Name: Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende a purificar vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila y analizar su potencial proinflamatorio en macrófagos humanos y murinos. Este protocolo estandarizado mejora la comprensión de la patogenicidad bacteriana.

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Agradecemos al Prof. Dr. Markus Schnare para que nos proporciona TLR2 - / - y TLR2 / 4 - / - ratones y el Prof. Dr. Carsten Kirschning de TRIF / MyD88 - / - ratones. Las partes de este trabajo ha sido financiado por el Ministerio Federal de Educación und Forschung (e: bio miRSys - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), y Montes de Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE médicos RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), todos a BS.

1. Preparar medio y placas de agar <ol><li> Preparar 1 L de medio de caldo (YEB). Disolver 10 g de ACES y 10 g de extracto de levadura en 900 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 6,9 con KOH (5 N). Añadir 10 ml de L-cisteína (0,4 g en 10 ml de agua destilada) y 10 ml de Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g en 10 ml de agua destilada). Llenar hasta 1 l con agua destilada y filtrar esterilizar el (tamaño de poro: 0,22 micras) solución. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar el extracto de levadura de carbón tamponado (BYCE) placas de agar. Disolver 10 g de ACES y 10 g de extracto de levadura en 900 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 6,9 con KOH (5 N). Añadir 15 g de agar y 2.5 g de carbón activado. Llenar hasta 1 l con agua destilada y autoclave. <ol><li> Añadir 10 ml de L-cisteína (0,4 g en 10 ml de agua destilada) y 10 ml de Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g en 10 mL de agua destilada, tanto esterilizado por filtración a través de 0,22-micrasporos) a BCYE enfriado (aproximadamente 50 ° C). Verter en las placas y se almacena a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Cultivar L. pneumophila <ol><li> Propagar la cepa de L. pneumophila Corby (tipo salvaje, WT) en placas de agar BCYE y los incuban a 37 ° C durante 3 días. Inocular 10 ml de YEB a una DO 600 de 0,3 a L. pneumophila de la placa de cultivo previo; incubar las bacterias a 37 ° C en un agitador rotatorio (150 rpm) durante 6 h. </li><li> Verificar la pureza de cultivo líquido por la difusión de 100 l de la suspensión en una placa de agar sangre. Incubar toda la noche a 37 ° C. </li><li> Añadir el cultivo líquido restante a 90 ml de medio YEB fresco y se incuba en un agitador rotatorio (37 ° C y 150 rpm) para alcanzar una OD 600 de 3,0 a 3,5, que tiene aproximadamente 16 a 20 h. </li></ol> 3. Preparar y cuantificar L. pneumophila las OMV NOTA: Llevar a cabo todo lo siguiente etapa de centrifugacións en condiciones estériles y a 4 ° C. <ol><li> Centrifugar el cultivo líquido a 4.000 xg durante 20 min para sedimentar las bacterias. Transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga frescas, desechar el sedimento bacteriano, y repetir la centrifugación (4000 xg durante 20 min). Repita este paso una vez. </li><li> Esterilizada por el filtro del resto de sobrenadante dos veces (tamaño de poro: 0,22 micras). Transferir el sobrenadante libre de bacterias a los tubos de ultracentrífuga y ultracentrifugación a 100.000 xg durante 3 h. </li><li> Se decanta el sobrenadante y desecharlo. Resuspender el precipitado OMV en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y ultracentrifugación (100.000 xg durante 3 h) para eliminar las proteínas y LPS contaminantes. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el OMV en 500 l de PBS estéril. Racha de 20 l en una placa de agar sangre y en una placa de agar BYCE para excluir la contaminación bacteriana de las vesículas preparadas. Incubar la placa de agar sangre durante la noche y la placa de agar BCYE durante 3 días (ambos a 376; C). </li><li> Cuantificar la cantidad de proteína obtenida de la preparación de OMV utilizando un ensayo de ácido bicinconínico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: La concentración de 100 ml de L. pneumophila cultura es normalmente de 1 g / l. Almacenar los OMV preparadas y cuantificados a -20 ° C. </li></ol> Los macrófagos 4. Tratamiento previo <ol><li> Preparar las células THP-1. NOTA: THP-1 es una línea celular monocítica derivada de un paciente con leucemia. <ol><li> Añadir 2x10 5 células THP-1 por 24 pozos y diferenciarlos mediante la adición de 20 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en células similares a los macrófagos. Incubar durante 24 horas a 37 ° C. </li><li> Reemplazar el medio