Name: Murino de grosor completo Trasplante de Piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende el trasplante de piel de espesor completo en ratones para estudiar respuestas aloinmunes y rechazo de injertos. Este modelo reproducible permite evaluar la tolerancia donante-específica mediante inspección directa.

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Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R01AI077610.

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de la Universidad Johns Hopkins y Uso Animal Care (JHUACUC). Los procedimientos específicos se realizaron bajo la MO13M292 protocolos ACUC aprobado y MO13M370. 1. Donantes de la cosecha de la piel <ol><li> Anestesiar el ratón donante con isoflurano (vaporizador de inducción en el 4%, el mantenimiento con un 1 - 2% a través del cono del ratón). Utilice el dedo del pie retirada pizca reflejo para controlar la profundidad de la anestesia. </li><li> El uso de una máquina de afeitar eléctrica, afeitarse la parte posterior del animal y desinfectar con 10% de yodo de povidona (por ejemplo, Betadine). </li><li> Con unas tijeras estériles, guantes y una técnica aséptica, piel de la espalda de los donantes de la cosecha desde la cadera hasta el cuello, con disección roma a nivel del tejido conjuntivo laxo. </li><li> La eutanasia a los animales por dislocación cervical después de cosechar elinjerto de piel. </li><li> Bajo el microscopio, separar el tejido conjuntivo, tejido graso, y panículo carnoso de la piel de la espalda con unas tijeras finas tenotomía. El panículo carnoso es un músculo delgado, transparente responsable de los movimientos espasmódicos de la piel. </li><li> Utilizando una técnica estéril instrumentos, cortar los injertos de 15 mm x 15 mm de la piel de la espalda para una de 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm lecho del injerto. </li><li> Guarde los injertos sobre gasas empapadas con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri en hielo. NOTA: 8 - 10 injertos se puede obtener de un ratón donante. </li></ol> 2. receptor de trasplante de piel <ol><li> Anestesiar al ratón receptor con isoflurano (vaporizador inducción a 4%, el mantenimiento con un 1 - 2% a través del cono del ratón). Utilice el dedo del pie retirada pizca reflejo para controlar la profundidad de la anestesia. </li><li> Administrar 0,02 mg / kg de peso corporal de buprenorfina para el alivio del dolor postoperatorio. </li><li> Afeitar el lado de la espalda del animal en el que el wi injertoll ser insertada y desinfectar con povidona yodada al 10%. </li><li> Con unas tijeras, corte a 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm cuadrado de piel. El tamaño del defecto debe ser ligeramente mayor (10%) que el injerto. Cortar tan superficialmente como sea posible. Tenga cuidado de preservar el panículo carnoso y vasos. El panículo carnoso puede ser distinguida de la fascia subyacente por su movilidad y los vasos sanguíneos que se ejecutan superficial a ella. </li><li> Coloque el injerto en el lecho del injerto, evitando pliegues a lo largo de los bordes. </li><li> Coloque 8 puntos de sutura en las esquinas y en el centro de cada borde. Para cada sutura, pasar la aguja a través del injerto y luego a través del panículo carnoso del injerto cama debajo de la piel destinatario circundante. </li><li> Retire la máscara anestésica y dejar que el animal se recupere de la anestesia parcialmente antes de aplicar el vendaje adhesivo. </li><li> Envolver el ratón receptor con una venda adhesiva con una gasa doblada sobre el injerto. Hacer el vendaje mediante la combinación de dos vendajes, cortandola parte adhesiva de una y la colocación de las dos almohadillas absorbentes juntos. </li><li> Vigilar estrechamente el ratón durante la recuperación para asegurar que el vendaje no está restringiendo la excursión del tórax y la respiración. Quitar el vendaje si el ritmo respiratorio disminuye o el animal empieza a jadear o respirar superficialmente. </li></ol> 3. Cuidado posoperatorio <ol><li> Administrar enrofloxacina 5 mg / kg después de la cirugía para la profilaxis de infección. </li><li> Coloque el ratón trasplantado en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica para microondas hasta que se recupere completamente de la anestesia. </li><li> Observar el ratón durante 1 hora después de la operación antes de devolverlo a la instalación de la vivienda. </li><li> Siete días después de la cirugía, anestesiar el ratón como en el paso 2.1. Retire el vendaje cortando sólo a través de la parte ventral de la venda. </li><li> Observar y palpar el injerto al día siguiente en busca de signos de formación de costras, la contracción, o dureza. Si está presente, el injerto puede no haber logrado vasculariza adecuadación y debe ser considerado como un fallo técnico. </li><li> Supervisar diariamente para detectar signos de rechazo. Considere injertos rechazado cuando ≥90% del tejido de injerto se vuelve necrótico. </li><li> La eutanasia a los animales rechazados y les cosechar para su análisis. </li></ol>

