Name: El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones En Vivo Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda a caracterizar vías de señalización y redes regulatorias de genes en embriones de invertebrados. Este método permite estudiar interacciones complejas en organismos simples para comprender procesos del desarrollo.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Robert Angerer por su cuidadosa lectura y edición del manuscrito. Los NIH R15HD088272-01, así como la Oficina de Investigación y Desarrollo y el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Mississippi brindaron apoyo para este proyecto a RCR.

1. Rendimiento estrategia de diseño de alta morfolino <ol><li> Identificar un gen (s) de interés (por ejemplo, enfoque de genes candidatos, el análisis de cis-regulador, RNAseq y pantallas diferenciales / o proteómica). </li><li> Utilice genómica, transcriptómica, y los datos de expresión génica disponibles en los sitios web se actualizan con frecuencia (por ejemplo SpBase http://www.echinobase.org 20 y S. purpuratus genoma Búsqueda http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar que el perfil de expresión espacio-temporal se solapa con el mecanismo de desarrollo en cuestión. Si no hay datos de expresión está disponible, a continuación, generar cebadores qPCR y / o un antisentido en situ sonda para evaluar el patrón de expresión génica. </li><li> Después de determinar el patrón de expresión espacial y temporal, obtener la secuencia de ADN de los sitios web genómicos. <ol><li> Para la generación de oligonucleótidos de morfolino traducción de bloqueo, obtener la secuencia of la &#39;región traducida por la ONU (5&#39; UTR 5) directamente aguas arriba del codón de iniciación de bases de datos de etiqueta de secuencia expresada (EST) disponibles en SpBase o S. purpuratus Genoma sitios web de búsqueda. Si esta información no está disponible para el gen de interés, a continuación, realizar 5 &#39;RACE. </li><li> Para diseñar un empalme morfolino-bloqueo, la búsqueda de la secuencia genómica que incluye los exones e intrones utilizando la herramienta de andamio BLASTN en SpBase o S. purpuratus genoma herramienta de búsqueda. </li></ol></li><li> Utilice el diseño de página web oligonucleótido http://oligodesign.gene-tools.com con el fin de diseñar la secuencia de pares de bases deseada morfolino 25. <ol><li> Para un morfolino de traslación de bloqueo, utilizar la secuencia de ARNm de 5 &#39;a 3&#39; como la fuente de la secuencia diana de la traducción. Incluir la secuencia 5 &#39;UTR (aproximadamente 70 nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de transcripción), además de 25 bases de la región codificadora (aguas abajo del sitio de inicio) con el codón de inicio marcada wiTH paréntesis (ATG). </li><li> Para un empalme morfolino-bloqueo, seleccione el exón-intrón o secuencia límites exón-intrón e incluyen 50 bases (25 bases de la secuencia exón y 25 bases de la secuencia del intrón) en torno a las regiones limítrofes. Analiza el genoma con la secuencia de morfolino para verificar que la secuencia es única. </li></ol></li></ol> 2. La microinyección de morfolino oligonucleótidos <ol><li> Preparar 3 mM de soluciones madre de los oligonucleótidos de morfolino mediante la adición de 100 l de agua libre de nucleasa en el vial morfolino 300 nmol. NOTA: No utilice agua tratada con DEPC para la resuspensión debido pirocarbonato de dietilo puede dañar el morfolino. </li><li> Por primera vuelta de la reconstitución por el vial que contiene la solución de oligonucleótido durante 30 s a la velocidad máxima (14.000 - 16.000 xg) y agitar brevemente, el calor a 65 ° C durante 5 a 10 minutos, vórtice brevemente y mantener a la población de morfolino en la sala temperatura durante al menos 1 h. solución de morfolino<html> s se almacenan de -20 ° C a + 4 ° C. </li><li> Preparar la solución de inyección que contiene oligonucleótidos de morfolino a la concentración deseada. Esta solución por lo general contiene 20% de glicerol o KCl 125 mM como vehículo y 15% de FITC-dextrano (isotiocianato de fluoresceína dextrano 10.000 MW 2,5 mg solución madre / l). FITC-dextrano