con 500 l de medio fresco y se incuba durante otras 24 h; el medio óptimo para las células THP-1 se compone de RPMI 1640 alta glucosa suplementado con suero de ternera fetal al 10%. </li></ol></li><li> Aislar los macrófagos derivados de médula ósea murina (mBMDM), como se describe en ConsulteENCE 20. </li><li> El tratamiento de los macrófagos derivados de células THP-1 o mBMDM con las OMV. <ol><li> Descongelar las OMV preparadas en el paso 3 y agregarlos en función de su cantidad de proteínas (0,1, 1 y 10 mg / ml) a la macrófagos murinos o humanos. Incubar los macrófagos con las OMV a 37 ° C durante al menos 20 h. Utilice el sobrenadante por ELISA o seguir adelante con el paso 5. </li></ol></li></ol> 5. infectar a los macrófagos y Evaluar la replicación bacteriana con un ensayo de formación de colonias (UFC) <ol><li> Utilice L. pneumophila desde el paso 2.1, pre-tratado células THP-1 o mBMDM de la etapa 4.3, y no los macrófagos pre-tratados como controles (2x10 5/24 pozos). No cambiar el medio. </li><li> Infectar las células THP-1 con L. pneumophila Corby WT y mBMDM con un mutante que carece de flagelina de L. pneumophila Corby (ambos con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 pocillos) y se incuba durante 24 y 48 h, respectivamente. preparar boTH L. pneumophila Corby (WT o flagelina que carece mutante) como se describe en el paso 2.1. </li><li> Lisar las células en su medio de la adición de saponina (concentración final: 0,1%) y se incuba a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Resuspender las bacterias mediante pipeteo y transferir la suspensión a un recipiente de reacción. Preparar diluciones seriadas de la L. pneumophila -Con medios de comunicación en PBS estéril. </li><li> Racha de 50 l de las diluciones requeridas en placas de agar BCYE e incubar durante 3 días a 37 ° C. </li><li> contar visualmente las colonias formadas. Calcular la CFU <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" /> Normalizar el resultado del recuento de UFC no tratados previamente, pero los macrófagos, que se establecen en 100% infectada. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Las OMV de patógenos bacterianos y el impacto de estas vesículas de membrana de sus células diana están actualmente siendo estudiados intensamente. Por ejemplo, Clostridium perfringens -derivado OMVs inducen la secreción de citoquinas en los macrófagos, los linfocitos B pueden ser activadas por las OMV de Borrelia burgdorferi, y Helicobacter pylori -released vesículas de membrana pueden actuar sobre las células epiteliales gástricas 21, 22, 23. L. pneumophila, un patógeno intracelular que puede inducir una forma grave de neumonía atípica, también libera las OMV que son capaces de activar las células y macrófagos 16, 19 epiteliales del pulmón. A continuación, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento a pequeña escala de L. pneumophila las OMV de cultivo líquido para estudiar el papel potencial de las OMV en la neumonía. Es fundamental para trabajar bajo Condit estériliones y descartar la contaminación de otras bacterias con el fin de obtener una L. pneumophila pura -derivado preparación de OMV. El aislamiento de las OMV incluye una etapa de filtración a través de poros de 0,22 micras con el fin de evitar la contaminación de la pastilla OMV obtenido con L. pneumophila, a pesar de que esto reduce el rendimiento de OMV, ya que los más grandes las OMV se pierden por esta etapa de filtración. Por otra parte, hemos probado la respuesta de los macrófagos humanos y murinos a esas vesículas aisladas y células infectadas con L. pneumophila para aproximarse más de cerca la situación en la neumonía por Legionella, donde las OMV son liberados dentro de la LCV por bacterias extracelulares 15. Las dosis empleadas OMV se han estimado de acuerdo con la cantidad libre de OMV en una infección in vitro de macrófagos humanos después de 24 h de incubación (descrito en la referencia 20). Para la estimulación de otras células receptoras o en experimentos in vivo,OMV otras dosis pueden ser necesarios y deben ser establecidos. El análisis del efecto de L. pneumophila VME representa un avance con el protocolo descrito por Jager y Steinert 24. Aquí, PMA-diferencian las células THP-1 sirven como modelo para los macrófagos alveolares debido a la limitada disponibilidad de material humano primario. La adición de PMA diferencia los monocitos las células THP-1 en las células como los macrófagos-25. Además, son una línea celular modelo bien conocido para L. pneumophila estudia 26. Además de esta línea celular de monocitos humanos, se usan células mBMDM. mBMDM son ampliamente aceptados