La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

El objetivo general de este protocolo es utilizar una cámara avanzada de pliegue dorsal de la piel para examinar en detalle el desarrollo de la vasculatura asociada al tumor en un modelo de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, como la mejora de la terapia y la comprensión de la progresión tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que los procesos se estudian en el contexto adecuado, en condiciones reales, y que estos procesos pueden analizarse a lo largo del tiempo.

Este procedimiento será demostrado por la doctora Ann Seynhaeve, investigadora principal en mi laboratorio. A partir de un ratón donante no transgénico, obtener un fragmento tumoral no necrótico de 10 mm de diámetro para su implantación en la cámara dorsal de ventana del ratón receptor. Utilice un ratón donante normal para un tumor sincrónico o un ratón donante inmunodeficiente para un xenoinjerto.

El ratón receptor debe tener al menos 12 semanas de edad y pesar veinte gramos o más. Realice todos los procedimientos quirúrgicos bajo condiciones asépticas. Por ejemplo, esterilice los instrumentos quirúrgicos y los materiales de la cámara en autoclave.

Después de sedar el ratón receptor, retire el vello de todo el lado dorsal utilizando una máquina eléctrica para cortar el pelo y luego use una crema depilatoria. Enjuague la piel para limpiarla y séquela. Finalmente, limpie la piel depilada con etanol.

Ahora, marque una línea horizontal central a lo largo de la columna vertebral. Luego, coloque la ventana de visualización al menos 2 mm por debajo de la línea y marque el perímetro de la ventana sobre la piel. A continuación, utilizando un bisturí y tijeras, retire cuidadosamente la piel dentro de la línea del perímetro sin dañar la fascia subyacente.

A continuación, levante el pliegue de piel y utilice un perforador de orejas para hacer orificios de 1 mm a ambos lados del área de la ventana, para los tornillos que sujetan la ventana en su lugar. Coloque el marco posterior sobre el ratón y asegure el marco colocando las tuercas en los tornillos. A continuación, tire de la piel dos o tres milímetros por encima del marco para asegurarse de que quede bien ajustada.

En caso afirmativo, inserte agujas de calibre 23 a través de los dos orificios para sutura en la parte superior del marco. Fije el marco apretando las tuercas y sosténgalas con portagujas de sujeción; no apriete en exceso las tuercas y evite que la piel gire alrededor de los pernos. A continuación, sustituya las agujas por suturas para asegurar el marco a la piel.

Ahora gire el ratón hacia un lado. Desde este ángulo, introduzca un trozo grueso de vidrio relleno y un cubreobjetos estándar de 12 milímetros. Sujete ambos con un anillo de retención para que la fascia quede apretada contra el vidrio.

El siguiente paso consiste en hidratar la ventana utilizando cloruro de sodio al 0,9%. Permita que unas gotas caigan sobre el área de visualización y absorba el exceso. Ahora, justo debajo de la ventana, utilice una aguja de calibre 25 con una curvatura de 90 grados para hacer un bolsillo profundo en la fascia que pueda contener un milímetro cúbico de tejido tumoral.

Luego, inserte el tejido tumoral en el bolsillo. Finalmente, cierre el área de visualización con un cubreobjetos estándar de 12 milímetros y un anillo de sujeción. Cualquier burbuja de aire desaparecerá dentro de una hora.

Antes de sedar al ratón, caliente una plataforma personalizada con control de temperatura a 37 grados Celsius. Después de sedar al ratón, colóquelo sobre la plataforma calentada. Coloque una concha nasal para administrar isoflurano y, si la evaluación durará más de cinco minutos, aplique una pomada oftálmica.

Ahora, sujete la cámara utilizando los pernos de la ventana a un soporte hecho a medida y asegure el soporte a la plataforma. Luego, limpie la ventana de vidrio con agua y algodón. A continuación, en el microscopio, revise el desarrollo de los vasos sanguíneos en el tumor utilizando el objetivo de 10 aumentos, bajo luz de campo brillante y luz fluorescente.

Después del examen macroscópico, encienda los láseres confocales. Configure el panel de control del microscopio en una ganancia inteligente de 100 voltios por vuelta. Un desplazamiento inteligente de 10 % por vuelta, zoom medio, posicionamiento medio en X e Y y 100 micrones de posición en Z por vuelta.

Establezca el modo de adquisición en XYZ o XYZT. Seleccione una resolución. Elija una velocidad de adquisición de dos o 400 hercios.

Configure el diafragma de pinza en una unidad airy. Y seleccione la opción X bidireccional. Al evaluar múltiples fluoróforos con un posible rango espectral superpuesto, seleccione el escaneo secuencial entre cuadros para evitar la contaminación de señal y configure las trayectorias del haz correctamente.

Establezca el promedio de líneas en cuatro y, finalmente, seleccione un nuevo conjunto de datos para el experimento. A continuación, enfoque el tejido de interés; para ello, lo mejor es utilizar objetivos secos con aperturas numéricas más altas. Luego, utilice el escaneo rápido en vivo para obtener la mejor relación señal-ruido posible ajustando la ganancia y el desplazamiento hasta el punto en que no haya sobreexposición.

Ahora, seleccione la pila Z en la pestaña de adquisición. Realice un escaneo Z rápido. A partir del escaneo rápido, determine las posiciones inicial y final del escaneo completo.

A continuación, configure el tamaño del paso Z según el tamaño del diafragma y continúe con la exploración completa. Se realizaron imágenes de ratones huésped que expresaban marcadores fluorescentes tras la implantación del tumor utilizando el protocolo descrito. La etiqueta eNOStag-GFP se expresa en el aparato de Golgi y en la membrana celular de las células endoteliales.

La etiqueta ROSAmT/mG expresa fluorescencia roja de manera ubicua y fluorescencia verde en células que expresan la recombinasa Cre. Una aplicación de esta tecnología es el estudio del desarrollo vascular, ya que todas las etapas se observan en tumores. Por ejemplo, se pueden observar frentes endoteliales brotando hacia áreas no vascularizadas.

Los tumores también presentan vasos dañados y lechos vasculares establecidos con vasos maduros ramificados. Otra aplicación consiste en estudiar la formación de la luz, el flujo sanguíneo y la extravasación mediante la aplicación de marcadores en la sangre, como nanopartículas que fluorescen. De este modo, se puede observar el flujo sanguíneo en la luz de los tubos vasculares y cerca de las células endoteliales apicales.

En las células apicales, es observable la formación de una luz en el tallo. La microscopía intravital también puede utilizarse para investigar el efecto de agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, 24 horas después de la inyección de nanopartículas en un animal eNOStag-GFP, las nanopartículas permanecieron en la vasculatura con mínima extravasación hacia el intersticio tumoral.

Sin embargo, cuando se administraron nanopartículas en combinación con TNF, se observó extravasación hacia el intersticio tumoral. Esto es evidencia de un aumento en la entrega de fármacos dentro del tumor. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo instalar una cámara de ventana en el pliegue dorsal de la piel y cómo estudiar procesos relacionados con el tumor mediante microscopía confocal.