<ol><li>Furtmuller, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Hind+Limb+Transplantation+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Oh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microsurgical+Model+for+Heterotopic%2C+En+Bloc+Chest+Wall%2C+Thymus%2C+and+Heart+Transplantation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
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<li>Pollizzi, K. N., Powell, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+canonical+and+metabolic+signalling+programmes+in+the+regulation+of+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses.</a> Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342, 1242454(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde su introducción por Medawar, primero en estudios humanos y luego en conejos y ratones, el trasplante de piel ha sido un modelo inestimable para el estudio de las respuestas inmunes alogénicas 6,7. En este manuscrito, se presenta un modelo de gran escala, no vascularizado, el trasplante de piel de grosor usando de nuevo la piel superior e inferior. Varios métodos alternativos, incluyendo el uso de la piel de la cola o piel de la oreja del ratón como fuente de tejido de injerto, se ha informado hasta la f...

El trasplante de órganos es el tratamiento de elección para pacientes con insuficiencia orgánica terminal, y los resultados han mejorado notablemente con los avances en procedimientos quirúrgicos y protocolos de inmunosupresión. Sin embargo, la inmunosupresión a largo plazo se asocia con efectos secundarios significativos, y el desarrollo de nuevas estrategias que promueven la tolerancia sigue siendo el objetivo de la investigación trasplante moderna. Numerosos modelos animales se han desarrollado para la investigación básica en el trasplante, para el estudio de los mecanismos de rechazo de aloinjertos y para poner a prueba la inmunosupresión se aproxima a la prevención del rechazo del injerto y para promover la tolerancia a largo plazo 1-3. Los modelos de ratón han convertido en el pilar de la investigación inmunológica debido a la disponibilidad exclusiva y extensa de anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico y cepas puras y transgénicos bien definidos. El trasplante de piel es un procedimiento simple que no requiere conocimientos especiales de microcirugía y puedemonitorizar fácilmente después de la operación. En conjunto, el trasplante de piel de ratón ha sido una herramienta excepcional para estudiar muchos aspectos implicados en la respuesta aloinmune, incluyendo la entrega de antígeno, el tráfico de células y la destrucción del tejido durante el rechazo de injerto 4,5. Aquí, se muestra el procedimiento paso a paso para el trasplante de piel de espesor total usando el modelo de ratón, y se describen los pasos son importantes y necesarias para un éxito del injerto de la piel trasplantada.

<table><tbody><tr><td>Micropinzas rectas</td><td>Sigma</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>Micropinzas curvas</td><td>Aesculap</td><td>BD333R</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de tenotomía Stevens curvas</td><td>Aesculap</td><td>BC905R</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección Mayo Sigma</td><td></td><td>S3146</td><td></td></tr><tr><td>Micro portaagujas</td><td>Aesculap</td><td>BM563R</td><td></td></tr><tr><td>Gasa estéril</td><td>Covidien</td><td></td><td></td>441218</tr><tr><td>6-0 Sutura de nylon</td><td>MWI</td><td>31849</td><td></td></tr><tr><td>Banda de tiras de plástico&#45; Ayuda</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td>Obtenido de la farmacia</td></tr><tr><td>10 cm Placa de Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Calidad Biológica 119069131</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td>Número DEA requerido; Obtenido de la farmacia del hospital</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer Health Care</td><td>186599</td><td></td></tr></tbody></table>