para el estudio de los efectos de L. pneumophila 27, 28, 29. La posibilidad de utilizar nocauts genéticos de diferentes TLRs u otras proteínas en una herramienta valiosa para el estudio de los efectos de OMV hacer. En Order para disminuir la cantidad de ratones por experimento, mBMDM se utilizan en lugar de los macrófagos alveolares debido a las limitaciones de los macrófagos. experimentos clave podrían requerir los macrófagos alveolares para la validación. Además del protocolo descrito en el presente documento de ultracentrifugación para purificar las OMV, es posible llevar a cabo una centrifugación en gradiente de densidad, que se incluye en el protocolo por Chutkan et al. 30. Esto podría mejorar la pureza de la preparación de OMV obtenido y reducir la cantidad de agregados co-purificado de proteínas, flagelina, y LPS. La pureza de la preparación de OMV obtenido puede ser analizado por microscopía electrónica de transmisión o por análisis de seguimiento de nanopartículas como un paso adicional en el control de calidad. Esto puede proporcionar un medio adicional de cuantificación, más allá del procedimiento de medición de proteínas que aquí se presenta. Opcionalmente, la concentración de LPS se puede analizar mediante un ensayo de lisado de amebocitos de limulus. Si el rendimiento es bajo OMV, unaetapa de concentración adicional a través de filtros centrífugos se podría realizar, que no se hace aquí. Si el rendimiento fue menor de lo esperado, se descartaron los OMV. Como parte de los esfuerzos en curso para aclarar los mecanismos biológicos y funciones detrás de las OMV, la influencia de diferentes condiciones de estrés sobre la producción de OMV podría ponerse a prueba. La privación de nutrientes, cambios en la temperatura de incubación, o la exposición a los agentes nocivos podría tener un impacto sobre la secreción de OMV 31. Las posibles condiciones de estrés se discuten en el protocolo por Klimentová y Stulik 32. Por otra parte, los mutantes de L. pneumophila hiper o hypovesiculating se podrían generar. Las diferentes preparaciones de OMV podrían entonces ser analizadas en experimentos de infección con los macrófagos, los explantes de tejido de pulmón humano (descrito en la Referencia 17), o incluso en modelos in vivo. Además del papel de las OMV en la señalización inmune innato, su influencia en la comunicación bacterianase pueden abordar experimentalmente. Además, el impacto de varias cascadas de señalización inmune innata podría ser analizado por el uso de células knockout murinos o la generación de CRISPR knockouts / Cas9 en líneas celulares humanas. Esta investigación básica en las OMV ayudará en el desarrollo de nuevas estrategias vacunales, que ya existen para la meningitis B transmitida por Neisseria meningitidis 33. A partir del protocolo sobre el aislamiento y caracterización de OMV, se puede aplicar esto a otras bacterias Gram-negativas y de otras células huésped; sólo necesita ser ajustado para el crecimiento de las bacterias en un cultivo líquido. El protocolo publicado por Chutkan et al. proporciona información detallada sobre la generación de las OMV de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa 30. La cultura no debe alcanzar la fase estacionaria tardía con el fin de evitar aumentos de bacterias lisadas y las proteínas contaminantes y membranas. Además, la dosis OMV utilizado para la estimulación de las células huésped necesita ser determinado de acuerdo con la cantidad de las OMV durante las infecciones presente in vivo, sin dejar de garantizar una baja tasa de citotoxicidad. De esta manera, el papel patológico de las OMV, su impacto en la comunicación entre las especies, y las interacciones huésped-patógeno podría ser examinada. Para estudiar más a fondo el papel de L. pneumophila las OMV en la neumonía, son necesarias preparaciones estandarizadas de OMV con suficientes rendimientos y la infección experimentos comparables. Este protocolo ayudará a estandarizar los procedimientos de aislamiento y de extender los estudios de OMV a otras bacterias Gram-negativas y a otras células huésped. Además, las investigaciones se beneficiará de la detallada en el conocimiento vitro, que puede ser usado para extender los experimentos en los ajustes in vivo. En el futuro, este protocolo podría ampliarse para el aislamiento de las OMV a partir de material biológico primario, tales como suero o lav broncoalveolarfluido de edad, para profundizar en la composición de las OMV liberada en condiciones fisiológicas. Esto ayudará a determinar los parámetros clave de la composición de OMV y para comprender las propiedades de las OMV -generated in vitro.

