Murino de grosor completo Trasplante de Piel
2 de enero de 2017
Murino de trasplante de todo el espesor de la piel es un modelo bien establecido para estudiar el rechazo en un entorno aloinmune. A continuación, ofrecemos un tutorial de cada paso que participan en la realización de un c BALB / -> C57BL 6 trasplante de piel / de espesor total.
El objetivo general de este artículo en video es realizar un trasplante de piel de espesor total y describir los pasos importantes necesarios para un procedimiento exitoso. El trasplante de piel de espesor total en ratones es un modelo bien establecido para estudiar las respuestas aloinmunes y el rechazo del injerto. El procedimiento es fácil de realizar y no requiere técnicas microquirúrgicas delicadas.
El rechazo del injerto, en este modelo, ocurre como una reacción inmunológica muy reproducible y se puede monitorear fácilmente mediante inspección directa y palpación. Además, se pueden realizar trasplantes cutáneos secundarios con injertos de piel compatibles con el donador o de terceros para crear modelos de trasplante más complejos, como un método alternativo y sencillo para evaluar la tolerancia específica al donador. Después de anestesiar un ratón donador según el protocolo descrito, utilice una maquinilla eléctrica para afeitar la espalda del animal.
Y, con povidona- yodo al 10 %, desinfecte la piel. Mediante tijeras y disección romo, obtenga la piel dorsal donante desde la cadera hasta el cuello a nivel del tejido conectivo areolar. Coloque la piel dorsal bajo un microscopio y use tijeras de tenotomía finas para separar el tejido conectivo y el panniculus carnosus de la piel.
Corte injertos de 15 por 15 milímetros de la piel dorsal para un lecho de injerto de 10 por 10 a 15 por 15 milímetros. Almacene los injertos sobre gasa empapada con PBS en una placa de Petri, y colóquela sobre hielo. Anestesie el ratón receptor según el protocolo descrito en el texto.
Afeite el lado de la espalda del animal, donde se insertará el injerto, y luego administre 0,02 miligramos por kilogramo de buprenorfina para aliviar el dolor postoperatorio. Utilice povidona-yodo al 10% para desinfectar el área. Con tijeras, y de manera lo más superficial posible, corte un cuadrado de piel de 10 por 10 a 15 por 15 milímetros.
Tenga cuidado de preservar el panniculus carnosus y los vasos sanguíneos que corren superficialmente a él. A continuación, coloque el injerto sobre el lecho del injerto, evitando pliegues a lo largo de los bordes. Luego, coloque ocho suturas en las esquinas del injerto y en el punto medio de cada borde, pasando la aguja a través del injerto y luego a través del panniculus carnosus del lecho del injerto, debajo de la piel receptora circundante.
Coloque una gasa doblada sobre un vendaje doblado y luego posicione al animal sobre el vendaje, con el lado del injerto hacia abajo, retirando la máscara anestésica para permitir que el animal recupere parcialmente la conciencia. A continuación, envuelva el vendaje alrededor del animal. El factor más crítico en el proceso de injerto es la revascularización del tejido injertado mediante el crecimiento de los vasos del hospedador hacia el injerto.
La disección del panniculus carnosus y la colocación correcta del vendaje son los pasos más importantes. Inmediatamente después de la cirugía, administre 5 miligramos por kilogramo de enrofloxacina para la profilaxis de infecciones. Coloque el ratón trasplantado en una jaula limpia hasta que se recupere completamente de la anestesia.
Observe al ratón durante una hora después de la cirugía, antes de devolverlo al alojamiento. Supervise cuidadosamente al ratón durante la recuperación para asegurarse de que el vendaje no restrinja la excursión del tórax ni la respiración. Ocho días después, observe y palpe el injerto en busca de signos de costra, contracción o endurecimiento.
Si alguno de estos signos está presente, es posible que el injerto no haya logrado una vascularización adecuada y debe considerarse un fracaso técnico. Monitoree el injerto diariamente en busca de signos de rechazo. Considere que los injertos han sido rechazados cuando el tejido del injerto presenta necrosis en un 90% o más.