murino de grosor completo trasplante de piel

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murino de trasplante de todo el espesor de la piel es un modelo in vivo bien establecido para estudiar la respuesta aloinmune y rechazo del trasplante. A pesar de su aplicación limitada a los seres humanos, el trasplante de piel en ratones ha sido ampliamente empleado para la investigación del trasplante. El procedimiento es fácil de aprender y realizar, y que no requiere técnicas de microcirugía delicada ni una amplia formación. Además, el rechazo del injerto en este modelo se produce en una reacción inmunológica muy reproducible y se monitoriza fácilmente mediante la inspección directa y palpación. Además, el trasplante de piel secundaria con injertos de donantes emparejados o de la piel de otro fabricante puede llevar a cabo en modelos de trasplante más complejos como un método alternativo y sin complicaciones para evaluar la tolerancia específica del donante. Las complicaciones son bajos y son, en general, limitada a una sobredosis de anestesia o dificultad respiratoria después del procedimiento. El fracaso del injerto, por el contrario, se produce habitualmente como resultado de una mala preparación de la grpopa, posicionamiento incorrecto en el lecho del injerto, o la colocación inadecuada de la venda. En este artículo, se presenta un protocolo para el trasplante de piel de espesor completo en ratones y describimos los pasos son importantes y necesarias para el éxito del procedimiento.

La colocación del vendaje en el ratón receptor es un paso importante del procedimiento. El injerto de piel se coloca en el tronco receptor, entre el hombro, cadera y columna vertebral (Figura 1). El vendaje se hace con una gasa plegada y la combinación de dos vendas adhesivas de plástico. El ratón receptor se coloca con el injerto hacia abajo sobre la gasa en el centro de la venda. El uso de dos pinzas de micro curvas, el extremo inferior del vendaje se tira primero, y l...

Murino de trasplante de todo el espesor de la piel es un modelo bien establecido para estudiar el rechazo en un entorno aloinmune. A continuación, ofrecemos un tutorial de cada paso que participan en la realización de un c BALB / -&gt; C57BL 6 trasplante de piel / de espesor total.