<html> Las bacterias pueden secretar factores de virulencia a través de diferentes mecanismos 1. Además de los sistemas de secreción conocidas, las bacterias Gram-negativas pueden intercambiar información y entregar factores de virulencia a través de vesículas de membrana externa (OMV), que son pequeñas, vesículas esferoide 10-300 nm de diámetro y con una estructura de membrana de dos capas. Ellos son secretadas en una variedad de entornos de crecimiento (cultivo líquido, cultivo sólido, y biofilms) y en todas las fases de crecimiento 2, 3. Las OMV son un importante medio de transporte (por ejemplo, para las proteínas, las adhesinas, toxinas y enzimas, así como para el LPS, que se encuentra en la superficie de OMV) 4. La carga intraluminal está protegido de la degradación proteolítica, por lo que es capaz de actuar a largas distancias, y las vesículas se puede encontrar en los fluidos corporales y órganos distantes 5, 6,&quot;xref&quot;&gt; 7, 8. No sólo pueden ser reconocidos y absorbidos por las células eucariotas 9, 10, sino que, además, son capaces de facilitar la unión de las bacterias y su invasión en células huésped 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) es una bacteria Gram-negativa que puede liberar las OMV. En el pulmón humano, infecta principalmente macrófagos alveolares, a pesar de su huésped natural son amebas de agua dulce 11. Una infección de L. pneumophila puede causar la enfermedad del legionario, una forma grave de neumonía 12. Se bloquea la fusión fagosoma-lisosoma en la célula huésped. También recluta a los orgánulos de acogida, mediante el cual un nicho de replicación, la Legionella -Con vacuola (LCV), se forma 13, 14. degradación lisosomal se inhibe no sólo por tra proteínas efectorasnslocation a través del sistema de secreción de tipo IV, pero también por la liberación de las OMV 15. Se requiere que la purificación de las OMV a partir de cultivos bacterianos para analizar su efecto sobre las células receptoras. Estudios anteriores se centraron en el contenido de proteína de L. pneumophila OMVs y en la influencia de las vesículas en las células epiteliales alveolares 16, pero estudios posteriores con los trasplantes de tejido pulmonar humano demostraron que L. pneumophila OMVs son absorbidos por los macrófagos alveolares 17. A medida que los patrones actuales de OMV asociados a patógenos (PAMPs moleculares) y otros antígenos bacterianos, que podrían tener un impacto en la infección de células eucariotas y modular la respuesta inmune del huésped 18. L. pneumophila las OMV se fusionan rápidamente con las membranas de la célula huésped y, por otra parte, activan la membranosa TLR2 19. Como se sabe que L. pneumophila las OMV estimulan los macrófagos y las células epiteliales de una manera pro-inflamatoria 16, 17, analizamos el impacto de las OMV en el proceso de infección en los macrófagos humanos y murinos. A continuación, se describe un protocolo para el cultivo de L. pneumophila en cultivo líquido para aislar los OMV secretadas por ultracentrifugación diferencial y para evaluar el impacto de las vesículas en las células huésped eucariotas, ya sea directamente o después de una infección.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de 70 Ti</td><td>Beckman Coulter Incorporated (California, EE. UU.)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>carbón activado</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar, Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>Agar Columbia con 5% de sangre de oveja</td><td>Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemania)</td><td>254005</td><td></td></tr><tr><td>cubetas</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (humano)</td><td>BD OptEIA&trade;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemania)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (murino)</td><td>DuoSet, R& D (Minneapolis, EE. UU.)</td> <td>CXCL1: DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i Incubadora de CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Circuito de inoculación&nbsp;</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td><td>amablemente proporcionado por la Prof. Dra. Antje Flieger (RKI, Berlín, Alemania)</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby & Delta; flaA</td><td>------</td><td></td><td>amablemente proporcionado por el Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlín, Alemania)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mBMDM</td><td>------</td><td></td><td>amablemente proporcionado por el Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Alemania) y el Prof. Dr. Carsten Kirschning (Universidad de Duisburg Essen, Essen, Alemania)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlín, Alemania)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>forbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>agitador giratorio (MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 alta glucosa</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponina</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>filtro estéril (tamaño de poro: 0,22 y micro; m)</td><td>Corning Incorporated (Nueva York, EE. UU.)</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Las bacterias son capaces de secretar una variedad de moléculas a través de varios sistemas secretores. Además de la secreción de moléculas en el espacio extracelular o directamente en otra célula, las bacterias gramnegativas también pueden formar vesículas de membrana externa (OMV). Estas vesículas de membrana pueden entregar su carga a largas distancias, y la carga está protegida de la degradación por proteasas y nucleasas. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) es un patógeno intracelular Gramnegativo que causa una forma grave de neumonía. En los seres humanos, infecta a los macrófagos alveolares, donde bloquea la degradación lisosomal y forma una vacuola de replicación especializada. Además, L. pneumophila produce OMV en diversas condiciones de crecimiento. Para comprender el papel de los OMV en el proceso de infección de los macrófagos humanos, establecimos un protocolo para purificar vesículas de membrana bacteriana a partir de cultivo líquido. El método se basa en la ultracentrifugación diferencial. Posteriormente, los OMV enriquecidos se analizaron con respecto a su cantidad de proteínas y lipopolisacáridos (LPS) y luego se utilizaron para el tratamiento de una línea celular monocítica humana o macrófagos derivados de la médula ósea murina. Las respuestas proinflamatorias de esas células se analizaron mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Además, se analizaron las alteraciones en una infección posterior. Para ello, se estudió la replicación bacteriana de L. pneumophila en macrófagos mediante ensayos unitarios formadores de colonias. 
Aquí, describimos un protocolo detallado para la purificación de OMVs de L. pneumophila a partir de cultivo líquido por ultracentrifugación y para el análisis posterior de su potencial proinflamatorio en macrófagos.

