Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

El objetivo general de este protocolo es evaluar los efectos de los nutrientes suplementarios en un modelo murino de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología intestinal sobre el desarrollo de la ciencia clínica en toda la dirección del experimento modelo de colitis. Las principales ventajas de esta técnica son que es de bajo costo, no requiere equipos sofisticados y proporciona un análisis claro de la morfología de todo el colon.

Este método se puede utilizar para evaluar el estrés oxidativo en el colon como consecuencia de un reclutamiento excesivo de neutrófilos. Para la administración de suplementos nutricionales por sonda nasogástrica, primero sujete manualmente al ratón por el pescuezo, colocando la cola entre el tercer dedo y la base del pulgar. A continuación, sosteniendo el ratón en posición vertical, inserte la aguja de sonda nasogástrica en el lado izquierdo de la boca del animal y siga cuidadosamente el paladar para localizar el esófago.

Si no encuentra resistencia, avance la aguja hacia el estómago. Administre lentamente todo el volumen del suplemento, seguido de una extracción cuidadosa de la jeringa y mida el peso corporal del animal. Asigne una puntuación de cero a cuatro de acuerdo con el porcentaje de pérdida de peso, luego recoja una muestra de heces frescas y use los aplicadores provistos para aplicar una capa delgada de muestra en un portaobjetos de un kit de prueba de sangre oculta en heces con guayaco.

Cierre la tapa en la parte frontal del kit y abra la ventana trasera para aplicar dos gotas de la solución reveladora en la parte posterior de la ubicación de la muestra. Lea los resultados después de 30 segundos, asignando una puntuación de cero a cuatro dependiendo de la intensidad de la señal. A continuación, observe una segunda muestra de heces frescas para evaluar la consistencia de las heces, asignando una puntuación de cero a cuatro, según corresponda.

Para determinar la permeabilidad epitelial intestinal in vivo, se coloque un animal anestesiado en posición supina y se realice una incisión en la línea media para exponer los intestinos. Localiza el ciego y haz una pequeña incisión en el segmento proximal del colon ascendente. Luego inserte una aguja de alimentación de calibre 22 y asegure la aguja con una ligadura de hilo de seda común.

Enjuague cuidadosamente un volumen abundante de PBS a través de la aguja para enjuagar todas las heces del colon, seguido de la instalación de la solución azul de Evans hasta que el tinte llegue al ano. Después de 15 minutos, enjuague la sonda con un volumen excesivo de PBS hasta que el lavado perianal esté limpio. A continuación, extirpe el colon y enjuague el tejido con más PBS, seguido de un mililitro de N-acetilcisteína de seis milimolares para eliminar cualquier tinte que se adhiera a la mucosidad colónica.

Ahora corte el colon longitudinalmente y enjuague el tejido una vez más con PBS y N-acetilcisteína, luego registre el peso y la longitud del colon y coloque el tejido en dos mililitros de N, N-dimetilformamida a temperatura ambiente con agitación suave para extraer el tinte restante, midiendo las concentraciones de colorante espectrofotométricamente a 610 nanómetros a la mañana siguiente. Después de siete días de sulfato de dextrano sódico, o colitis inducida por DSS, diseccione todo el colon y registre su longitud. En el caso de los rollos suizos, abra el colon longitudinalmente, retire con cuidado cualquier materia fecal y use un palo de madera delgado y redondo o pinzas de punta fina para enrollar el tejido con la mucosa hacia adentro.

A continuación, coloque cuidadosamente el tejido dentro de un casete de inclusión, seguido de la fijación con cinco mililitros de formaldehído al 10% a temperatura ambiente. Es fundamental enrollar el colon firmemente sin doblarlo para evitar problemas durante el corte del tejido, lo que podría resultar en un daño tisular clínico y una falsa interpretación como daño asociado a la colitis. Después de 48 horas, lavar la muestra con agua del grifo durante 18 horas, seguido de una deshidratación mediante una serie de etanol.

Después de la última inmersión absoluta en etanol, tratar el tejido con cuatro incubaciones de una hora en xileno. Después de la última inmersión en xileno, coloque la muestra en 50 mililitros de parafina líquida durante una incubación de 17 horas y otra de tres horas. Al final de la incubación de tres horas, sumerja la muestra en un molde de plástico cuadrado de 22 milímetros cúbicos en ocho a 10 mililitros de parafina líquida fresca durante 24 horas.

Cuando la parafina se haya solidificado, use un micrótomo para adquirir secciones de tejido de cinco micras de espesor, luego sumerja brevemente las secciones transversales en un baño de agua de un litro que contenga 0.3% de gelatina e inmediatamente monte las muestras en portaobjetos de vidrio tratados con polilisina para la tinción de H&E. Para el análisis del estrés oxidativo, primero cree una barrera alrededor del tejido con un bolígrafo hidrofóbico. A continuación, incube secciones criotransversales de tejido de ocho micras en cinco DHE micromolares disueltos en agua durante 30 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad.

La incubación es seguida por tres lavados de 15 minutos en PBS con agitación suave a temperatura ambiente. Seque las muestras al aire y agregue una gota de medio de montaje para proteger la fluorescencia. A continuación, observe la fluorescencia de etidio oxidado en un microscopio confocal de barrido láser con un aumento de 40x.

El tratamiento con DSS conduce a un índice de actividad de la enfermedad en continuo aumento como se esperaba, alcanzando una puntuación máxima en el séptimo día después de la inducción. La suplementación con dieta antiinflamatoria retrasa la aparición temprana de la colitis, mientras que los efectos protectores son solo marginales en momentos posteriores. La intervención dietética también puede prevenir los aumentos de la permeabilidad epitelial intestinal inducidos por el DSS, así como el acortamiento de la longitud del colon.

La tinción con hematoxilina y eosina de los tejidos del colon distal incluidos en parafina revela que las muestras de control muestran una morfología normal, mientras que los animales tratados con DSS muestran los signos típicos de colitis. Cabe destacar que el tratamiento paralelo con suplementación dietética alivia claramente los cambios morfológicos inducidos por la colitis con una morfología general similar a la del grupo control. La tinción con inmunofluorescencia del tejido distal del colon también indica que las moléculas de unión inadherentes apretadas se internalizan durante la colitis inducida por DSS y que la colocalización de estas proteínas se pierde en parte en los contactos de las células epiteliales de la cripta.

Es importante destacar que esta internalización se reduce cuando los ratones tratados con DSS reciben el suplemento dietético antiinflamatorio y antioxidante. Además, el reclutamiento robusto de neutrófilos en el colon en respuesta a la colitis inducida por DSS se contrarresta con la suplementación de la dieta, lo que resulta en la mejora concomitante del estrés oxidativo inducido por neutrófilos y una ligera reducción en la producción de citocinas inflamatorias. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las mediciones de la cámara de supuración, para analizar la resistencia eléctrica de la barrera epitelial en el colon.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la investigación de la colitis y la exploración del mecanismo molecular de la patogénesis de la colitis ulcerosa en un modelo de ratón reproducible. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar el desarrollo de la colitis y los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones de la barrera epitelial intestinal. No olvide que trabajar con animales vivos requiere el cumplimiento de altos estándares éticos para evitar sufrimientos innecesarios.