y otros conjugados de dextrano fluorescentes se utilizan habitualmente para identificar embriones inyectados por microscopía de epifluorescencia. soluciones de inyección almacenar a -20 ° C. </li><li> Calentar la solución morfolino a 65 ° C en un bloque de calor o baño de agua durante por lo menos 2 - 5 min. </li><li> Brevemente girar la solución morfolino durante 30 s a la velocidad máxima (14.000 - 16.000 xg) y agitar durante 1 min y centrifugar a toda velocidad (14.000 - 16.000 xg) durante al menos 10 min. </li><li> Cargar las agujas de inyección con la solución morfolino. Para un protocolo detallado microinyección consulte Stepicheva y Song, 2014 21 y Saludos y Ettensohn de 2004&quot;&gt; 22. </li></ol> 3. Fijación y en el Protocolo Situ a las 24 h después de la fecundación (HPF) en S. purpuratus embriones NOTA: Este protocolo se modificó a partir de Arenas-Mena et al. , 2000 23 y Sethi et al. 2014 24. <ol><li> Fijación <ol><li> Añadir unas gotas de fijador (véase más adelante) a los pocillos que contenían embriones, mezclar suavemente con la pipeta, y dejar que se asienten. Retire la solución de fijación, y luego mezclar los embriones con dos lavados de 180 mu l adicionales de fijador. NOTA: Es importante mezclar bien los embriones durante los lavados por pipeteo suave hacia arriba y abajo varias veces. El no hacerlo puede disminuir la relación señal a ruido. </li><li> Dejar los embriones para fijar en el segundo lavado fijador durante 50 min a 1 h a temperatura ambiente (RT) en paraformaldehído al grado microscopía electrónica de 4% que consiste en MOPS 10 mM pH 7,0, 0,1% de Tween-20, y artificial seawater (ASW). Hacer esta solución fresca cada vez para obtener mejores resultados. Además, para la facilidad y practicidad embriones se fijan en placas de 96 pocillos. <ol><li> Para 20 ml uso fijador 5 ml 16% de paraformaldehído, 15 ml ASW, 200 l 1 M MOPS pH 7.0, y 20 l de Tween-20. </li></ol></li><li> Lavar 5 veces a temperatura ambiente con 180 l de MOPS tampón de lavado que consiste en 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl y 0,1% de Tween-20 durante al menos 5 min o hasta que los embriones de caer al fondo del pozo. Una vez más, es importante para mezclar completamente los embriones en el tampón de lavado pipeteando suavemente arriba y abajo varias veces. tampón de lavado MOPS se puede utilizar durante 2 días si se almacenan a 4 DO. <ol><li> Por 40 ml de MOPS lavan uso de búferes de 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 32 ml dH2O y 40 l de Tween-20. </li><li> Fija los embriones pueden ser almacenadas a 4 ° C durante 2 días. NOTA: Si el almacenamiento de los embriones ya fijos, a continuación, añadir azida de sodio al 0,2% en MOPS tampón de lavado para evitar el crecimiento bacteriano.</li></ol></li></ol></li><li> Pre-hibridación <ol><li> Aspirar el MOPS tampón de lavado y añadir 180 l de una proporción de 2: 1 de MOPS tampón de lavado en tampón de hibridación, la mezcla embriones en la solución mediante pipeteado suave varias veces, y se incuba durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. El tampón de hibridación consiste en 70% de formamida, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml de BSA y 0,1% de Tween-20. <ol><li> Para uso 40 ml de tampón de hibridación 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 4 ml dH2O, 0,04 g de BSA, y 40 l de Tween-20. Mezclar bien por agitación, añadir 28 ml de formamida, y agitar de nuevo. </li></ol></li><li> Retire la proporción 2: 1 de MOPS de lavado y tampones de hibridación y añadir 180 l de una proporción de 1: 2 de MOPS tampón de lavado en tampón de hibridación, la mezcla embriones en la solución, y se incuba durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Antes de la hibridación de la sonda mezclar suavemente los embriones en 100 - 150 ml de tampón de hibridación. Incubar embriones a 50 ° C durante al menos 1marido. NOTA: La incubación de los embriones durante la noche es aceptable. Antes de la incubación, sellar los pocillos con una lámina adhesiva con el fin de evitar la evaporación. </li></ol></li><li> Hibridación <ol><li> En un tubo separado añadir 0,1 - 