El montaje experimental para preparar L. pneumophila las OMV y analizar su influencia en la respuesta pro-inflamatoria de los macrófagos después de la infección se representa en la figura 1. El potencial pro-inflamatoria de las OMV preparadas puede ser analizada en células THP-1 diferenciadas con PMA, que se muestra en la Figura 2. THP-1 células responden con un aumento del tiempo y dependiente de la dosis de IL-8 e IL-6 secreción. Además, la influencia de diferentes TLRs sobre el reconocimiento L. pneumophila OMV se puede analizar mediante el uso de mBMDM de diferentes orígenes genéticos, tal como se presenta por el CXCL1 ELISA en la Figura 3. mBMDM de ratones WT secretadas CXCL1 después de la estimulación OMV, mientras que mBMDM TLR2 / 4 - / - secretada significativamente menor. Para estudiar el impacto de L. pneumophila las OMV en la replicación bacteriana en macrófagos THP-1, las células fueron pre-incubadas con las OMV y luego infectados, además,con L. pneumophila (Figura 4 A). El pre-estimulación de los macrófagos derivados de células THP-1 reduce en primer lugar la replicación bacteriana después de 24 h de infección, pero conduce a una duplicación en UFC cuenta en el instante más tarde (48 h pi). El impacto de receptor Toll-like (TLR) de señalización en el reconocimiento OMV después de la infección de los macrófagos puede ser evaluada por mBMDM, tal como se presenta en la Figura 4 B. Bacterianos de replicación se incrementa en diez veces en mBMDM de animales WT después de OMV pre-incubación, mientras que TLR2 - / - y TRIF / MyD88 - / - células no muestran este incremento en la replicación de L. pneumophila. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> Figura 1: Procedimiento experimental. (A) L. pneumophila Corby WT de 10-cm BCYE placas de agar se usan para inocular un pequeño cultivo líquido (10 ml), que se transfiere en 90 ml de YEB frescomedio después de 6 h. Un pequeño volumen también se sembró en una placa de agar sangre para comprobar la pureza. Las bacterias se incubaron a 37 ° C hasta la fase estacionaria temprana (OD 600 = 3,0 a 3,5). (B) El cultivo líquido se centrifuga y esterilizada por filtración para eliminar las bacterias. El sobrenadante exento de Legionella se ultracentrifugó a continuación, para obtener un pellet OMV, que se volvió a suspender en PBS y se ultracentrifuga de nuevo. Las vesículas aisladas se volvieron a suspender, comprobado por la pureza, y cuantificados por la cantidad de proteínas. La barra de escala representa 2,5 cm. (C) los macrófagos humano o murino se estimulan con las OMV cuantificados. El sobrenadante del cultivo celular se puede utilizar para ELISA, o macrófagos pueden ser infectados con L. pneumophila para determinar la replicación bacteriana mediante ensayo de CFU en 10 cm-BCYE placas de agar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> Figura 2: activación de pro-inflamatoria de las células THP-1 por L. pneumophila las OMV. (A) Aquí, la línea celular THP-1 monocítica se utiliza como un modelo para los macrófagos alveolares. Células diferenciadas con PMA THP-1 se trataron con dosis crecientes de L. pneumophila OMV (0,01 a 25 mg / ml) durante 24 y 48 h, respectivamente. El sobrenadante libre de células se utilizó para IL-8 ELISA. Se muestran los valores medios de tres experimentos independientes ± SEM. THP-1 células respondieron a tan poco como 0,01 g / ml L. pneumophila las OMV con significativa IL-8 secreción, que era tiempo y dependiente de la dosis. (B) L. pneumophila OMV (0,1 a 10 mg / ml) se usaron para estimular las células THP-1 diferenciadas con PMA. El sobrenadante se recogió después de 24 y 48 h de incubación, y los liberados IL-6 se midió en el sobrenadante mediante ELISA. Se muestran los valores medios de tres experimentos independientes ± SEM. THP-1 células secretadas cantidades significativas de IL-6, incluso con la dosis más baja de las OMV (0,1 mg / ml). La secreción de IL-6 aumentó con dosis crecientes de OMV y con tiempos de incubación prolongados. Estadística: prueba de Mann-Whitney; * P &lt;0,05 y ** p &lt;0,01 en comparación con el correspondiente 0 mg / ml OMV. Reproducido con permiso de Referencia 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> Figura 3: La activación pro-inflamatoria de los macrófagos depende de TLR2 / 4. mBMDM de WT y TLR2 / 4 - / - ratones se incubaron con L. pneumophila OMV (0,1 o 1 mg / ml). la secreción de CXCL1 se analizó por ELISA después de 24 y 48 h, respectivamente. losSe muestran los valores medios ± SEM de tres experimentos independientes. mBMDM de ratones WT respondió con una secreción CXCL1 dependiente de la dosis después de L. pneumophila OMV incubación. TLR2 / 4 - / - mBMDM secretadas significativamente menor en comparación con WT CXCL1 mBMDM, y esta secreción no aumentó de forma dependiente de la dosis. Estadística: prueba de Mann-Whitney; * P &lt;0,05 en comparación con el 0 mg / ml correspondiente OMV; #p &lt;0,05 en comparación con una muestra WT igualmente tratada. Reproducido con permiso de Referencia 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> Figura 4: replicación de L. pneumophila OMV pre-incubación aumenta bacteriana en macrófagos. (A) diferenciada THP-1 células se pre-incubó con las OMV (0,1, 1, o 10 μ; G / ml) o LPS / IFN-γ (200 ng / ml de cada uno) o se dejaron sin tratar para el control. Después de pre-incubación (20 h), las células THP-1 fueron infectadas con L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) durante 2, 24, y 48 h, respectivamente. THP-1 células fueron lisadas por la adición de saponina, y las bacterias se sembraron en placas de agar BCYE. UFC se calcula en relación a 0 mg / ml OMV después de cada punto de tiempo. Las barras representan los valores medios ± SEM de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado técnicas. No hubo diferencias en la absorción bacteriana (2 h post-infección (pi)) en comparación con células no pre-tratadas. Las alteraciones en la replicación bacteriana se determinaron después de 24 y 48 h, respectivamente. LPS / células THP-1 pretratadas IFN-γ mostraron una reducción en la carga bacteriana 24 h pi Esto también se observó de forma dependiente de la dosis para las células pretratadas L. pneumophila OMV. En el punto de tiempo más tarde (48 h pi), las células THP-1 OMV pre-tratados mostraron una duplicación en L. pneumophila replicatura, mientras que LPS / IFN-gamma macrófagos pre-tratados mostraron una reducción adicional de la carga bacteriana. Estadística: prueba de Mann-Whitney; * P &lt;0,05 y ** p &lt;0,01 en comparación con el correspondiente 0 mg / ml OMV. (B) mBMDM de ratones con diferentes fondos genéticos (WT, TLR2 - / -, y TRIF / MyD88 - / -) se pre-incubó con 0,1 mg / ml L. pneumophila OMV para 20 h y luego se infecta con un flagellin- mutante deficiente de L. pneumophila Corby (MOI 0,5) durante 48 h. mBMDM se lisaron por la adición de saponina, y la Legionella se sembraron en placas de agar BCYE. La CFU se calcularon en relación a 0 g / ml de OMV, indicado por la línea sólida. Las barras representan los valores medios ±± SEM de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. mBMDM de ratones WT mostró un aumento en la replicación de L. pneumophila después de OMV pre-tratamiento. TLR2 - / - macrófagos mostraron una reducción significativa <em&gt; Replicación Legionella, que era comparable a TRIF / MyD88 - / - mBMDM. Estadística: prueba de Mann-Whitney; p &lt;0,05 en comparación con la muestra de WT. Reproducido con permiso de Referencia 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