En los modelos de incompatibilidad completa, los injertos de piel de espesor total suelen rechazarse entre los ocho y doce días. En los modelos de incompatibilidad menor, las respuestas de rechazo son más lentas, más variables, y la apariencia del injerto de piel se caracteriza por cambios menos evidentes, como la contracción o la pérdida de vello. El rechazo agudo del injerto generalmente comienza con hinchazón y eritema del injerto.
Estos eventos van seguidos de desecación del injerto, formación de costra y retracción, como se observa aquí. Dependiendo del grado de desajuste del MHC y del protocolo de inmunosupresión, el rechazo puede ocurrir mediante un proceso subagudo marcado por cambios sutiles, como la pérdida de vello, pigmentación, crestas dérmicas y volumen del injerto. En estos casos, un injerto rechazado aparece brillante, blanco y sin vello, con bordes irregulares.
Utilizando BALB/c como donantes y C57 black 6 como receptores, se observó que la inhibición de la glucólisis y la fosforilación oxidativa, o del metabolismo de la glutamina por separado, prolongó la supervivencia del injerto cutáneo. Sin embargo, bloquear simultáneamente las tres vías produjo un aumento significativo en la supervivencia del injerto. Además, la terapia metabólica triple fue más efectiva que la ciclosporina convencional o la rapamicina.
Además, la histología de los injertos de piel del grupo con terapia metabólica mostró una alineación tisular más intacta y un infiltrado inflamatorio linfocítico menor, en comparación con el tejido no tratado. Los resultados en trasplantes de órganos han mejorado notablemente con los avances en procedimientos quirúrgicos y en protocolos de inmunosupresión. Sin embargo, la inmunosupresión a largo plazo se asocia con efectos secundarios significativos, y el desarrollo de nuevas estrategias que promuevan la tolerancia sigue siendo el objetivo de la investigación moderna en trasplantes.
Es bien conocida la importancia del metabolismo en la regulación de los linfocitos T. Al inhibir la glucólisis, la fosforilación oxidativa y el metabolismo de la glutamina, logramos aumentar significativamente la supervivencia del injerto alogénico. Este enfoque novedoso fue más efectivo que la terapia convencional y representa un cambio de paradigma en el enfoque potencial para la regulación inmunitaria y el trasplante.
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Resumen
Este artículo en video proporciona un tutorial sobre la realización de trasplantes de piel de espesor completo en ratones, específicamente el modelo de BALB/c a C57BL/6. Se describen los pasos necesarios para un procedimiento exitoso y se analiza la importancia de este modelo en el estudio de las respuestas aloinmunitarias y el rechazo de injertos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del Trasplante
- Inmunología
- Respuestas aloinmunes
Antecedentes
- El trasplante cutáneo murino de espesor total es un modelo bien establecido.
- Este modelo se utiliza para estudiar el rechazo del injerto y las respuestas inmunitarias.
- El procedimiento es sencillo y no requiere habilidades microquirúrgicas avanzadas.
- El rechazo del injerto se puede monitorear fácilmente mediante inspección directa.
Objetivo del estudio
- Demostrar el procedimiento para el trasplante de piel de espesor total.
- Destacar los pasos necesarios para un injerto exitoso.
- Proporcionar información sobre el monitoreo del rechazo del injerto.
Métodos Utilizados
- Preparación de ratones donantes y receptores.
- Anestesia del ratón donante.
- Afeitado de la espalda del ratón donante utilizando una maquinilla eléctrica.
- Realización del procedimiento de trasplante de piel.
Resultados Principales
- El procedimiento es reproducible y fácil de realizar.
- El rechazo del injerto ocurre como una reacción inmunológica predecible.
- Se puede realizar un trasplante cutáneo secundario para estudios adicionales.
- La inspección directa permite un monitoreo efectivo del estado del injerto.