Murino de grosor completo Trasplante de Piel

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

El objetivo general de este artículo en video es realizar un trasplante de piel de espesor total y describir los pasos importantes necesarios para un procedimiento exitoso. El trasplante de piel de espesor total en ratones es un modelo bien establecido para estudiar las respuestas aloinmunes y el rechazo del injerto. El procedimiento es fácil de realizar y no requiere técnicas microquirúrgicas delicadas.El rechazo del injerto, en este modelo, ocurre como una reacción inmunológica muy reproducible y se puede monitorear fácilmente mediante inspección directa y palpación. Además, se pueden realizar trasplantes cutáneos secundarios con injertos de piel compatibles con el donador o de terceros para crear modelos de trasplante más complejos, como un método alternativo y sencillo para evaluar la tolerancia específica al donador. Después de anestesiar un ratón donador según el protocolo descrito, utilice una maquinilla eléctrica para afeitar la espalda del animal.Y, con povidona- yodo al 10 %, desinfecte la piel. Mediante tijeras y disección romo, obtenga la piel dorsal donante desde la cadera hasta el cuello a nivel del tejido conectivo areolar. Coloque la piel dorsal bajo un microscopio y use tijeras de tenotomía finas para separar el tejido conectivo y el panniculus carnosus de la piel.Corte injertos de 15 por 15 milímetros de la piel dorsal para un lecho de injerto de 10 por 10 a 15 por 15 milímetros. Almacene los injertos sobre gasa empapada con PBS en una placa de Petri, y colóquela sobre hielo. Anestesie el ratón receptor según el protocolo descrito en el texto.Afeite el lado de la espalda del animal, donde se insertará el injerto, y luego administre 0,02 miligramos por kilogramo de buprenorfina para aliviar el dolor postoperatorio. Utilice povidona-yodo al 10% para desinfectar el área. Con tijeras, y de manera lo más superficial posible, corte un cuadrado de piel de 10 por 10 a 15 por 15 milímetros.Tenga cuidado de preservar el panniculus carnosus y los vasos sanguíneos que corren superficialmente a él. A continuación, coloque el injerto sobre el lecho del injerto, evitando pliegues a lo largo de los bordes. Luego, coloque ocho suturas en las esquinas del injerto y en el punto medio de cada borde, pasando la aguja a través del injerto y luego a través del panniculus carnosus del lecho del injerto, debajo de la piel receptora circundante.Coloque una gasa doblada sobre un vendaje doblado y luego posicione al animal sobre el vendaje, con el lado del injerto hacia abajo, retirando la máscara anestésica para permitir que el animal recupere parcialmente la conciencia. A continuación, envuelva el vendaje alrededor del animal. El factor más crítico en el proceso de injerto es la revascularización del tejido injertado mediante el crecimiento de los vasos del hospedador hacia el injerto.La disección del panniculus carnosus y la colocación correcta del vendaje son los pasos más importantes. Inmediatamente después de la cirugía, administre 5 miligramos por kilogramo de enrofloxacina para la profilaxis de infecciones. Coloque el ratón trasplantado en una jaula limpia hasta que se recupere completamente de la anestesia.Observe al ratón durante una hora después de la cirugía, antes de devolverlo al alojamiento. Supervise cuidadosamente al ratón durante la recuperación para asegurarse de que el vendaje no restrinja la excursión del tórax ni la respiración. Ocho días después, observe y palpe el injerto en busca de signos de costra, contracción o endurecimiento.Si alguno de estos signos está presente, es posible que el injerto no haya logrado una vascularización adecuada y debe considerarse un fracaso técnico. Monitoree el injerto diariamente en busca de signos de rechazo. Considere que los injertos han sido rechazados cuando el tejido del injerto presenta necrosis en un 90% o más.En los modelos de incompatibilidad completa, los injertos de piel de espesor total suelen rechazarse entre los ocho y doce días. En los modelos de incompatibilidad menor, las respuestas de rechazo son más lentas, más variables, y la apariencia del injerto de piel se caracteriza por cambios menos evidentes, como la contracción o la pérdida de vello. El rechazo agudo del injerto generalmente comienza con hinchazón y eritema del injerto.Estos eventos van seguidos de desecación del injerto, formación de costra y retracción, como se observa aquí. Dependiendo del grado de desajuste del MHC y del protocolo de inmunosupresión, el rechazo puede ocurrir mediante un proceso subagudo marcado por cambios sutiles, como la pérdida de vello, pigmentación, crestas dérmicas y volumen del injerto. En estos casos, un injerto rechazado aparece brillante, blanco y sin vello, con bordes irregulares.Utilizando BALB/c como donantes y C57 black 6 como receptores, se observó que la inhibición de la glucólisis y la fosforilación oxidativa, o del metabolismo de la glutamina por separado, prolongó la supervivencia del injerto cutáneo. Sin embargo, bloquear simultáneamente las tres vías produjo un aumento significativo en la supervivencia del injerto. Además, la terapia metabólica triple fue más efectiva que la ciclosporina convencional o la rapamicina.Además, la histología de los injertos de piel del grupo con terapia metabólica mostró una alineación tisular más intacta y un infiltrado inflamatorio linfocítico menor, en comparación con el tejido no tratado. Los resultados en trasplantes de órganos han mejorado notablemente con los avances en procedimientos quirúrgicos y en protocolos de inmunosupresión. Sin embargo, la inmunosupresión a largo plazo se asocia con efectos secundarios significativos, y el desarrollo de nuevas estrategias que promuevan la tolerancia sigue siendo el objetivo de la investigación moderna en trasplantes.Es bien conocida la importancia del metabolismo en la regulación de los linfocitos T. Al inhibir la glucólisis, la fosforilación oxidativa y el metabolismo de la glutamina, logramos aumentar significativamente la supervivencia del injerto alogénico. Este enfoque novedoso fue más efectivo que la terapia convencional y representa un cambio de paradigma en el enfoque potencial para la regulación inmunitaria y el trasplante.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Alogénico de piel el trasplante es un modelo estándar de ensayo de las respuestas de acogida de las células T a los antígenos MHC-donantes dispares. Este vídeo-artículo proporciona un tutorial visual de cada paso involucrado en la realización de un trasplante de BALB/c--&gt; C57BL / 6 la piel.