0,3 ng / l de sonda y 500 mg / ml de ARNt de levadura en un tampón de hibridación, a continuación, vórtice suavemente para crear solución de la sonda. tRNA de levadura se añade a la solución de la sonda para disminuir la unión no específica de la sonda anti-sentido. Precalentar esta solución a 50 ° C, y el tampón de aspirado de la hibridación. </li><li> Mezclar embriones pre-hibridado en 100 l de la solución de la sonda, el sello con una lámina adhesiva, y se hibrida a 50 ° C durante 2 a 7 días, dependiendo de la sonda (la sonda foxq2 se puede incubar durante 2 días). NOTA: Los tiempos de incubación puede variar en función de la sonda. Algunos genes expresados ​​en niveles bajos requieren hasta una incubación de 7 días. placas de 96 pocillos se pueden colocar en una caja de humedad como un seguro contra la evaporación si los ADHESive hoja no sellar adecuadamente. </li><li> Lavar 5 veces a 50 ° C con 180 l de MOPS recién hechos tampón de lavado para un total de 3 h. A continuación, lavar 3 veces (15 min) con 180 l de MOPS de tampón de lavado a temperatura ambiente. Recuerde mezclar embriones en el tampón de lavado cada vez con la pipeta suavemente varias veces. </li></ol></li><li> La incubación de anticuerpos <ol><li> Aspirar el MOPS tampón de lavado y se mezclan los embriones en 180 l de tampón de bloqueo que consiste en 10% de suero de oveja normal y 5 mg / ml de BSA en MOPS tampón de lavado y se incuba durante al menos 45 minutos a temperatura ambiente o 4 ° C durante la noche. </li><li> Eliminar el tampón de bloqueo y luego mezclar embriones en tampón de bloqueo que contiene una dilución 1: 1500 de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina diluido en tampón de bloqueo. Incubar toda la noche a temperatura ambiente en una placa de sellado para evitar la evaporación. NOTA: No deje de anticuerpos en más de una noche. </li><li> Lavar los embriones de 6 veces (5 min o hasta que caen embriones) en MOPS tampón de lavado a temperatura ambiente. Los embriones puedenser almacenados durante la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> En desarrollo in situ <ol><li> Lavar embriones 3 veces (10 min) a temperatura ambiente con tampón de pH 9,5 recién hecho que consiste en 0,1 M Tris pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl 2 mM 50 mM, levamisol 1, y 0,1% de Tween-20. <ol><li> Por 20 ml pH 9,5 tampón uso 2 ml de Tris 1 M pH 9,5, 400 l de NaCl 5 M, 1 ml 1 M MgCl 2, 20 l de Tween-20, 16,6 ml dH2O, y 0,0048 g levamisol. </li></ol></li><li> Incubar los embriones a 37 ° C en tampón de tinción protegido de la luz. tampón de tinción se compone de 10% dimetil formamida, 4,5 l / mL 4-Nitro cloruro de azul tetrazolio (NBT) y 3,5 l / ml 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) en recién hecho tampón de pH 9,5 . <ol><li> Para 1 ml de tampón de tinción utilizar 100 l dimetil formamida, 4,5 l NBT y BCIP 3,5 l. </li></ol></li><li> Detener la reacción de la fosfatasa alcalina mediante el lavado de 3 a 5 veces en tampón de lavado MOPS. La reacción wiº la sonda foxq2 normalmente tarda 30 minutos a 1 hora. Algunas sondas pueden necesitar de incubación durante la noche a RT, ya sea o 4 ° C. </li><li> Mezclar los embriones en una solución de lavado MOPS 70% y 30% de glicerol. El glicerol proporciona un índice de refracción necesario para microscopía. Los embriones se pueden almacenar en esta solución durante varias semanas. Sellar las placas con parafina de plástico para evitar la evaporación. </li></ol></li><li> Preparación de los portaobjetos y la captura de imágenes <ol><li> Preparar un portaobjetos mediante la disposición de tres pequeñas tiras de cinta adhesiva de doble cara en un triángulo con pequeños espacios entre las tiras en un portaobjetos. </li><li> La transferencia de los embriones en el lavado MOPS 70% y solución de glicerol al 30% hasta el centro del triángulo y cubrir con un cubreobjetos. </li><li> Sellar el cubreobjetos mediante la aplicación de una capa de esmalte de uñas alrededor de los bordes del cubreobjetos. </li><li> Capturar imágenes utilizando un microscopio de luz compuesto con un objetivo de 20X y una cámara adjunta. </li></ol></li></ol>

