costar, Corning Inc</td><td>3795</td><td>opcional, para dilución en serie</td></tr><tr><td>Placas Blood Omni Hardy</td><td></td><td>#A127</td><td>opcional, placas de sangre rectangulares</td></tr></tbody></table>

un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar eficacia antibacteriana contra<i&gt; s. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; h. influenzae</i&gt;,<i&gt; k. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; p. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; a. baumannii</em

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

La eficacia de los tratamientos antibacterianos candidato debe ser demostrada en modelos animales de infección como parte del proceso de descubrimiento y desarrollo, de preferencia en modelos que imitan la indicación clínica deseada. Un método para inducir infecciones pulmonares robustos en ratas y ratones inmunocompetentes se describe que permite la evaluación de los tratamientos en un modelo de neumonía grave causada por S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae o A. baumannii. Los animales se anestesiaron, y un inóculo a base de agar se deposita profundamente en el pulmón a través de la intubación intratraqueal no quirúrgica. La infección resultante es consistente, reproducible, y estable durante al menos 48 h y hasta 96 h para la mayoría de los aislados. Los estudios con antibacterianos comercializados han demostrado una buena correlación entre la eficacia in vivo e in vitro de susceptibilidad, y la concordancia entre farmacocinéticos / farmacodinámicos objetivos determinadaen este modelo y los objetivos clínicamente aceptados se ha observado. A pesar de que es una inversión de tiempo inicial en el aprendizaje de la técnica, se puede llevar a cabo con rapidez y eficacia una vez que se logra el dominio. Beneficios del modelo incluyen la eliminación del requisito de neutropenia, mayor robustez y reproducibilidad, capacidad para estudiar más patógenos y aísla, una mayor flexibilidad en el diseño del estudio y el establecimiento de una infección difícil en un huésped inmunocompetente.