Trasplante de piel murina

En este informe se describe la piel en tres dimensiones reconstruir el modelo que imita la piel humana en la arquitectura y la composición. Fisiología de los melanocitos, la progresión del melanoma y el destino de las células madre dérmicas han sido investigados con la piel reconstruir el modelo. El modelo es también útil como una herramienta para la evaluación preclínica de medicamentos.

La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

Este video muestra un método para injertar piel humana en un ratón inmunodeficiente con una respuesta de neutrófilos suprimida. El método consiste en aplicar piel humana de espesor dividido al lecho de injerto del ratón, sellarlo y cubrirlo para su recuperación. Eventualmente, la piel humana se adhiere a la piel del ratón, estableciendo la vascularización y la circulación, lo que resulta en un xenoinjerto de piel exitoso.

Una técnica para el injerto de piel humana en un modelo de ratón

La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

El trasplante de piel de cola es un poderoso modelo para estudiar el rechazo dependiente de las células T y la inducción de tolerancia durante las respuestas inmunes alogénicas en ratones. Las ventajas de este protocolo son la cirugía invasiva menor y la facilidad de seguimiento sin necesidad de sacrificar el ratón receptor.

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

Durante el desarrollo de los mamíferos, las heridas tempranas de la piel durante la gestación se curan sin cicatriz. Aquí detallamos un modelo fiable y reproducible de cicatrización de heridas fetales sin cicatrices en el dorso cutáneo de embriones de ratón E16.5 (sin cicatrices) y E18.5 (cicatrizantes).

Un ratón fetal Modelo de la piel de la reparación de heridas sin cicatrices

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Un modelo murino de una herida de quemadura reconstruida con un injerto de piel alogénico

El presente protocolo describe cómo injertar piel humana en ratones diabéticos no obesos (NOD)-scid receptor de cadena gamma (NSG) con interleucina-2. En el informe se incluye una descripción detallada de la preparación de la piel humana para el trasplante, la preparación de ratones para el trasplante, el trasplante de piel humana de espesor dividido y el procedimiento de recuperación posterior al trasplante.

Modelo de piel de xenoinjerto para manipular las respuestas inmunes humanas in vivo

El presente trabajo describe una técnica modificada para el trasplante cardíaco vascularizado heterotópico con técnica aséptica actualizada, analgesia y anestesia.

Un protocolo modificado de trasplante de corazón heterotópico murino que coincide con los estándares contemporáneos de técnica aséptica, anestesia y analgesia

Presentamos un modelo reproducible de ratón de alotrasplante compuesto vascularizado de extremidades posteriores a cuello heterotópico. Este protocolo supermicroquirúrgico, que implica anastomosis de vasos de 0,3-0,5 mm, integra guía con filamento de nailon y esposas venosas. Proporciona una plataforma fiable para estudios traslacionales sobre tolerancia, lesiones por isquemia-reperfusión y mecanismos inmunológicos en alotrasplantes compuestos vascularizados.

Trasplante heterotópico de extremidad posterior a cuello en ratón: un modelo supermicroquirúrgico de alotrasplante compuesto vascularizado

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