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<li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li>
<li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells%2C+control+skeletal+morphogenesis+%5Bcorrected%5D+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li>
<li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cnidaria.+Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li>
<li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001(2016).</li>
<li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li>
<li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li>
<li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li>
<li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La metodología que aquí se presenta es un ejemplo que ilustra el poder de utilizar embriones con menos complejidad genómica y morfológica de los vertebrados para entender las vías de transducción de señales y GRNs que rigen los mecanismos fundamentales del desarrollo .. Muchos laboratorios están usando ensayos similares durante el desarrollo de erizo de mar temprano para diseccionar el vías que participan en otros eventos de especificación del destino celular de señalización (por ejemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β...

las redes de genes reguladores (GRNs) y las vías de transducción de señales establecen la expresión espacial y temporal de los genes durante el desarrollo embrionario que se utilizan para construir el plan de adultos cuerpo del animal. Célula a célula de las vías de transducción de señales son componentes esenciales de estas redes reguladoras, que proporcionan el medio por el cual las células se comunican. Estas interacciones celulares establecer y perfeccionar la expresión de genes reguladores y diferenciación en y entre los diversos territorios durante la embriogénesis 1, 2. Las interacciones entre los moduladores secretadas extracelulares (ligandos, antagonistas), receptores y co-receptores controlan las actividades de las vías de transducción de señales. Un surtido de moléculas intracelulares transduce estas entradas que resulta en la expresión alterada de genes, la división y / o la forma de una célula. Si bien muchas de las moléculas clave que se utilizan en los niveles extracelulares e intracelulares en las principales vías sonconocido, es un conocimiento incompleto debido en gran parte a la complejidad de las vías de señalización individuales. Además, las diferentes vías de señalización a menudo interactúan uno con el otro, ya sea positiva o negativamente en el extracelular, intracelular y los niveles de la transcripción 3, 4, 5, 6. Es importante destacar que los componentes centrales de las vías de transducción de señales están altamente conservadas en todas las especies de metazoos, y, notablemente, la mayoría de las principales vías de señalización menudo realizan funciones de desarrollo similares en muchas especies cuando se comparan los organismos de filos estrechamente relacionados, en particular, 7, 8, 9, 10, 11. El estudio de la señalización durante el desarrollo es una tarea de enormes proporciones en cualquier organismo, y hayson varios retos importantes para el estudio de las vías de señalización en la mayoría de los modelos deuterostome (vertebrados, los cordados invertebrados, hemicordados y equinodermos): 1) En los vertebrados hay un gran número de posibles ligando y las interacciones de receptor / co-moduladores, moléculas de transducción intracelular, así como potenciales interacciones entre diferentes vías de señalización debido a la complejidad del genoma de 12, 13, 14; 2) La morfología compleja y movimientos morfogenéticos en los vertebrados a menudo hacen que sea más difícil la interpretación de las interacciones funcionales en y entre las vías de transducción de señales; 3) Análisis de la mayoría de especies modelo de invertebrados deuterostome no equinodermo están limitados por las ventanas cortas de gravidez con la excepción de algunas especies de tunicados 15, 16. losembrión de erizo de mar tiene algunas de las limitaciones mencionadas anteriormente y ofrece muchas cualidades únicas para la realización de un análisis detallado de las vías de transducción de señales in vivo. Estos incluyen los siguientes: 1) La relativa simplicidad del genoma del erizo de mar reduce significativamente el número de posibles ligando, receptor / co-receptor y la molécula de transducción intracelular las inter- 17; 2) Los GRNs que controlan la memoria y en los patrones de las capas germinales embrionarias y los principales ejes están bien establecidos en embriones de erizo de mar, ayudar en la comprensión del contexto normativo de la célula / territorio que recibe las señales 18, 19; 3) Muchas vías de transducción de señal pueden ser estudiados entre las etapas de escisión y gástrula primeros cuando los embriones se componen de una sola epitelio estratificado cuya morfología es más fácil de analizar; 4) Las moléculas implicand en las vías de los erizos de mar son fáciles de manipular señalización; 5) Muchos erizos de mar están grávidas de 10 a 11 meses al año (por ejemplo, Strongylocentrotus purpuratus y variegatus Lytechinus). A continuación, presentamos un método para caracterizar de manera sistemática y eficientemente los componentes de las vías de señalización que especifican y territorios de patrón en embriones de erizo de mar para ilustrar las ventajas que varios sistemas modelo de invertebrados ofrecen en el estudio de los mecanismos moleculares complejas.