Las herramientas necesarias, la orientación del animal, y la profundidad de intubación se muestran en la Figura 1. También se muestra un ejemplo representativo de colonias que crecen en una placa de agar después de la dilución en serie y el chapado por triplicado de una muestra de homogeneizado de pulmón. Un aumento de la carga bacteriana de varios log 10 CFU por encima de los controles de línea de base se observa típicamente en los pulmones infectados para aislamientos bacterianos más, incluso a 96 h después de la infección, y la variabilidad entre los animales es baja (Figura 2). Para algunos H. influenzae, puede haber poco crecimiento; Sin embargo, la infección no debe comenzar a la libre determinación dentro de un período de tiempo de 48 o 96 h (Figura 2B). Este modelo de infección pulmonar se puede utilizar durante la optimización de la serie química de plomo para apoyar SAR, como se muestra en la Figura 3 para los compuestos representativos de dos series diferentes 16, 17. Proporciona una constante y reproducible se reunióartesa para la evaluación de PK / PD en animales inmunocompetentes y se utilizó para determinar esa zona libre de drogas bajo la curva de concentración-tiempo sobre la concentración inhibitoria mínima (Fauc / MIC) correlacionado con la eficacia de un nuevo polipéptido desformilasa (PDF) inhibidor frente a S. pneumoniae y H. influenzae (Figura 4). Además, los objetivos / MIC Fauc para la inmovilización y un 1-log 10 UFC de reducción de los controles de línea de base se determinaron a través de 11 S. pneumoniae y 5 aislamientos de H. influenzae (tabla 1) 18. El acoplamiento de este modelo de infección con un sistema de administración de fármacos para volver a crear perfiles farmacocinéticos humanos en ratas crea una poderosa herramienta para la evaluación de los regímenes de dosificación humanos antes de los estudios clínicos. Un ejemplo de esto se resume en la Tabla 2, lo que demuestra que una formulación de liberación prolongada de la amoxicilina-clavulanato fue más eficaz que los regímenes de dosis existentes para los organismos con ElevaTed MIC 19 valores. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig1.jpg" /> Figura 1: La intubación intratraqueal no quirúrgica. Herramientas se muestran para la intubación de la rata (A) y el ratón (B). Una vez anestesiado, el animal debe ser colocada como se muestra en C, con la cabeza hacia la derecha y la cola a la izquierda si la persona que realiza la técnica es diestro. Coloque el dedo índice izquierdo suavemente en la garganta para ayudar a palpar los anillos traqueales para la confirmación de la colocación de la cánula correcta. El inóculo debe ser colocado profundamente en el pulmón izquierdo, como se muestra en la vista ventral de un pulmón de rata (D). Las colonias que crecen en agar después de dilución en serie y el chapado de una muestra debe ser similar al que se muestra en E. Figura 1D, Copyright © Gill Smith [Animales de Laboratorio, Volumen 25 (1991), G. Smith, Amétodo no quirúrgico simple de la instilación intrabronquial para el establecimiento de infecciones respiratorias en la rata, páginas 46 - 49] 14. Reproducido con permiso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig2.jpg" /> Figura 2: Ejemplos representativos de crecimiento bacteriano en los pulmones de los animales infectados. La media ± desviación datos CFU estándar de N = 5 animales / grupo se muestra por diversas cepas de S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) y A. baumannii (E). La primera barra de cada par (gris claro) es la línea de base bacterial carga en 1 o 2 horas después de la infección, mientras que la segunda barra es el control del crecimiento al final de su estudio a las 48 h después de la infección (gris oscuro) o después de la infección 96 h (negro). No se aplicaron métodos de censura de datos; Por lo tanto, estos resultados incluyen datos de los 5 animales por grupo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig3.jpg" /> Figura 3: Evaluación de la eficacia de diversas Serie de Productos Químicos en la optimización de plomo. modelos de infección de pulmón utilizando las técnicas descritas se utilizaron para explorar las relaciones estructura-actividad como parte del programa de topoisomerasa de tipo II no bacteriana. Compuestos prometedores 7 y 1 se evaluaron frente a las quinolonas susceptibles (A) 16 o resistente a las quinolonas(B) 17 aislamientos de S. pneumoniae, respectivamente. Cada símbolo representa CFU determina a partir de los pulmones de una rata con líneas que representan el grupo media y desviación estándar. Límite inferior de cuantificación (CII) fue de 1,7 log10 UFC / pulmones. Los compuestos se pesaron (56 ó 112 mg de molécula parental libre pura), se disolvió en 9 ml de agua estéril, se diluye 3 ml en 3 ml de agua (1: 1) y se administra por sonda oral de 1 ml / 125 g de rata dos veces al día ( 6 - 7 horas de diferencia) durante 2 días, a partir de 1 h después de la infección. los controles no tratados (NTC) fueron muestreados a 1 h después de la infección de la línea de base o tratados con solución salina y se tomaron muestras al final del estudio (48 h) para los controles de crecimiento. Figura 3A reimpreso de Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volumen 21, TJ Miles et al, Novel ciclohexil amidas como potentes agentes antibacterianos tipo de orientación bacteriana AI topoisomerasas, páginas 7483 -. 