A continuación, se describe la purificación de Legionella pneumophila (L. pneumophila) vesículas de membrana externa (OMV) a partir de cultivos líquidos. Estas vesículas purificadas se usan después para el tratamiento de los macrófagos para analizar su potencial pro-inflamatoria.

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

El objetivo general de este estudio es purificar de manera estandarizada vesículas de la membrana externa o OMV de Legionella pneumophila y analizar su influencia en la replicación bacteriana en macrófagos humanos y murinos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de vesículas de la membrana externa. Por ejemplo, el procedimiento estandarizado para la preparación de OMV puede ayudar a estudiar su impacto en la interacción huésped-patógeno.La principal ventaja de esta técnica es que proporcionará un protocolo estandarizado para estudiar el impacto de las OMV de Legionella pneumophila en macrófagos humanos o murinos, lo cual mejorará nuestra comprensión de la patogenicidad de Legionella pneumophila. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando consideramos el posible potencial proinflamatorio de las OMV y cómo esto podría influir en la evolución de la infección, dado que las OMV son liberadas por Legionella tanto dentro de la célula huésped como extracelularmente. El procedimiento será demostrado por Kerstin Hoffmann, una técnica de mi laboratorio, y Analina Young, una investigadora posdoctoral.Para comenzar, mientras se trabaja en condiciones estériles, siembre la cepa core B de L.pneumophila en placas de agar BCYE e incube a 37 grados Celsius durante tres días. Utilice L.pneumophila de una placa de precultivo para inocular 10 mililitros de medio YEB con una DO600 de 0,3 e incube las bacterias a 37 grados Celsius en un agitador rotatorio durante seis horas. Verifique la pureza del cultivo líquido sembrando 100 microlitros de la suspensión en una placa de agar sangre.Incubar la placa de agar sangre durante la noche a 37 grados Celsius. Añadir el cultivo líquido restante a 90 mililitros de medio YEB fresco e incubar el cultivo en un agitador rotatorio hasta que alcance una DO600 de 3,0 a 3,5. Centrifugar el cultivo líquido a 4.000 g durante 20 minutos para obtener el sedimento bacteriano.Luego, transfiera el sobrenadante a tubos c&oacute;nicos nuevos. Deseche los pellet bacterianos y centrifugue las muestras nuevamente antes de repetir el paso de centrifugaci&oacute;n una vez m&aacute;s. A continuaci&oacute;n, filtre y esterilice el sobrenadante restante dos veces.Luego, transfiera el sobrenadante libre de bacterias a tubos para ultracentrífuga y centrifugue las muestras a 100.000 g durante tres horas a cuatro grados Celsius. Decante el sobrenadante y deséchelo. A continuación, use PBS estéril para resuspender los pellet de VOM y reúnalos.Repita el paso de ultracentrifugación para eliminar proteínas contaminantes y LPS libre. Ahora, deseche el sobrenadante y seque el tubo de ultracentrifugación con un hisopo estéril. Reuspenda el precipitado de OMV con 500 microlitros de PBS estéril.Luego, siembre 20 microlitros en cada placa de agar sangre y agar BCYE para descartar la contaminación bacteriana de la vesícula preparada. Incube la placa de agar sangre durante la noche y la placa de agar BCYE durante tres días. Utilice el ensayo BCYE según las instrucciones del fabricante para cuantificar la cantidad de proteína en la preparación obtenida de OMV.Después de diferenciar las células THP-1 en macrófagos según el protocolo descrito, use 500 microlitros de medio fresco para reemplazar el medio de diferenciación e incube las células durante otras 24 horas a 37 grados Celsius. Para tratar las células THP-1 o los macrófagos derivados de médula ósea murinos (BMDM) con OMVs, descongele las OMVs previamente preparadas y añada la cantidad adecuada a las células. Incube los macrófagos con las OMVs a 37 grados Celsius durante al menos 20 horas para infectar células THP-1 previamente tratadas o no tratadas con la cepa salvaje B del núcleo de L.pneumophila o células BMDM murinas con una mutante deficiente en flagelos de esta cepa, sin cambiar el medio de las células.Añada bacterias a una MOI de 0,5, lo que equivale a una vez 10 a la quinta L. pneumophila por pocillo. Incube los cultivos durante 24 y 48 horas, respectivamente. Para lisar las células, añada esaponina a una concentración final de 0,1% e incube las células durante cinco minutos.Luego, resuspenda los macrófagos lisados mediante pipeteo y transfiera la suspensión a un recipiente de reacción. Utilice PBS estéril para preparar diluciones seriadas de la suspensión de L.pneumophila. A continuación, estría 50 microlitros de las diluciones requeridas en placas de agar BCYE e incube las placas durante tres días.Cuente visualmente las colonias formadas a simple vista y realice los cálculos según el protocolo descrito en el texto. En este experimento, al examinar el potencial proinflamatorio de las OMV de L.pneumophila, las células THP-1 diferenciadas con PMA responden con un aumento dependiente del tiempo y de la dosis en la secreción de IL-8 e IL-6. Aquí, se analizó la influencia de diferentes receptores tipo toll en el reconocimiento de las OMV de L.pneumophila en macrófagos derivados de médula ósea murinos (BMDM) con distintos fondos genéticos, utilizando un ensayo de ELISA para CXCL-1.Los MDMB murinos de ratones silvestres secretaron CXCL-1 tras la estimulación con OMV, mientras que los MDMB murinos de ratones con doble knockout de TLR2/4 secretaron significativamente menos. Para estudiar el impacto de las OMV de L. pneumophila en la replicación bacteriana en macrófagos THP-1, las células se preincubaron con OMV durante 20 horas y luego se infectaron adicionalmente con L. pneumophila. La preestimulación de los macrófagos derivados de THP-1 reduce primero la replicación bacteriana de manera dependiente de la dosis tras 24 horas de infección, mientras que conduce a un duplicado en el recuento de UFC en el punto temporal posterior.Como se muestra en este experimento, la preestimulación de MDM-B murinos con OMV provoca un aumento de diez veces en el recuento de UFC en MDM-B murinos procedentes de animales silvestres, mientras que los macrófagos deficientes en TLR2 y TRIF/MyD88 no muestran este aumento en la replicación de L. pneumophila tras la preincubación con OMV. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar en condiciones estériles y verificar la contaminación bacteriana de las OMV purificadas. De lo contrario, el análisis posterior no proporciona resultados concluyentes.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de seguimiento de nanopartículas para responder preguntas adicionales, como qué mutante de Legionella produce más o menos OMV, o para investigar el impacto de diferentes condiciones de estrés en la secreción de OMV. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de OMV exploraran el impacto de las OMV en las interacciones huésped-patógeno in vitro y posteriormente in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar OMV y de cómo comenzar a analizar su efecto en la infección subsiguiente de macrófagos.Este protocolo puede aplicarse luego a diferentes bacterias gramnegativas y a sus células huésped respectivas tras adaptar los tiempos de incubación y crecimiento. No olvide que trabajar con Legionella pneumophila puede ser extremadamente infeccioso para los seres humanos, por lo que siempre se debe trabajar bajo una cabina de flujo laminar al manipular Legionella y realizar este procedimiento.