<table><tbody><tr><td>Morfolino que bloquea la traducción y/o que bloquea el empalme</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Personalizado</td><td>Más información en www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (isotiocianato de fluoresceína de dextrano)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Hacer 25 mg/mL solución madre</td></tr><tr><td>de paraformaldehído al 16% Electrón de grado EM</td><td> Ciencias de la Microscopía</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Levadura ARNt</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetramisol (levamisol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Cloruro de tetrazolio azul nitro (NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

el poder de la simplicidad: erizo de mar como embriones<em&gt; en vivo</em&gt; modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red interacciones

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Notablemente pocas vías de transducción de señales de célula a célula son necesarias durante el desarrollo embrionario para generar la gran variedad de tipos de células y tejidos en la forma del cuerpo adulto. Sin embargo, cada año se descubren más componentes de las vías de señalización individuales, y los estudios indican que, dependiendo del contexto, hay una interferencia significativa entre la mayoría de estas vías. Esta complejidad hace que el estudio de la señalización de célula a célula en cualquier sistema modelo de desarrollo in vivo sea una tarea difícil. Además, se requieren análisis funcionales eficientes para caracterizar las moléculas asociadas con las vías de señalización identificadas a partir de los grandes conjuntos de datos generados por las pantallas diferenciales de próxima generación. Aquí, ilustramos un método sencillo para identificar de manera eficiente los componentes de las vías de transducción de señales que gobiernan el destino celular y la especificación del eje en embriones de erizo de mar. La simplicidad genómica y morfológica de los embriones, similares a los del erizo de mar, los convierte en poderosos modelos de desarrollo in vivo para comprender interacciones de señalización complejas. La metodología descrita aquí se puede utilizar como plantilla para identificar nuevas moléculas de transducción de señales en vías individuales, así como las interacciones entre las moléculas en las diversas vías en muchos otros organismos.