7488, Derechos de Autor (2011) 16, con permiso de Elsevier.Figura 3B reimpreso de Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volumen 26, TJ Miles et al, tricíclicos novedosos (por ejemplo GSK945237) como potentes inhibidores de tipo bacteriana AI topoisomerasas, Páginas 2464 -. 2469, Derechos de Autor (2016) 17, con permiso de Elsevier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig4.jpg" /> Figura 4: PK / PD Caracterización de un inhibidor de PDF Novel. Emax modelos fueron creados usando dosis que varía datos de eficacia en ratones inmunocompetentes con infección en el pulmón con aislamientos de S. pneumoniae (A) o H. influenzae (B) para determinar los objetivos de PK / PD para un nuevo inhibidor de PDF 18. círculosrepresentar la carga bacteriana media 4-5 ratones / grupo tratado con dosis variables de compuesto. Los análisis se realizaron para correlacionar con eficacia sin fármacos 24 h AUC (círculos abiertos) o ABC / CIM (círculos rellenos). Reproducido con permiso, Copyright © Sociedad Americana de Microbiología, [Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia, volumen 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Estasis </td><td colspan="2"> 1-log 10 de reducción </td><td></td></tr><tr><td> Organismo </td><td> MIC (g / ml) </td><td> R 2 para línea de fit (%) </td><td> Fauc </td><td> Fauc / MIC </td><td> Fauc </td><td> Fauc / MIC </td><td> Max matanza (log 10 de reducción) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10127 </td><td> 0.25 </td><td> 99.9 </td><td> 2.0 </td><td> 8.1 </td><td> 3.6 </td><td> 14.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1316009S </td><td> 0.25 </td><td> 96.1 </td><td> 6.5 </td><td> 26.0 </td><td> 15.1 </td><td> 60.3 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> ATCC10813 </td><td> 0,5 </td><td> 100 </td><td> 8.4 </td><td> 16.9 </td><td> 22.2 </td><td> 44.5 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 1307007S </td><td> 1 </td&gt; <td> 95.8 </td><td> 16.1 </td><td> 16.1 </td><td> 20.1 </td><td> 20.1 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ATCC6303 </td><td> 1 </td><td> 99.8 </td><td> 19.8 </td><td> 19.8 </td><td> 24.8 </td><td> 24.8 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1629 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 15.8 </td><td> 7.9 </td><td> 21.2 </td><td> 10.6 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> 298.443 </td><td> 2 </td><td> 99.9 </td><td> 26.5 </td><td> 13.2 </td><td> 31.0 </td><td> 15.5 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 336.808 </td><td> 2 </td><td> 86 </td><td> 8.2 </td><td> 4.2 </td><td> 19.0 </td><td> 9.5 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 338.860 </td><td> 2 </td><td> 99.5 </td><td> 2.9 </td><td> 1.5 </td><td> 6,7 </td><td> 3.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> &amp; #160; 340449 </td><td> 2 </td><td> 94.6 </td><td> 8.0 </td><td> 4.0 </td><td> 14.9 </td><td> 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> L11259 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 7.1 </td><td> 3.5 </td><td> 9.0 </td><td> 4.5 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Media ± SD </td><td> NA una </td><td> N / A </td><td> 11,0 ± 7,5 </td><td> 11,0 ± 7,9 </td><td> 17,0 ± 8,2 </td><td> 19,5 ± 17,8 </td><td> 2,3 ± 0,5 </td></tr><tr><td> Mediana </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 8.2 </td><td> 8.1 </td><td> 19.0 </td><td> 14.4 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> H. influenzae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1998-100-126H </td><td> 1 </td><td> 99.7 </td><td> 7.3 </td><td> 7.3 </td><td> 13.4 </td><td> 13.4 </td><td> 2.9 </td></tr><tr><td> 503-008H </td><td> 1 </td><td> 99.8 </td><td> 7.1 </td><td> 7.1 </td><td> 13.9 </td><td> 13.9 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 08003H </td><td> 2 </td><td> 99.9 </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16.7 </td><td> 8.3 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> H128 </td><td> 2 </td><td> 96.6 </td><td> 15.3 </td><td> 7.6 </td><td> 26.0 </td><td> 13.0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 19001H </td><td> 4 </td><td> 91.9 </td><td> 14.8 </td><td> 3.7 </td><td> 37.3 </td><td> 9.3 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Media ± SD </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 11,8 ± 4,2 </td><td> 6,6 ± 1,6 </td><td> 21,5 ± 10,2 </td><td> 11,6 ± 2,6 </td><td> 2,8 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Mediana </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16.7 </td><td> 13.0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> una NA, no aplicable. