La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

El objetivo general de este protocolo es utilizar una cámara de pliegue cutáneo dorsal avanzada para examinar el desarrollo de la vasculatura asociada al tumor en detalle en un modelo de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, como la mejora de la terapia y la comprensión de la progresión tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que los procesos se estudian en el contexto adecuado, en la vida real y que estos procesos se pueden estudiar a lo largo del tiempo.

Este procedimiento será demostrado por la doctora Ann Seynhaeve, la investigadora principal de mi laboratorio. De un ratón donante no transgénico, se extrae un fragmento de tumor no necrótico de 10 mm de diámetro para implantarlo en la cámara de la ventana dorsal del ratón receptor. Utilice un donante de ratón normal para un tumor singénico o un donante de ratón inmunodeficiente para un xenoinjerto.

El ratón receptor debe tener al menos 12 semanas de edad y pesar veinte o más gramos. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos en condiciones asépticas. Por ejemplo, autoclave los instrumentos quirúrgicos y los materiales de la cámara.

Después de sedar al ratón receptor, retire el vello de toda la parte dorsal con una recortadora eléctrica y luego use gel depilatorio. Enjuague la piel y séquela. Por último, frote la piel depilada con etanol.

Ahora, marca una línea central horizontal a lo largo del lomo. A continuación, coloque la ventana de visión al menos 2 mm por debajo de la línea y marque el perímetro de la ventana en la piel. A continuación, con un bisturí y unas tijeras, retire con cuidado la piel dentro de la línea perimetral sin dañar la fascia subyacente.

A continuación, tire del pliegue cutáneo y utilice un perforador de orejas para introducir agujeros de 1 mm a cada lado de la zona de la ventana para los pernos que sujetan la ventana en su lugar. Coloque el marco trasero en el mouse y asegure el marco colocando las tuercas en los pernos. A continuación, tira de la piel de dos a tres milímetros sobre el marco para asegurarte de que encaja.

Si es así, introduzca agujas de calibre 23 a través de los dos orificios de sutura en la parte superior del marco. Asegure el marco apretando las tuercas y sujételas con portaagujas de sujeción, no apriete demasiado las tuercas y evite que la piel gire alrededor de los pernos. A continuación, sustituya las agujas por suturas para fijar la montura a la piel.

Ahora gire el ratón hacia un lado. Desde este ángulo, introduzca una pieza gruesa de vidrio de relleno y un cubreobjetos estándar de 12 milímetros. Asegure ambos con un anillo de retención para que la fascia quede apretada contra el vidrio.

El siguiente paso es hidratar la ventana con cloruro de sodio al 0,9%. Deje que caigan unas gotas sobre el área de visualización y absorba el exceso. Ahora, justo debajo de la ventana, use una aguja de calibre 25 con una curva de 90 grados para hacer una bolsa profunda en la fascia que pueda contener un milímetro cúbico de tejido tumoral.

A continuación, inserte el tejido tumoral en la bolsa. Finalmente, cierre el área de vista de la ventana con una cubierta de vidrio estándar de 12 milímetros y un anillo de retención. Cualquier burbuja de aire se disipará en una hora.

Antes de sedar el ratón, caliente una plataforma de temperatura controlada hecha a medida a 37 grados centígrados. Después de sedar el mouse, colóquelo en la plataforma calentada. Coloque una nariz para administrar isoflurano y, si la evaluación durará más de cinco minutos, solicite una cita oftalmológica.

Ahora, atornille la cámara con los pernos de la ventana al soporte hecho a medida y asegure el soporte a la plataforma. Luego, limpie la ventana de vidrio con agua y algodón. Ahora, en el microscopio, verifique el desarrollo de vasos en el tumor usando el objetivo de 10 veces, bajo luz fluorescente y de campo claro.

Después del examen macroscópico, encienda los láseres confocal. Ajuste el panel de control del microscopio a una ganancia inteligente de 100 voltios por vuelta. Un desplazamiento inteligente del 10% por vuelta, zoom medio, posicionamiento X e Y medio y 100 micras de posición Z por vuelta.

Establezca el modo de adquisición en XYZ o XYZT. Seleccione una resolución. Elija una velocidad de adquisición de dos o 400 hercios.

Coloque el orificio en una unidad aireada. Y seleccione la opción X bidireccional. Al evaluar varios fluoróforos con un posible rango espectral superpuesto, seleccione el escaneo secuencial entre fotogramas para evitar el sangrado y establecer las trayectorias de haz correctas.

Establezca el promedio de línea en cuatro y, por último, seleccione un nuevo conjunto de datos para el experimento. Ahora, concéntrese en el tejido de interés al hacerlo, es mejor usar lentes secas con aperturas numéricas más altas. A continuación, utilice el rápido escaneo en vivo para obtener la mejor relación señal/ruido posible ajustando la ganancia y el desplazamiento donde no haya sobreexposición.

Ahora, seleccione la pila Z en la pestaña de adquisición y realice un escaneo Z rápido. Desde el escaneo rápido, decida las posiciones inicial y final del escaneo completo.

A continuación, establezca el tamaño del paso Z de acuerdo con el tamaño del agujero y proceda con el escaneo completo. Se obtuvieron imágenes de ratones huéspedes que expresaban etiquetas fluorescentes después de la implantación del tumor utilizando el protocolo descrito. La etiqueta eNOStag-GFP se expresa en el Golgi y en la membrana celular de las células endoteliales.

La etiqueta ROSAmT/mG expresa la florescencia roja de forma ubicua y la florescencia verde en las células que expresan Cre Recombinasa. Una aplicación de esta tecnología es el estudio del desarrollo de los vasos, ya que en los tumores se observan todas las etapas. Por ejemplo, se pueden ver frentes endoteliales brotando en áreas no vascularizadas.

Los tumores también tienen vasos dañados y lechos vasculares establecidos con vasos maduros ramificados. Otra aplicación es estudiar la formación de lúmenes, el flujo sanguíneo y la extravasación mediante la aplicación de etiquetas a la sangre, como nanopartículas fluorescentes. Por lo tanto, se puede observar el flujo sanguíneo en la luz de los tubos vasculares y cerca de las células de la punta endotelial.

En las células de la punta, se observa la formación de un lumen de la culata. La microscopía intravital también se puede utilizar para investigar el efecto de los agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, 24 horas después de la inyección de nanopartículas en un animal con eNOStag-GFP, las nanopartículas permanecieron en la vasculatura con una extravasación mínima al intersticio tumoral.

Sin embargo, cuando se administraron nanopartículas en combinación con TNF, se observó extravasación en el intersticio tumoral. Esto es evidencia de un aumento en la administración de fármacos intertumorales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo instalar una cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal y cómo estudiar los procesos relacionados con el tumor mediante microscopía confocal.