En el embrión de erizo de mar hemos demostrado que 3 de señalización Wnt diferentes ramas (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, y Wnt / PKC) 4, 25 interactúan para formar una red de señalización Wnt que gobierna anterior-posterior patrón (AP). Una de las consecuencias más importantes de estos eventos de señalización es que el expresado en términos generales neuroectodermo anterior (ANE) GRN inicial se restringe a un pequeño territorio al...

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

El objetivo general de estos experimentos es ilustrar las ventajas que ofrecen los organismos simples en el estudio de las interacciones complejas entre redes reguladoras de genes que dirigen los procesos de desarrollo. Esta metodología puede ayudar a responder preguntas clave en biología evolutiva y del desarrollo, como la forma en que las vías de señalización regulan la especificación del destino celular a lo largo de los ejes embrionarios principales en los metazoos. Una de las principales ventajas de esta metodología es que puede utilizarse para caracterizar eficientemente las vías de señalización y las redes reguladoras de genes que activan en un contexto de desarrollo in vivo. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Marina Martinez-Bartolomé

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describe una técnica de trasplante de tejido que se diseñó para probar la señalización y las propiedades de los patrones de la superficie del ectodermo cefálico durante el desarrollo craneofacial.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

Se describe aquí un protocolo revisado para el cultivo a gran escala de embriones C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parecen diferenciarse y recapitular la expresión de genes de una manera específica de la célula. Las técnicas que requieren el acceso directo a las células o el aislamiento de tipos de células específicas de los otros tejidos se pueden aplicar sobre C. elegans células cultivadas.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

La microinyección es una técnica común que se utiliza para entregar construcciones de ADN, ARNm, oligonucleótidos antisentido morfolino u otros tratamientos en los huevos, embriones y células de diversas especies.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Un método para la microinyección de Patiria minata Los cigotos

Hemos desarrollado un protocolo para generar agregados de células madre embrionarias de ratón que muestran autoorganización, ruptura de simetría y elongación paralelas al desarrollo axial. Esta técnica permite el estudio de los procesos de desarrollo axial y la generación de tipos celulares que de otro modo serían difíciles de realizar en el cultivo monocapa.

Generación de agregados de células madre embrionarias de ratón que Muestre Symmetry Breaking, Polarización y Comportamiento Colectivo Emergente<em&gt; In Vitro</em

En los embriones de Xenopus, las células del techo del blastocelo son pluripotentes y pueden programarse para generar varios tejidos. Aquí, describimos los protocolos para usar explantes de techo de blastocoel de anfibios como un sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

Las complejidades tisulares de los sistemas multicelulares confunden la identificación de la relación causal entre las señales extracelulares y los comportamientos celulares individuales. Aquí, presentamos un método para estudiar el vínculo directo entre las señales dependientes del contacto y los ejes de división utilizando los blastómeros embrionarios de C. elegans y las perlas adhesivas de poliestireno.

Reconstitución in Vitro de patrones de contacto de células espaciales con Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres aislados y perlas de poliestireno adhesivo

Los explantes de blastodermo de pez cebra se generan aislando células embrionarias de centros de señalización endógenos dentro del embrión temprano, produciendo grupos de células relativamente ingenuos fácilmente manipulados y cultivados ex vivo. Este artículo proporciona instrucciones para hacer tales explantes y demuestra su utilidad al interrogar los roles para la señalización nodal durante la gastrulación.

Generación de explantes de Blastoderm naïve a partir de embriones de pez cebra

Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

La manipulación optogenética de las vías de señalización puede ser una estrategia poderosa para investigar cómo se decodifica la señalización en el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de activadores de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP) basados en el dominio de detección de luz-oxígeno-voltaje en el embrión temprano de pez cebra.

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Aprenda a caracterizar vías de señalización y redes regulatorias de genes en embriones de invertebrados. Este método permite estudiar interacciones complejas en organismos simples para comprender procesos del desarrollo.

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones En Vivo Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones (Video) | JoVE Journal

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones

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