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Inmunología e Infección

Este artículo describe un método para el aislamiento y purificación de...

La purificación del patógeno a partir de vacuolas<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados por fagocitos

Fuente: Jung, A. L. et. al., Vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila: aislamiento y análisis de su potencial proinflamatorio en macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra el pretratamiento de macrófagos con vesículas de membrana externa (OMV) de Legionella pneumophila para examinar su efecto sobre la replicación bacteriana. Al alterar la señalización inmune del huésped, los OMV hacen que los macrófagos sean más permisivos a la infección. Los recuentos de colonias más...

Ensayo de replicación de Legionella pneumophila en macrófagos pretratados con vesículas de membrana externa

Fuente: Jung, A. L., et al. Vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila: aislamiento y análisis de su potencial proinflamatorio en macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra el aislamiento de vesículas de membrana externa (OMVs) de Legionella pneumophila mediante centrifugación secuencial, filtración estéril y ultracentrifugación. Los OMVs purificados, enriquecidos en proteínas de membrana y lipopolisacáridos, son adecuados para estudios de interacción huésped-patógeno.

Aislamiento basado en ultracentrifugación de vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila

En este video, cuantificamos Listeria monocytogenes intracelular y extracelular, una bacteria patógena intracelular, después de su infección de macrófagos cultivados in vitro mediante citometría de flujo.

Análisis por citometría de flujo de Listeria monocytogenes intracelular y extracelular emergente in vitro

Esta técnica proporciona un método para cosechar, normalizar y cuantificar el crecimiento intracelular de las bacterias patógenas que son pre-cultivadas en células naturales protozoos anfitrionas antes de las infecciones de las células de mamíferos. Este método puede ser modificado para acomodar una amplia variedad de células huésped para la fase de cebado así como los tipos de células diana.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

La larva de la polilla de la cera Galleria mellonella se creó recientemente como un modelo in vivo para estudiar la infección por Legionella pneumophila. Este sentido, demostrar las técnicas fundamentales para caracterizar la patogénesis de la Legionella en las larvas, incluyendo la inoculación, la medición de la virulencia bacteriana y la replicación, así como la extracción y el análisis de hemocitos infectados.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Se describen dos ensayos de infección in vitro e in vivo que pueden utilizarse para analizar las actividades de codificación de host factores.

Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

El protocolo propuesto incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente.

Aislamiento de vesículas extracelulares de bajo contenido de endotoxinas derivadas de líneas celulares cancerosas

Aprende a purificar vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila y analizar su potencial proinflamatorio en macrófagos humanos y murinos. Este protocolo estandarizado mejora la comprensión de la patogenicidad bacteriana.

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos (Video) | JoVE Journal

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

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