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: Objetivos de PK / PD para un inhibidor PDF Novel frente a S. pneumoniae y H. influenzae aislados. AUC libre de drogas y AUC / MIC objetivos para la inmovilización y un 1-log 10 reducción de UFC desde el nivel basal se determinaron para el 11 de S. pneumoniae y H. influenzae 5 en ratones inmunocompetentes con infección en el pulmón y tratados con el compuesto 18. el DATuna se utilizó para ayudar a las dosis humanas selectos para un desarrollo clínico. Esta tabla ha sido adaptado y reimpreso con el permiso, Copyright © Sociedad Americana de Microbiología, [Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia, volumen 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Grupo de tratamiento una </td><td colspan="8"> El promedio diario de 10 S. pneumoniae (UFC / pulmón) b ± SD para la cepa (AMX / CA MIC): </td></tr><tr><td> 05010S (2 mg / ml) </td><td> c 16001S (4 mg / ml) </td><td> 16001S (4 mg / ml) </td><td> 30005S (4 mg / ml) </td><td> 20009S (4 mg / ml) </td><td> 05003S (8 mg / ml) </td><td> 404.053 (8 mg / ml) </td><td> 47003S (8 mg / ml) </td></tr><tr><td> Controlar </strong&gt; </td><td> 7,3 ± 0,4 </td><td> 7,0 ± 0,8 </td><td> 5,7 ± 1,2 </td><td> 7.1 ± 0.7 </td><td> 7.1 ± 0.4 </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 6,8 ± 0,4 </td><td> 6,0 ± 0,3 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.000 / 125 mg dos veces (relación 16: 1) </td><td> ≤ 1,7 ** </td><td> 2,8 ± 1,2 ** </td><td> 2,2 ± 0,8 ** </td><td> 2,3 ± 0,9 ** </td><td> 2,5 ± 0,9 ** </td><td> 2,0 ± 0,9 ** </td><td> 3,8 ± 1,4 ** </td><td> 1,8 ± 0,2 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tid (relación 8: 1) </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> 2,8 ± 0,5 ** </td><td> 2,7 ± 1,3 ** </td><td> 3,3 ± 0,9 ** </td><td> 4,9 ± 0,5 ** </td><td> 6,6 ± 1,3 </td><td> 4,7 ± 0,7 ** </td></tr><tr> &lt;td&gt; 875/125 mg tid (relación 7: 1) </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> 3.0 ± 1.3 * </td><td> 2,1 ± 0,7 ** </td><td> 3,2 ± 0,4 ** </td><td> 5,2 ± 0,9 * </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 4,9 ± 0,4 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg dos veces (relación de 7: 1) </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> 4.5 ± 1.2 * </td><td> 5.6 ± 1.3 * </td><td> 5,2 ± 0,7 ** </td><td> 6,3 ± 0,7 </td><td> 6,4 ± 0,7 </td><td> 5,5 ± 0,4 </td></tr><tr><td> 500/125 mg tid (relación 4: 1) </td><td> 3,1 ± 1,3 ** </td><td> 4,5 ± 0,9 ** </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td></tr><tr><td> La azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> 5.8 ± 2.0 </td><td> 7.1 ± 0.9 </td><td> 3,1 ± 1,0 ** </td><td> 6,6 ± 0,4 </td><td> 6.07; 0,6 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td> Nuevo Testamento </td><td> Nuevo Testamento </td><td> 4,2 ± 0,8 * </td><td> 5,7 ± 0,8 * </td><td> 4,9 ± 0,8 ** </td><td> 3,0 ± 1,3 ** </td><td> 3,5 ± 0,2 ** </td><td> 3,9 ± 0,8 ** </td></tr><tr><td rowspan="2"> Grupo de Tratamiento d </td><td colspan="8"> El promedio diario de 10 H. influenzae (UFC / pulmón) ± SD para la cepa: </td></tr><tr><td colspan="4"> H128 (β-lactamasa positivo) </td><td colspan="4"> Sofá (β-lactamasa negativo, resistente a la ampicilina) </td></tr><tr><td> Controlar </td><td colspan="4"> 6,4 ± 0,6 </td><td colspan="4"> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.000 / 125 mg dos veces (relación 16: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,7 ** </td><td colspan="4"> 3,1 ± 0,9 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tid (relación 8: 1) </td><td colspan="4"> 2.1 ± 1.0 ** </td><td colspan="4"> 3,6 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg tid (relación 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,8 ± 1,3 ** </td><td colspan="4"> 3,8 ± 1,3 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg dos veces (relación de 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,8 ** </td><td colspan="4"> 5,1 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> La azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td colspan="4"> 3.2 ± 1.7 * </td><td colspan="4"> 5.8 ± 1.1 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td></tr><tr><td colspan="9"> un AMX / CA, amoxicilina-ácido clavulánico; oferta, dos veces al día; tid., tres veces al día; od, una vez al día. </td></tr><tr><td colspan="9"> b El límite de detección fue de &lt;1,7; *, Significativamente diferentes del control (P ≤ 0,05); **, Significativamente diferentes del control (P ≤ 0,01); NT, no se ha probado. </td></tr><tr><td colspan="9"> c cepa 16001S se probó en dos experimentos separados. </td></tr><tr><td colspan="9"> d amoxicilina-ácido clavulánico 500/125 mg (4: 1) tres veces al día no fue probado contra las cepas de H. influenzae. </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Eficacia de los perfiles de exposición Recreated plasma humano para diferentes amoxicilina / clavulanato regímenes de dosificación. Los datos generados en ratas inmunocompetentes con infección en el pulmón con aislamientos de S. pneumoniae o H. influenzae utilizando este modelo demostraron que una formulación mejorada de amoxicilina-ácido clavulánico (2, 000/125 mg dos veces al día) fue más eficaz que los regímenes de dosificación estándar frente a aislados con elevada susceptibilidad in vitro 19. Esta tabla ha sido adaptado y reimpreso con el permiso, Copyright © Sociedad Americana de Microbiología, [Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia, volumen 49, 2005, páginas 908 - 915] 19.