Conclusiones
- Este modelo es valioso para estudiar la tolerancia específica al donante.
- La técnica puede adaptarse para modelos de trasplante más complejos.
- Proporciona un método confiable para evaluar las respuestas inmunitarias en el trasplante.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El trasplante de piel de espesor total en ratones proporciona un modelo in vivo reproducible para estudiar las respuestas aloinmunes y el rechazo del injerto, permitiendo la desestimación mecanicista de estrategias inmunomoduladoras. El modelo permite la validación de dianas y la evaluación preclínica de terapias que inducen tolerancia, ofreciendo un valor predictivo para programas de biología del trasplante. Su simplicidad y reproducibilidad facilitan la colaboración multifuncional en flujos de trabajo de descubrimiento temprano.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con la regulación inmunitaria y las vías de supervivencia del injerto.
- Valor operativo: Proporciona un sistema biológicamente relevante para la validación funcional de dianas sin necesidad de experiencia en microcirugía.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al cuantificar la supervivencia del injerto bajo intervenciones metabólicas o inmunomoduladoras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera resultados estandarizados y cuantificables del injerto basados en umbrales de tejido necrótico para la puntuación del rechazo.
- Reproducibilidad: Proporciona respuestas inmunológicas consistentes en modelos con incompatibilidad de CMH, lo que permite cribados fiables de compuestos o vías.
- Escalabilidad: Permite trasplantes secundarios con injertos compatibles con el donante o de terceros para evaluar la tolerancia específica al donante en modelos complejos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la dinámica del rechazo al trasplante humano, apoyando la validación preclínica de estrategias que promueven la tolerancia.
- Reducción mecanicista de riesgos: Revela las contribuciones de la glucólisis, la fosforilación oxidativa y el metabolismo de la glutamina en la regulación de los linfocitos T y la supervivencia del aloinjerto.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos de la modulación inmunitaria en fase de descubrimiento con decisiones de avance preclínico mediante métricas de viabilidad del injerto y de histopatología.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El modelo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, apoyando la comprobación de hipótesis en inmunología y permitiendo sistemas listos para ensayos destinados a la evaluación de inmunomoduladores.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos de dianas inmunitarias implicadas en el rechazo de injertos.
- Tamizaje: Permite la evaluación cuantitativa de la supervivencia del injerto mediante monitoreo diario y puntuación del rechazo con ≥90% de necrosis.
- Analítica: Genera resultados cuantificables, incluyendo volumen del injerto, pérdida de vello, pigmentación e infiltrado inflamatorio, para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la vinculación de intervenciones metabólicas con una mayor supervivencia del injerto y una reducción del infiltrado linfocítico.
- Reutilización Empresarial: Sirve como una plataforma reutilizable para evaluar inmunomoduladores novedosos en múltiples programas de tolerancia al trasplante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las respuestas aloinmunes.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante pasos quirúrgicos sencillos y un monitoreo basado en observación visual y palpación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas tempranas sobre la eficacia inmunomoduladora, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basándose en datos de supervivencia del injerto y en la concordancia histológica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación en técnica aséptica, manejo del injerto y colocación de puntos de sutura para evitar fallos técnicos derivados de una preparación inadecuada del lecho del injerto.
- Depende de instrumentos quirúrgicos estándar, microscopios y capacidades de monitoreo postoperatorio para evaluar la integridad del vendaje y la función respiratoria.
- Exige la estandarización entre equipos en los criterios de puntuación del injerto y los umbrales de rechazo para garantizar la comparabilidad de los datos entre estudios.
- Las consideraciones de adaptación incluyen los niveles de compatibilidad del MHC y los protocolos de inmunosupresión para modelar fenotipos de rechazo agudo, subagudo o crónico.
- Las limitaciones prácticas incluyen el fallo del injerto debido a errores técnicos en la disección, la colocación o el vendaje, los cuales deben diferenciarse del rechazo inmunológico.
