Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

El objetivo general de este estudio es purificar vesículas de membrana externa u OMV de Legionella pneumophila de forma estandarizada y analizar su influencia en la replicación bacteriana en macrófagos humanos y murinos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de vesículas de membrana externa. Por ejemplo, el procedimiento estandarizado para la preparación de OMV puede ayudar a estudiar su impacto en la interacción huésped-patógeno.

La principal ventaja de esta técnica es que proporcionará un protocolo estandarizado para estudiar el impacto de las OMV de Legionella pneumophila en macrófagos humanos o murinos, lo que mejorará nuestra comprensión de la patogenicidad de Legionella pneumophila. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando pensamos en el posible potencial proinflamatorio de los OMV y en cómo esto podría influir en el curso de la infección, ya que los OMV son liberados por Legionella tanto dentro de la célula huésped como extracelularmente. El procedimiento será demostrado por Kerstin Hoffmann, técnica de mi laboratorio y Analina Young, investigadora postdoctoral.

Para empezar, mientras se trabaja en condiciones estériles, se esparce el núcleo B de la cepa L. pneumophila en placas de agar BCYE e incuba a 37 grados centígrados durante tres días. Utilice la L. pneumophila de una placa de precultivo para inocular 10 mililitros de medio YEB a un OD600 de 0,3 e incubar las bacterias a 37 grados Celsius en un agitador giratorio durante seis horas. Verifique la pureza del cultivo líquido esparciendo 100 microlitros de la suspensión en una placa de agar sangre.

Incubar la placa de agar sangre durante la noche a 37 grados centígrados. Agregue el cultivo líquido restante a 90 mililitros de medio YEB fresco e incube el cultivo en un agitador giratorio hasta que alcance un OD600 de 3.0 a 3.5. Centrifugar el cultivo líquido a 4.000 g durante 20 minutos para granular las bacterias.

A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos. Deseche los gránulos bacterianos y vuelva a centrifugar las muestras antes de repetir el paso de centrifugación una vez más. A continuación, esterilice el sobrenadante restante dos veces.

A continuación, transfiera el sobrenadante libre de bacterias a tubos de ultracentrífuga y centrifuga las muestras a 100.000 g a cuatro grados centígrados durante tres horas. Decanta el sobrenadante y deséchalo. A continuación, utilice PBS estéril para resuspender los gránulos de OMV y agruparlos.

Repita el paso de ultracentrifugación para eliminar las proteínas contaminantes y el LPS libre. Ahora, deseche el sobrenadante y seque el tubo de ultracentrífuga con un hisopo de algodón estéril. Vuelva a suspender el pellet OMV con 500 microlitros de PBS estéril.

A continuación, coloque 20 microlitros en cada una de las placas de agar sangre y agar BCYE para excluir la contaminación bacteriana de la vesícula preparada. Incubar la placa de agar sangre durante la noche y la placa de agar BCYE durante tres días. Utilice el ensayo BCYE de acuerdo con las instrucciones del fabricante para cuantificar la cantidad de proteína para la preparación de OMV obtenida.

Después de diferenciar las células THP-1 en macrófagos de acuerdo con el protocolo de texto, use 500 microlitros de medio fresco para reemplazar el medio de diferenciación e incube las células durante otras 24 horas a 37 grados Celsius. Para tratar las células THP-1 o BMDM murinas con OMV, descongele las OMV previamente preparadas y agregue la cantidad adecuada a las células. Incubar los macrófagos con OMV a 37 grados Celsius durante al menos 20 horas para infectar células THP-1 pretratadas o no tratadas con cepa de L. pneumophila de tipo salvaje núcleo B o células murinas BMDM con un mutante sin flagelos de esta cepa sin cambiar el medio de las células.

Agregue bacterias a un MOI de 0.5, lo que equivale a uno por 10 a la quinta L. pneumophila por pocillo. Incubar los cultivos durante 24 y 48 horas respectivamente. Para lisar las células, añadir saponina a una concentración final del 0,1% e incubar las células durante cinco minutos.

A continuación, vuelva a suspender los macrófagos lisados por pipeteo y transfiera la suspensión a un recipiente de reacción. Utilice PBS estéril para preparar diluciones en serie de la suspensión de L. pneumophila. A continuación, raye 50 microlitros de las diluciones requeridas en placas de agar BCYE e incube las placas durante tres días.

Cuente visualmente las colonias formadas a ojo y realice cálculos de acuerdo con el protocolo de texto. En este experimento, que examina el potencial proinflamatorio de los OMV de L. pneumophila, las células THP-1 diferenciadas por PMA responden con un aumento dependiente del tiempo y la dosis en la secreción de IL-8 e IL-6. Aquí, se analizó la influencia de diferentes receptores tipo Toll en el reconocimiento de OMV de L. pneumophila en BMDMs murinos con diferentes antecedentes genéticos utilizando un ensayo ELISA CXCL-1.

Las BMDM murinas de ratones de tipo salvaje secretaron CXCL-1 después de la estimulación con OMV, mientras que las BMDM murinas de TLR2/4 doble knockout secretaron significativamente menos. Para estudiar el impacto de los OMV de L. pneumophila en la replicación bacteriana en macrófagos THP-1, las células se preincubaron con OMV durante 20 horas y luego se infectaron adicionalmente con L. pneumophila. La preestimulación de los macrófagos derivados de THP-1 primero reduce la dosis de replicación bacteriana de forma dependiente después de 24 horas de la infección, mientras que conduce a una duplicación en el recuento de UFC en el momento posterior.

Como se muestra en este experimento, la preestimulación de BMDMs murinos con OMVs resulta en un aumento de diez veces en el recuento de UFC en BMDM murinos de animales de tipo salvaje, mientras que los macrófagos knockout TLR2 y TRIF/MyD88 no muestran este aumento en la replicación de L. pneumophila después de la preincubación de OMV. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar en condiciones estériles y verificar la contaminación bacteriana de los OMV purificados. De lo contrario, el análisis posterior no da resultados concluyentes.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de seguimiento de nanopartículas, para responder a preguntas adicionales como qué mutante de Legionella está produciendo más o menos OMV o para investigar el impacto de diferentes condiciones de estrés en la secreción de OMV. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de OMV exploraran el impacto de los OMV en las interacciones huésped-patógeno in vitro y luego in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar OMV y cómo comenzar a analizar su efecto en la infección posterior de macrófagos.

Este protocolo se puede aplicar a diferentes bacterias gramnegativas y a sus respectivas células huésped después de adaptar los tiempos de incubación y crecimiento. No olvide que trabajar con Legionella pneumophila puede ser extremadamente infeccioso para los humanos, por lo que siempre se debe trabajar debajo de un banco estéril mientras se manipula Legionella y se realiza este procedimiento.