Se describe un método para establecer infecciones pulmonares en roedores inmunocompetentes. Con habilidad, este método se puede realizar rápida y fácilmente para inducir una infección estable con muchos aislados de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae y A. baumannii.

Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

El objetivo general de este procedimiento no quirúrgico de infección intrabronquial es establecer una neumonía bacteriana robusta en roedores inmunocompetentes. Este método añade valor para el descubrimiento y desarrollo de antibacterianos al permitir evaluar la eficacia de posibles tratamientos en un modelo inmunocompetente de neumonía grave. La principal ventaja de esta técnica, es que establece una infección pulmonar robusta y reproducible con muchos aislados, incluyendo aquellos que típicamente requieren que los animales sean neutropénicos o aislados que no producen una infección viable con otros métodos.Por lo general, las personas nuevas en este procedimiento tendrán dificultades. La intubación adecuada es un procedimiento ciego que requiere aprender a sentir correctamente para intubar la tráquea en lugar del esófago. La intubación adecuada es diferente para cada científico.Es posible que el ángulo exacto de la cánula no sea el mismo para todos. La clave es palpar las crestas de la tráquea. Demostrando esta técnica, estará Cindy Mininger, científica de nuestro laboratorio.Para comenzar, prepare suspensiones de bacterias salinas a partir de cultivos de caldo durante la noche, como se indica en el protocolo de texto, o de placas de agar, como se muestra aquí. Coseche el crecimiento durante la noche de las placas de agar mediante el uso de un bucle estéril para raspar las colonias de la superficie. Transfiera el material cosechado a cinco mililitros de solución salina estéril hasta obtener una suspensión turbia y opaca, y vórtice suavemente el cultivo hasta que sea homogéneo.Diluya en serie, luego y coloque una alícuota de cada dilución de acuerdo con el protocolo de texto. Después de preparar el agar y ensamblar las herramientas necesarias para el proceso de infección, de acuerdo con el protocolo de texto, alícuota nueve mililitros de agar en un tubo estéril y luego coloque el tubo en el baño de agua hasta que el agar se equilibre a aproximadamente 42 grados Celsius. Agregue un mililitro de la suspensión de bacterias salinas previamente preparada en el tubo de agar.Luego, invierta el tubo varias veces para mezclar y devolverlo al agua. Coloque una alfombra limpia y desechable sobre la superficie de trabajo cerca del baño de agua. Para preparar la superficie de trabajo y el dispositivo de intubación, primero esterilice la cánula metálica y el tubo de polietileno de acuerdo con el protocolo de texto y luego transfiéralo en su tubo de almacenamiento de vidrio a la superficie de trabajo.Luego, retire la tapa del tubo de almacenamiento y deslice el extremo del mango de la cánula hasta el extremo abierto del tubo. Con pinzas estériles, retire un trozo de tubo de polietileno del vaso de precipitados e insértelo a través del interior de la cánula metálica estéril, asegurándose de que se mueva libremente. Coloque una marca guía en un lugar predeterminado con un bolígrafo indeleble.A continuación, coloque una aguja estéril desechable de calibre 25 en el extremo libre del tubo de polietileno deslizando la aguja varios milímetros dentro del tubo. Luego, use una solución salina estéril para llenar una jeringa desechable nueva de un mililitro. Conecte la jeringa a la aguja colocada en el tubo de polietileno y enjuague todo el volumen de solución salina a través del tubo.Deseche la jeringa usada en el recipiente para objetos punzocortantes. Luego, llene una nueva jeringa desechable estéril de un mililitro con el inóculo a base de agar del baño de agua. Vuelva a colocar la aguja y el tubo de calibre 25 y enjuague el agar a través del tubo presionando el émbolo hasta que el tubo esté completamente lleno de agar.Después de anestesiar a la rata de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al animal en posición supina sobre la alfombra desechable con la cabeza hacia la derecha y la cola hacia la izquierda. A continuación, inserte el extremo libre de la cánula metálica en la boca del animal. Gire la cánula de modo que el extremo libre quede inclinado hacia arriba y acelere suavemente hacia la tráquea, evitando con cuidado las estructuras laríngeas con un ligero movimiento de torsión.Confirme la inserción en la tráquea, en lugar de en el esófago, deslizando suavemente la cánula ligeramente hacia adelante y hacia atrás varias veces mientras usa el dedo índice izquierdo para palpar los anillos traqueales. Para asegurar la intubación en la tráquea, y no en el esófago, mueva la cánula ligeramente hacia adelante y hacia atrás y palpe las crestas. Si la cánula se desliza suavemente por la garganta y no se pueden sentir las crestas, retire el dispositivo y vuelva a intentarlo.Cuando la cánula llegue a la bifurcación donde la tráquea se divide en los bronquios izquierdo y derecho, haga un ligero movimiento de torsión hacia el lado izquierdo del animal para asegurarse de que la cánula se inserte en el bronquio izquierdo. Un error común es no colocar los inóculos lo suficientemente profundo en el pulmón, lo que puede bloquear las vías respiratorias e inhibir la respiración. Cuando la cánula se gira al ángulo adecuado, debe deslizarse fácilmente hacia el bronquio izquierdo y avanzar suavemente hasta la profundidad adecuada.Avance la cánula metálica hasta que el extremo esté a mitad de camino o tres cuartos del pulmón izquierdo, utilizando la marca guía colocada anteriormente para confirmar que se ha alcanzado la profundidad adecuada. Con la cánula metálica en su lugar, avance el tubo de polietileno varios milímetros utilizando la marca guía previamente colocada en el tubo para asegurarse de que avance solo lo suficiente como para salir del extremo de la cánula metálica y no perforar el pulmón. Con ambas cánulas en su lugar, use la jeringa adjunta para instilar 100 microlitros de suspensión de agar profundamente en el lóbulo grande del pulmón izquierdo.Retire varios milímetros del tubo y retire suavemente el dispositivo de intubación intacto. Vuelva a colocarlo en el tubo de almacenamiento de vidrio y mueva al animal a una jaula nueva para que se recupere. Prepare la superficie de trabajo y la cánula como se acaba de demostrar para las ratas, utilizando el equipo del tamaño adecuado para ratones.Utilice una jeringa desechable estéril de 1 mililitro y una aguja estéril de calibre 25 para llenar la jeringa de microinyección de vidrio con solución salina estéril. Luego, enjuague la solución salina a través del dispositivo reensamblado. A continuación, utilice una nueva jeringa estéril desechable de un mililitro y una aguja estéril de calibre 25 para llenar la jeringa de microinyección con el inóculo de agar.Luego, vuelva a ensamblar el dispositivo y enjuague el agar a través del tubo hasta que el tubo esté completamente lleno de agar. Después de anestesiar al ratón de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al animal en la misma orientación que se mostró para la rata y use una presión constante pero suave para intubar la tráquea de manera similar a como lo hace con la rata. Evite el uso de la fuerza, ya que la técnica es más delicada en ratones.Asegúrese de que la cánula se inserte en la tráquea palpando los anillos traqueales. Gire ligeramente y avance la cánula hacia el bronquio izquierdo, insertándola profundamente en el pulmón utilizando las marcas guía previamente colocadas. Con la cánula metálica en su lugar, avance el tubo de polietileno varios milímetros e instilar 20 microlitros de suspensión de agar.Aquí se muestra un ejemplo representativo de colonias que crecen en una placa de agar después de la dilución en serie y la siembra por triplicado de una muestra de homogeneizado pulmonar. Como se demuestra en este gráfico con S. pneumoniae, se observa típicamente un aumento en la carga bacteriana de varias UFC de base logarítmica diez por encima de los controles basales en los pulmones infectados para la mayoría de los aislados bacterianos, incluso a las 96 horas después de la infección, y la variabilidad entre animales es baja. En este experimento, se evaluaron dos compuestos frente a aislados de S. pneumoniae susceptibles a quinolonas o resistentes a las quinolonas para ilustrar que este modelo de infección pulmonar se puede utilizar durante la optimización de una serie química principal para apoyar las relaciones de actividad estructural.Cada símbolo representa UFC determinada a partir de los pulmones de una rata. Aquí se muestran modelos E max creados utilizando datos de eficacia de rango de dosis en ratones inmunocompetentes infectados en el pulmón con aislados de S. pneumoniae o H. influenzae para determinar objetivos farmacocinéticos y farmacodinámicos para un nuevo inhibidor de la deformilasa polipeptídica. Los círculos representan la carga bacteriana media de cuatro a cinco ratones por grupo tratados con dosis variables de compuesto.Los círculos abiertos representan el área libre bajo la curva y los círculos rellenos representan el área bajo la curva de tiempo de concentración sobre la concentración inhibitoria mínima. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en unos 30 segundos por animal, con hasta cinco o seis animales inoculados por jeringa de inóculo de agar. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar este método de infección intrabronquial no quirúrgico y poder utilizarlo para establecer infecciones pulmonares con muchos aislados bacterianos diferentes.Instrumental energético

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Research

Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Lenhard, A. et al. Un modelo murino para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad agravada por la edad. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo muestra un modelo de coinfección en ratones en el que el virus de la gripe desencadena la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno. Detalla los pasos implicados en la colonización bacteriana, la infección viral y la progresión de la enfermedad.

Un modelo murino para estudiar la transición patógena de Streptococcus pneumoniae tras la coinfección viral

Este video demuestra el establecimiento de una infección pulmonar en un modelo de roedor inmunocompetente a través de la intubación y la instalación de suspensiones bacterianas en los lóbulos pulmonares. Este modelo permite realizar estudios de eficacia antibacteriana en animales inmunocompetentes.

Instilación intrabronquial de Streptococcus pneumoniae en modelos de roedores inmunocompetentes

Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

Hemos desarrollado un modelo de lesión pulmonar en ratón mediante inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo imita la lesión pulmonar durante la neumonía y es clínicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes en humanos. Un modelo apropiado en vivo es fundamental para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica de la novela. Con este modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea, uno puede examinar la patogenesia y nuevos tratamientos contra las infecciones mortales.

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Aquí, presentamos métodos para mejorar los estudios secundarios de neumonía bacteriana proporcionando una vía no invasiva de instilización en el tracto respiratorio inferior seguida de recuperación de patógenos y análisis de transcripción. Estos procedimientos son reproducibles y se pueden realizar sin equipos especializados como cánulas, cables guía o cables de fibra óptica.

Un sistema preciso de entrega y recuperación de patógenos para modelos murinos de neumonía bacteriana secundaria

Este manuscrito describe el establecimiento de un modelo infeccioso de neumonía en ratones y la respectiva caracterización de la resolución de lesiones junto con métodos para el crecimiento de bacterias y la instilación intratraqueal. También se describe un enfoque novedoso que utiliza citometría de flujo de alta dimensión para evaluar el panorama inmunitario.

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Este artículo describe un nuevo modelo de ratón para la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Este modelo se puede adaptar fácilmente para estudiar las interacciones polimicrobianas y huésped-patógeno durante las diferentes fases de la progresión de la enfermedad y entre varios huéspedes.

Un modelo de ratón para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad exacerbada por la edad

Los ratones son generalmente resistentes a las infecciones por Mycobacterium abscessus, lo que complica el descubrimiento y desarrollo de antibióticos muy necesarios contra las infecciones pulmonares. Aquí, describimos un método de preparación de inóculo e infección intratraqueal que demostró producir una infección sostenida en ratones inmunocompetentes.

Preparación de Mycobacterium abscessus incrustado en perlas de agar para inocular ratones inmunocompetentes por vía intratraqueal

Aprende a establecer neumonía bacteriana en roedores inmunocompetentes mediante intubación intrabronquial no quirúrgica. Este método permite evaluar la eficacia de tratamientos antibacterianos en un modelo relevante de infección pulmonar severa.

Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii (Video) | JoVE Journal

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